超聲波結(jié)合聚乙二醇化多西他賽白蛋白納米粒治療小鼠乳腺癌模型的研究

陳蘭 陰美嬌 權(quán)修權(quán) 金光明

目前，乳腺癌是中國(guó)女性發(fā)病率最高的癌癥，在癌癥死亡原因位居第6［1］。每年中國(guó)乳腺癌新發(fā)數(shù)量和死亡數(shù)量分別占全世界的12.2% 和9.6%［2］。一項(xiàng)研究［3］發(fā)現(xiàn)，82.1% 的女性發(fā)現(xiàn)患乳腺癌時(shí)，其癥狀已經(jīng)十分明顯，近2/3 的患者被診斷為晚期?，F(xiàn)階段乳腺癌的治療主要為手術(shù)輔助化療，但是，由于化療藥物的一些毒副作用，約12.1%的患者只能接受不到4 個(gè)周期的治療［4］，這遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于國(guó)際推薦的最低標(biāo)準(zhǔn)。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）化多西他賽白蛋白納米粒（PEGDANPs）可有效地治療非小細(xì)胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）并具有較小的毒副作用［5-7］，但化療藥物在正常組織中仍有分布，導(dǎo)致了抗癌藥物靶向性不足［8］，因此如何進(jìn)一步提升藥物的靶向性仍是需要繼續(xù)研究的方向。

研究表明超聲波（ultrasound，US）可以促進(jìn)納米制劑治療腫瘤，提升治療效果［9-10］，據(jù)此本研究利用超聲波結(jié)合前期制備的納米制劑對(duì)小鼠的乳腺癌模型進(jìn)行治療，旨在進(jìn)一步提升藥物療效，這也是本研究的最大創(chuàng)新性所在，希望能夠?yàn)榕R床治療乳腺癌提供一種新的思路。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和細(xì)胞株BALB/c 小鼠（北京維通利華公司）；乳腺癌4T1 細(xì)胞系（延邊大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供）。實(shí)驗(yàn)用BALB/c 小鼠共20 只由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證編號(hào)為SCXK（京）2016-0006，使用許可證編號(hào)為SYXK（京）2014-0023，潔凈級(jí)別SPF 級(jí)。在延邊大學(xué)醫(yī)院中心試驗(yàn)室SPF 級(jí)別動(dòng)物房飼養(yǎng)（實(shí)驗(yàn)單位使用許可證編號(hào)：B10011020），所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與操作均遵守延邊大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和保護(hù)條例，實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守倫理3R 原則，倫理審查報(bào)告審批號(hào)：IACUC-201902022-05。

1.2 儀器與試劑DANPs（自制），PEG-DANPs（自制），胎牛血清、胰蛋白酶、杜爾伯科極限必需培養(yǎng)基（dulbecco minimum essential medium，DMEM）、磷酸緩沖液（hosphate buffered saline，PBS）均購(gòu)自朗潤(rùn)科技有限公司。NANO DEBEE45-1 乳均機(jī)（美國(guó)NANO 公司），DZF-200 型真空干燥箱（上海浦東榮豐公司），IKA MS3（英國(guó)Malvern 公司），Agilent Tech 1200 系列高效液相色譜、V-999H 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、Spectra Max190 酶標(biāo)儀（美國(guó)Agilent公司），HERA Cell 150 細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)HERA公司），Thermo micro max 高速離心機(jī)（日本Hitachi公司）。

1.3 方法

1.3.1 乳腺癌皮下移植瘤模型建立將Matricgel提前一天放到-4 ℃冰箱中使之變成液體；以胰酶消化4T1細(xì)胞，加PBS終止反應(yīng)，混勻使之形成單細(xì)胞懸液，1 500 r/min 條件下離心5 min。將細(xì)胞濃度調(diào)整為1 × 105個(gè)/mL，細(xì)胞和Matricgel 1∶1 混合準(zhǔn)備注射。BALB/c小鼠20只，分為4組，每組5只，每只在左前腿側(cè)面（腋窩下）注射0.1 mL（約3 ×106個(gè)細(xì)胞），形成腫瘤皮下模型。

1.3.2 治療方法將皮下移植瘤模型20只分為4組，當(dāng)皮下腫瘤體積約達(dá)到120 mm3時(shí)，以5% 葡萄糖注射液（對(duì)照組），DANPs、PEG-DANPs 及US+PEGDANPs 進(jìn)行治療，藥物劑量為20 mg/kg，每7 天為一療程，共4 個(gè)療程，超聲照射條件為每次30 s，強(qiáng)度為1 MHz。在最后一次給藥治療48 h 后，處死全部小鼠，取瘤塊及易轉(zhuǎn)移臟器，10%中性甲醛固定，送檢HE 染色切片檢測(cè)。

1.3.3 給藥小鼠瘤塊、肺及肝組織病理圖半定量分析結(jié)合圖像分析系統(tǒng)對(duì)以下指標(biāo)進(jìn)行半定量評(píng)分：癌細(xì)胞核染色深度、核形態(tài)、異型性、癌細(xì)胞排列形狀、肺泡內(nèi)癌栓形成狀況、肝組織內(nèi)癌巢形成狀況、纖維組織增生情況、組織出血情況、癌細(xì)胞變性壞死情況。其中每項(xiàng)指標(biāo)評(píng)分為0 分（正常）～3 分（異常）［11］，以圖像分析系統(tǒng)軟件進(jìn)行分析。

1.3.4 TUNEL 法檢測(cè)NSCLC 皮下移植瘤小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡小鼠處死后，將瘤塊進(jìn)行石蠟切片，分別以二甲苯、梯度乙醇（100%、95%、90%、80%、70%）和PBS 進(jìn)行脫蠟、水化；加3%H2O2去離子水，室溫孵育5 min，封閉切片；擦去多余的PBS，滴加50 μL PBS 配制的Proteinase K，確保覆蓋所有細(xì)胞，裝入濕盒，37 ℃恒溫孵育20 min 準(zhǔn)備進(jìn)行Tunel 反應(yīng)；按試劑盒說明書，配置好標(biāo)記反應(yīng)混合物，實(shí)驗(yàn)組滴加50 μL Tunel 標(biāo)記反應(yīng)混合物，陰性對(duì)照組滴入dUTP，代替Tunel 反應(yīng)混合物，陽(yáng)性對(duì)照組在滴加Tunel 標(biāo)記反應(yīng)混合物之前，需先經(jīng)DNase 處理，避光孵育1 h；每片加50 μL 轉(zhuǎn)化劑POD，放入濕盒，避光反應(yīng)30 min 進(jìn)行POD 轉(zhuǎn)化；每片加入新鮮配制的DAB 工作液50 μL，室溫下反應(yīng)，直至鏡下可以判斷棕色深淺，加入PBS 終止顯色，蘇木復(fù)染幾秒后立即沖洗、脫水、封片。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料的正態(tài)性檢驗(yàn)采用Kolmogorov-Smirnov 檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的兩組間差異采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間均值差異采用方差分析檢驗(yàn)，兩兩多重比較采用了Bonferroni 方法；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠瘤塊體積與各種治療方法的關(guān)系DANPs、PEG-DANPs 及US+PEG-DANPs 組均對(duì)腫瘤都具有一定的抑制作用，US+PEG-DANPs 抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用最強(qiáng)。見圖1。

2.2 小鼠體質(zhì)量與各種治療方法的關(guān)系DANPs、PEG-DANPs 及US+PEG-DANPs 組小鼠的體質(zhì)量均有不同程度的下降，說明3 種療法在一定程度上都造成了機(jī)體損傷，但其中US+PEG-DANPs 的毒性最?。≒＜0.05）。見圖2。

2.3 移植瘤瘤塊與各種治療方法的關(guān)系根據(jù)乳腺癌瘤塊病理（圖3）顯示：對(duì)照組光鏡下可見癌細(xì)胞核深藍(lán)色、異型性明顯，呈腔狀或?qū)嶓w狀；DANPs組：癌細(xì)胞核顏色淡藍(lán)色，仍可見病理性核分裂相；PEG-DANPs 組：可見癌細(xì)胞壞死，病理分裂相明顯減少；US+PEG-DANPs 組：癌細(xì)胞核呈紅色，癌細(xì)胞大片狀壞死。提示US+PEG-DANPs 抑制乳腺癌移植瘤效果最佳。

圖1 各組藥物及制劑治療乳腺癌小鼠瘤體體積變化Fig.1 Changes of tumor volume in mice with breast cancer treated by drugs and preparations in each group

2.4 肺組織病理與各種治療方法的關(guān)系乳腺癌模型的肺組織病理圖（圖4），對(duì)照組肺泡內(nèi)可見巨大的癌栓，癌細(xì)胞異型性明顯；DANPs 組：肺泡內(nèi)癌栓，較對(duì)照組明顯變??；PEG-DANPs 組：該組肺泡內(nèi)無癌栓，細(xì)胞核染色明顯變淡；US+EG-DANPs組：肺泡內(nèi)僅可見纖維組織廣泛增生。提示US+PEG-DANPs 能夠更好地抑制乳腺癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移。

圖2 各組藥物及制劑治療乳腺癌小鼠體質(zhì)量變化Fig.2 Weight changes of mice in each group treated with drugs and preparations

2.5 肝組織病理與各種治療方法的關(guān)系乳腺癌模型的肝組織病理圖（圖5），對(duì)照組可見肝組織內(nèi)存在癌巢，形態(tài)巨大，癌細(xì)胞核深染、變形，異型性顯著；DANPs 組：肝組織內(nèi)仍可見多處癌巢，但癌巢體積減小；PEG-DANPs 組：癌巢明顯縮小，可見少量病理性核分裂相；US+PEG-DANPs 組：該組肝組織細(xì)胞核趨近于正常的紅色，無明顯核分裂相。提示US+PEG-DANPs 組具有良好的抑制乳腺癌細(xì)胞肝轉(zhuǎn)移的作用。

2.6 小鼠肺組織和肝組織病理圖半定量分析從給藥小鼠肺、肝組織上各隨機(jī)選取15 個(gè)切面，按照評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量評(píng)分，結(jié)果顯示，US+PEG-DANPs 組病理評(píng)分值為（27.38± 5.55），與其他組相比，差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r= 0.527，P＜0.05），提示US+ PEG-DANPs 抗瘤、抗轉(zhuǎn)移療效更好（表1）。

圖3 小鼠乳腺癌皮下移植瘤鏡下病理圖（HE 染色，×500）Fig.3 Microscopical pathology of subcutaneous transplantation of mouse breast cancer

圖4 小鼠乳腺癌肺轉(zhuǎn)移鏡下病理圖（HE 染色，×500）Fig.4 Histopathology of lung metastasis in mice with breast cancer

圖5 小鼠乳腺癌肝轉(zhuǎn)移鏡下病理圖（HE 染色，×500）Fig.5 Histopathology of liver metastasis of mouse breast cancer

表1 小鼠乳腺癌模型瘤塊、肺、肝組織病理評(píng)分比較Tab.1 Comparison of pathological scores of tumor mass,lung and liver in mice breast cancer model ±s

表1 小鼠乳腺癌模型瘤塊、肺、肝組織病理評(píng)分比較Tab.1 Comparison of pathological scores of tumor mass,lung and liver in mice breast cancer model ±s

注：*P ＜0.05

組別對(duì)照組DANPs PEG-DANPs US+PEG-DANPs瘤塊切面例數(shù)15 15 15 15肺切面例數(shù)15 15 15 15肝切面例數(shù)15 15 15 15病理評(píng)分65.10±9.85 45.15±10.66 34.65±7.97 27.38±5.55*

2.7 TUNEL 法檢測(cè)小鼠皮下移植瘤腫瘤細(xì)胞凋亡情況光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組幾乎不存在凋亡細(xì)胞（細(xì)胞核顯棕黃色），細(xì)胞呈藍(lán)色且排列緊密；DANPs 組細(xì)胞體積較對(duì)照縮小，排列較緊密；PEG-DANPs 組細(xì)胞體積進(jìn)一步縮小，排列疏松，呈淡染的棕色；US+PEG-DANPs 組視野內(nèi)可見大量凋亡細(xì)胞，其體積縮小、排列疏松，染色質(zhì)濃縮，呈顯著的棕黃色，偶可見凋亡小體的存在，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果如圖6。

圖6 TUNEL 法檢測(cè)不同治療方法4T1 細(xì)胞凋亡（HE 染色，×500）Fig.6 Apoptosis of 4T1 cells detected by tunel

3 討論

本研究使用的PEG-DANPs 避免了被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)所吞噬，轉(zhuǎn)變成為了一種類似于“隱形的”納米粒，再加上其半衰期的明顯延長(zhǎng)［12］，可以長(zhǎng)時(shí)間在機(jī)體內(nèi)循環(huán)，使其到達(dá)腫瘤細(xì)胞和被腫瘤細(xì)胞所吸收的量得到了明顯的提升［13］。PEG-DANPs 中的主要藥物成分是多西他賽（docetaxel，DTX），當(dāng)其通過胞吞（clathrin-mediated endocytosis）方式進(jìn)入癌細(xì)胞后［14］，可與細(xì)胞內(nèi)游離的微管蛋白相結(jié)合，通過破壞微管的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)［15-16］；另一方面，其干擾了腫瘤細(xì)胞分裂所必需的微管網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，導(dǎo)致細(xì)胞分裂受阻進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞［17-18］。

US 可以促進(jìn)納米制劑治療腫瘤，提升治療效果，其具體原理主要是根據(jù)US 的空化及彌散作用來實(shí)現(xiàn)的。空化作用是指超聲照射腫瘤時(shí)，腫瘤血管內(nèi)的液體在減壓作用形成的負(fù)壓區(qū)產(chǎn)生大量真空微氣泡，而當(dāng)轉(zhuǎn)換成增壓作用時(shí)，這些真空微起氣泡受壓破裂，瞬間形成超過上千個(gè)大氣壓的沖擊力，這種沖擊力從物理方面可直接將藥物制劑推入癌細(xì)胞的分子間隙，從而進(jìn)入癌細(xì)胞內(nèi)部發(fā)揮抗癌作用［19］；另一方面，在化學(xué)角度上，空化作用可使細(xì)胞膜對(duì)鉀、鈣離子的通透性增加，引起細(xì)胞膜彌散過程和細(xì)胞代謝增快，使藥物制劑進(jìn)入癌細(xì)胞的數(shù)量更多、速度更快［20］。

本研究發(fā)現(xiàn)US 結(jié)合藥物組在HE 染色中基本沒有發(fā)現(xiàn)癌巢和癌栓的存在，分析這是由于US 另外一個(gè)重要作用引起的，即彌散作用［21］。在本實(shí)驗(yàn)中使用的高頻探頭所產(chǎn)生的超聲波是以直線傳播的，其聲束是以探頭為底而向組織深處延伸的圓柱體，因此它可以有效地照射腫物而不是向周邊正常的組織擴(kuò)散，因此對(duì)周邊正常組織的損害也會(huì)更加減少。對(duì)于在肺泡中的癌栓，肝組織中的癌巢這些深處的病灶來說，超聲波能夠通過改善腫瘤血液和淋巴液循環(huán)，提升新陳代謝，來促進(jìn)藥物制劑導(dǎo)入到這些深層結(jié)構(gòu)中［22］。這也是本課題組前期研究及國(guó)外其他學(xué)者的研究中沒有做到的［6-7，23］，通過本研究的結(jié)果，證實(shí)了US 對(duì)抗癌納米制劑的促進(jìn)作用。另外，由超聲波照射附帶產(chǎn)生的熱作用也可以使腫物組織局部血液循環(huán)加快，新陳代謝加速，提升癌細(xì)胞對(duì)抗癌藥物的吸收［24］。有學(xué)者利用超聲波結(jié)合化療藥物納米制劑對(duì)其他一些腫瘤進(jìn)行了輔助治療，取得了較為滿意的效果［25］，這也進(jìn)一步對(duì)本研究進(jìn)行了佐證。

綜上所述，以US 照射結(jié)合PEG-DANPs 對(duì)乳腺癌的治療方式，可以為無法接受手術(shù)的晚期乳腺癌患者提供一種新的選擇。然而，有關(guān)于超聲照射最佳的頻率及時(shí)間仍是需要進(jìn)一步研究的要點(diǎn)。