炎癥因子和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在骨搬移治療大鼠感染性骨缺損中的變化情況

韋壽鋒 張傳陽 張瓊 郭彥德 白亦光 曾高峰 宗少暉

大量臨床研究［1-3］表明，骨搬移在治療糖尿病足中可以促進(jìn)血管再生，但其作用機(jī)制未明。糖尿病足是一種嚴(yán)重的骨科疾病，常因處理不當(dāng)而引起感染性骨缺損，是骨科治療的難題之一［4］。感染性骨缺損臨床上的不易愈合，不僅給患者帶來了肢體上的疼痛而且造成了生存質(zhì)量的下降，因此采取合適的治療技術(shù)來縮短感染性骨缺損的愈合時(shí)間、減輕患者的痛苦十分關(guān)鍵［5-6］。目前治療骨缺損的技術(shù)包括骨搬移技術(shù)、骨移植技術(shù)、髓內(nèi)釘系統(tǒng)骨延長(zhǎng)技術(shù)和組織工程技術(shù)等，而骨搬移技術(shù)是臨床上治療感染性骨缺損的有效手段之一［7-8］。炎癥因子是在炎癥反應(yīng)中起激活、承接以及直接損傷作用的一類化學(xué)因子。有研究［9-10］表明，骨搬移不僅有助于畸形矯正、組織缺損的修復(fù)，還可以抑制炎癥因子控制感染。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子是一種起著血管再生作用，特異性很高的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子。應(yīng)用脛骨橫向骨搬移建立兔子模型證實(shí)：骨搬移后7 d 發(fā)現(xiàn)在創(chuàng)面肉芽組織有較多的血管再生［11］。但到目前為止，骨搬移技術(shù)如何促進(jìn)血管再生的機(jī)制仍不明確。本文通過建立大鼠感染性骨缺損模型，探討炎癥因子和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在骨搬移治療感染性骨缺損中的變化情況，為進(jìn)一步研究感染性骨缺損愈合的機(jī)制及臨床治療提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料36 只體質(zhì)量200 ～250 g 的SPF 級(jí)成年SD 雄性大鼠，由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。白細(xì)胞介素-10（IL-10）、干擾素-α（IFN-α）、核因子-κB（NF-κB）、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）的ELISA kits 購自基因美生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 制備實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型SD 大鼠在SPF 級(jí)環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，術(shù)前8 h 禁食禁水。稱重后腹腔注射3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）。待完全麻醉后，仰臥位固定四肢，手術(shù)區(qū)備皮消毒，鋪無菌洞巾，依次切開皮膚和皮下組織，仔細(xì)分離肌肉，用骨膜剝離器仔細(xì)剝離骨膜后在脛骨遠(yuǎn)端用骨鉆制成約4 mm 大小的骨缺損［12］，在缺損部位注射1 × 104CFU/mL 金黃色葡萄球菌［13］，術(shù)后不使用抗生素。兩周后將感染性骨缺損造模成功的36 只大鼠隨機(jī)分為骨搬移組和對(duì)照組，每組18 只。對(duì)照組用生理鹽水、雙氧水反復(fù)清洗創(chuàng)面，刮除炎性肉芽及壞死組織并在脛骨近端安裝支架后離斷脛骨［14］，安裝后不進(jìn)行搬移。骨搬移組用生理鹽水、雙氧水反復(fù)清洗創(chuàng)面，刮除炎性肉芽及壞死組織并在脛骨近端安裝支架后離斷脛骨，待靜息期7 d 后進(jìn)行搬移，每次搬移約0.5 mm，每天分2 次進(jìn)行，1 d內(nèi)先延脛骨縱軸往外側(cè)搬移約0.5 mm，再延脛骨縱軸往內(nèi)側(cè)搬移約0.5 mm，共搬移14 d。兩組大鼠在安裝支架后以40 kU/（kg·d）青霉素劑量行同側(cè)大腿肌肉注射，連用3 d 預(yù)防感染［15］。對(duì)于術(shù)中術(shù)后死亡的動(dòng)物給予及時(shí)補(bǔ)充。

1.2.2 大體觀察觀察大鼠感染性骨缺損模型建立及骨搬移手術(shù)后的精神、進(jìn)食、活動(dòng)情況、手術(shù)切口分類及傷口愈合分級(jí)。

1.2.3 Micro-CT 觀察于手術(shù)后第4 周拍攝各組大鼠脛骨Micro-CT 片，觀察骨愈合情況。

1.2.4 組織病理學(xué)觀察于第2、3 和4 周處死每組6 只大鼠，取骨缺損斷端為中心的骨組織行蘇木精-伊紅染色，于低倍鏡下（× 100）觀察骨小梁、成骨細(xì)胞、板層骨生成情況。

1.2.5 ELISA 檢測(cè)于第2、3 和4 周處死每組6 只大鼠，腹腔取血用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)IL-10、TNF-α、NF-κB、VEGF 的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析來比較不同組間的差異，并用LSD-t法進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模情況兩組大鼠在感染性骨缺損造模后的切口為污染切口，之后的第1 天出現(xiàn)精神差，進(jìn)食減少，活動(dòng)明顯受限。造模一周內(nèi)有3 只老鼠死亡，筆者及時(shí)進(jìn)行了補(bǔ)充。一周后兩組大鼠的精神尚可，進(jìn)食正常，活動(dòng)稍受限，傷口為丙級(jí)愈合。兩組大鼠在清創(chuàng)并安裝支架后的切口為可能污染切口，安裝支架后第4 周，骨搬移組大鼠的傷口為甲級(jí)愈合，而對(duì)照組大鼠的傷口為乙級(jí)愈合。骨搬移術(shù)后大鼠第1 天精神食欲欠佳，活動(dòng)稍受限，術(shù)后第3 天搬移組逐漸恢復(fù)正常飲食及活動(dòng)。術(shù)后兩組大鼠支架固定在位。

2.2 術(shù)后第4 周Micro-CT 掃描結(jié)果骨搬移組在骨搬移處兩斷端有大量的骨小梁生成，兩斷端間隙變小，出現(xiàn)大量完整的骨小梁連接結(jié)構(gòu)；對(duì)照組脛骨的兩斷端有少量的骨小梁形成，兩斷端間隙仍存在，未見明顯的骨小梁連接結(jié)構(gòu)。骨搬移組骨缺損處的骨微結(jié)構(gòu)趨于改善，表現(xiàn)為骨小梁增多變厚，骨缺損間隙變小，出現(xiàn)大量完整的骨小梁連接結(jié)構(gòu)；對(duì)照組骨缺損處的骨微結(jié)構(gòu)未明顯改善，骨小梁少量增加，骨缺損間隙仍存在，有少量完整的骨小梁連接結(jié)構(gòu)。見圖1。

圖1 兩組大鼠第4 周Micro-CT 片F(xiàn)ig.1 Micro-CT images of rats in both groups at 4th week

2.3 蘇木精-伊紅（HE）染色結(jié)果第2 周骨搬移組可見有大量新生網(wǎng)狀骨小梁，骨小梁邊緣可見大量成骨細(xì)胞附著，骨小梁骨陷窩內(nèi)充盈骨細(xì)胞，成骨活躍；對(duì)照組可見有少量網(wǎng)狀骨小梁，骨小梁邊緣有少量成骨細(xì)胞附著。兩組第3 周情況介于同組第2 周和第4 周之間。第4 周骨搬移組可見骨小梁粗大，骨小梁間隙縮小并形成板層骨；對(duì)照組可見骨小梁增粗不明顯，骨小梁間隙較多，有少量板層骨形成，見圖2。

2.4 ELISA結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析在第2、3和4周兩組大鼠的IL-10、TNF-α、NF-κB 因子表達(dá)量隨時(shí)間均逐漸降低，其中骨搬移組在同一時(shí)段的表達(dá)量均低于對(duì)照組，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1-3。兩組大鼠的VEGF 因子表達(dá)量隨時(shí)間均逐漸升高，骨搬移組在同一時(shí)段的表達(dá)量高于對(duì)照組，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

圖2 各組術(shù)后骨組織蘇木精-伊紅染色情況（×100）Fig.2 Hematoxylin-eosin staining of bone tissues in each group after surgery（×100）

表1 IL-10 因子表達(dá)情況Tab.1 Expression of IL-10 factors in each group±s

表1 IL-10 因子表達(dá)情況Tab.1 Expression of IL-10 factors in each group±s

注：骨搬移組與對(duì)照組相比，*P ＜0.05

例數(shù)IL-10（ng/L）組別骨搬移組對(duì)照組6 6 2周11.219±0.327*15.022±0.113 3周8.892±0.281*14.244±0.286 4周7.130±0.274*13.415±0.266

表2 TNF-α因子表達(dá)情況Tab.2 Expression of TNF-α factors in each group±s

表2 TNF-α因子表達(dá)情況Tab.2 Expression of TNF-α factors in each group±s

注：骨搬移組與對(duì)照組相比，*P ＜0.05

例數(shù)TNF-α(mg/L)組別骨搬移組對(duì)照組6 6 2 周97.680±0.574*100.751±0.531 3 周88.029±0.232*93.089±0.219 4 周80.391±0.464*88.020±0.123

表3 NF-κB 因子表達(dá)情況Tab.3 Expression of NF-κB factors in each group±s

表3 NF-κB 因子表達(dá)情況Tab.3 Expression of NF-κB factors in each group±s

注：骨搬移組與對(duì)照組相比，*P ＜0.05

例數(shù)NF-κB（pg/L）組別骨搬移組對(duì)照組6 6 2周135.636±0.046*142.584±0.019 3周130.845±0.043*140.290±0.233 4周126.459±0.053*138.510±0.023

表4 VEGF 因子表達(dá)情況Tab.4 Expression of VEGF factors in each group±s

表4 VEGF 因子表達(dá)情況Tab.4 Expression of VEGF factors in each group±s

注：骨搬移組與對(duì)照組相比，*P ＜0.05

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3 討論

骨搬移手術(shù)是由ILIZAROV 等發(fā)明，是以張力-應(yīng)力學(xué)說為基礎(chǔ)的技術(shù)，該學(xué)說在骨科領(lǐng)域具有里程碑式的意義［16］。骨搬移在糖尿病足治療中的創(chuàng)新性應(yīng)用，取得了良好的療效，這也為治療感染性骨缺損提供了新的思路［17］。因此，建立一種經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便的動(dòng)物模型，來明確骨搬移促進(jìn)感染性骨缺損愈合的機(jī)制具有重要意義。但是，目前國內(nèi)關(guān)于骨搬移治療大鼠感染性骨缺損模型的報(bào)道相對(duì)較少，對(duì)于骨搬移治療大鼠感染性骨缺損術(shù)后何時(shí)搬移、每天搬移的次數(shù)和距離、搬移的天數(shù)的問題，有待進(jìn)一步的研究。

有研究表明感染性骨缺損的愈合需要多種生化因子和微循環(huán)的參與［18-19］，其中炎癥因子和VEGF 起到了重要的作用。IL-10 是一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子，其抗炎作用強(qiáng)大，可以抑制活化的單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素-1α（IL-1α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、單核細(xì)胞趨化蛋白等炎癥介質(zhì)［20］。IL-10 體外能夠直接刺激大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生成骨樣分化和鈣化，促進(jìn)了成骨分化標(biāo)志Runx2 的表達(dá)，抑制了促進(jìn)破骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵分子NFATc1 的表達(dá)［21］。TNF-α是一種最早參與炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子，增加血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性使血管得到擴(kuò)張，進(jìn)而參與了骨缺損的愈合［22-23］。NF-κB 是一種關(guān)鍵的炎癥轉(zhuǎn)錄因子，與細(xì)胞存活與增殖有關(guān)［24］。TNF-α激活NF-κB 通路，抑制骨髓間充質(zhì)細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化，增加破骨細(xì)胞活性，加重炎癥反應(yīng)，延緩骨的愈合［25-26］。當(dāng)炎癥因子高表達(dá)量時(shí)，可以使血管內(nèi)皮功能受損，激活血小板，導(dǎo)致血液處于高凝狀態(tài)，進(jìn)而促進(jìn)微血栓的形成，影響骨缺損端的血供，從而導(dǎo)致骨缺損延遲愈合［27-28］。VEGF 是一種具有強(qiáng)大功能的血管調(diào)節(jié)因子，通過調(diào)節(jié)血管再生，促進(jìn)破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞的增殖和分化［29］。有研究發(fā)現(xiàn)，在抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)后，小鼠脛骨骨缺損愈合受到抑制［30］。本實(shí)驗(yàn)通過Micro-CT 掃描、HE 染色可知，同時(shí)段的骨搬移組感染性骨缺損愈合好于對(duì)照組，ELISA 統(tǒng)計(jì)表明，骨搬移組的炎癥因子表達(dá)量低于同期對(duì)照組、而骨搬移組的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)量卻高于同期對(duì)照組，因此筆者推測(cè)，骨搬移治療感染性骨缺損，可能是骨搬移施予的持續(xù)、穩(wěn)定、緩慢的牽引力抑制了炎癥因子表達(dá)，促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)，改變了感染性骨缺損的血液動(dòng)力學(xué)或流變學(xué)狀態(tài)，使感染性骨缺損處的血管再生和微循環(huán)重建，進(jìn)而促進(jìn)感染性骨缺損的愈合。但是本研究只探討了IL-10、TNF-α、NF-κB 和VEGF 在骨搬移治療大鼠感染性骨缺損中的變化情況，各細(xì)胞因子之間的相互作用和影響極其復(fù)雜，需要從細(xì)胞、分子水平去進(jìn)一步探討。

總之，骨搬移促進(jìn)大鼠感染性骨缺損愈合，抑制了其炎癥反應(yīng)。進(jìn)一步探究發(fā)現(xiàn)骨搬移治療術(shù)后大鼠體內(nèi)血清炎癥因子表達(dá)水平下調(diào)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)水平上調(diào)，提示骨搬移可能通過影響炎癥因子和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)量，進(jìn)而影響感染性骨缺損的修復(fù)。