900 MHz微波輻射不同時點暴露對雄性大鼠血漿激素水平晝夜節(jié)律的影響*

趙華，宗春燕，周振，曹毅

(貴州醫(yī)科大學 公共衛(wèi)生學院環(huán)境污染與疾病監(jiān)控省部共建教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

睪丸是對微波輻射和電磁脈沖敏感的器官之一[1]。移動電話作為當今社會主要的通信工具，其對生殖系統(tǒng)的影響是現(xiàn)今研究的熱點之一，有學者研究了微波輻射對睪丸組織、精子形態(tài)及數(shù)量的影響[2-5]，本課題前期研究證實了雄性SD大鼠血漿睪酮(testosterone，T)、雌二醇(estradiol，E2)和褪黑素(melatonin，Mel)存在明顯晝夜節(jié)律，在大鼠自發(fā)活動的峰值或谷值時點給予 900 MHz 2 000 μW/cm2微波輻射能夠影響大鼠血漿激素水平的晝夜節(jié)律性[6]。為維持機體正常功能，血漿激素水平穩(wěn)定是非常重要的，本研究以血漿Mel具有明顯晝夜節(jié)律性的大鼠為模型，探討微波輻射影響晝夜節(jié)律的敏感時間，檢測不同時點微波輻射對大鼠血漿Mel和T水平的影響程度，為研究微波輻射對生殖系統(tǒng)的影響和防護提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

PMM8053A場強儀(意大利PMM公司)，自發(fā)活動視頻分析系統(tǒng)(上海吉量軟件科技有限公司)。電磁輻射系統(tǒng)：GTEM室(長5.67 m、寬2.83 m、高2.07 m，型號DN6313A，蘇州大學研制)，功率放大器(型號SN1012，HD Communications Corp)和信號發(fā)生器(型號SN2130J6030，意大利PMM公司)。物節(jié)律單余弦模型分析軟件(蘇州大學)，有機玻璃輻射盒，睪酮和MelELISA試劑盒(購于上海易利生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1動物及分組 由蘇州大學實驗動物中心提供SPF級雄性SD大鼠110只，體質(zhì)量(150±10)g，根據(jù)大鼠24 h自發(fā)活動晝夜節(jié)律篩選出87只、根據(jù)大鼠血漿Mel水平24 h晝夜節(jié)律篩選出60只晝夜節(jié)律無明顯性差異的大鼠，隨機分為照射組和對照組；照射組和對照組再各分為6個小組(2 ∶00 PM、6 ∶00 PM、10 ∶00 PM、2 ∶00 AM、6 ∶00 AM和10 ∶00 AM)、每組5只。大鼠在環(huán)境溫度20～26 ℃、濕度40%～70%下適應性喂養(yǎng)30 d，自由飲水進食，光照/黑暗(12 h ∶12 h)。通過自發(fā)活動系統(tǒng)采集大鼠24 h自發(fā)活動數(shù)據(jù)，再運用生物節(jié)律單余弦分析軟件選擇87只具有明顯晝夜節(jié)律的大鼠，24 h尾靜脈采血6次、每次間隔4 h，測血漿Mel水平，分析Mel水平的24 h晝夜節(jié)律。

1.2.2活動觀察 觀察室內(nèi)放置4個大小為50 cm×50 cm×70 cm的隔光、隔聲、獨立的有機玻璃盒，盒內(nèi)設飲水攝食裝置；觀察室內(nèi)配有獨立開關(guān)的紅外線光源、人工白熾燈光源和攝像頭，可拍攝大鼠的活動軌跡，視頻信息輸入電腦并通過軟件分析得到大鼠自發(fā)活動平均速度。大鼠放入觀察室內(nèi)保持與外界隔光狀態(tài)，適應1 d，觀察24 h。每4 h攝像1次，每次觀察30 min，然后分析24 h內(nèi)不同時間段大鼠自發(fā)活動的平均速度。

1.2.3微波輻射 大鼠在有機玻璃輻射盒中通過微波輻射系統(tǒng)進行全身照射[6]，各組分別于2 ∶00 PM、6 ∶00 PM、10 ∶00 PM 、2 ∶00 AM、6 ∶00 AM和10 ∶00 AM 時間點連續(xù)暴露1 h于2 000 μW/cm2900 MHz微波輻射環(huán)境中，每組1 h/d、共30 d；同時點放置對照組于有機玻璃盒中進行微波輻射假暴露(假暴露即為除不給予微波輻射外，其余同照射組相同)，1 h/d，其他飼養(yǎng)條件同照射組。

1.2.4血漿激素水平測定 所有大鼠在暴露結(jié)束后第0、4、8、12、16和20 h時尾靜脈采血，離心15 min(1 500 r/min)，4 ℃保存，用ELISA法測定血漿T和Mel水平。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1余弦分析 用生物節(jié)律單余弦模型分析軟件進行分析，根據(jù)方程公式F(t)=M+Acos(ωt+Φ)擬合相位響應曲線(振幅A為上下波動的幅度、節(jié)律振蕩的幅度，M為漲落變化的中線、節(jié)律的調(diào)整中值，ω為節(jié)律的角頻率15°/h，Φ為振蕩到達頂峰的時刻、又稱為峰值相位，是最穩(wěn)定的節(jié)律特征參數(shù))，分析曲線時相變化確定是否存在晝夜節(jié)律，即對振幅A作F檢驗[7]。將大鼠6個時點血漿中Mel和T的水平用上述分析軟件擬合出相位響應曲線再進行分析，此分析方法可分為組平均余弦法和單一余弦法。用生物節(jié)律單余弦模型分析軟件進行相位響應曲線擬合每組動物6個時點激素水平的均值，得到各組大鼠的相位響應曲線，以描述各組節(jié)律特征，即為組平均余弦法；單一余弦法則是對每只大鼠6個時點的激素水平進行擬合分析，得到每只大鼠的A、M和Φ這3個參數(shù)，然后對各個參數(shù)進行分析。

2 結(jié)果

2.1 微波輻照前大鼠晝夜節(jié)律指標

照射組和對照組微波輻射前血漿Mel水平晝夜節(jié)律的3個指標比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。對表1中血漿Mel水平晝夜節(jié)律相位響應曲線振幅A作F檢驗，照射組和對照組血漿Mel水平均具有明顯晝夜節(jié)律，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 輻照前大鼠血漿Mel水平晝夜節(jié)律指標(n=5)Tab.1 Circadian rhythmic parameters of melatonin in plasma of rats before microwave radiation(n=5)

注：(1)對A作F檢驗，P<0.05。

2.2 微波輻照對大鼠血漿Mel水平晝夜節(jié)律的影響

微波輻射后，對照組和照射組血漿Mel水平相位響應曲線如圖1所示，6個時間點組微波暴露后，雄性大鼠血漿Mel水平相位響應曲線均發(fā)生了變化。對照組和照射組大鼠血漿Mel水平相位響應曲線各個時點振幅A作F檢驗 ，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。將照射組和對照組相位響應曲線參數(shù)進行統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，2 ∶00 AM暴露于微波輻射的大鼠峰值時點對照組(18.10±1.88)ZT、照射組(8.73±1.01)ZT，與對照組比較，照射組峰值時點提前9.37 h，在6個時點中變化最大；2 ∶00 PM微波輻射照射組大鼠Mel水平相位響應曲線峰值對照組為(15.12±0.90)ZT、照射組為(14.19±1.24)ZT，照射組與對照組相比，在6個暴露時點中變化最小，峰值時點延遲0.93 h；白天輻射暴露(2 ∶00 PM、6 ∶00 PM和10 ∶00 AM)峰值時點總差值為13.62 h，黑夜(2 ∶00 AM、6 ∶00 AM和10 ∶00 PM)峰值時點總差值為22.67 h，峰值時點是反映晝夜節(jié)律變化的敏感標志。實驗結(jié)果顯示，2 ∶00 AM是大鼠血漿Mel對微波輻射最為敏感的時間點，對其影響最大；而2 ∶00 PM是大鼠血漿Mel對微波輻射最不敏感的時間點，對其影響最?。惶崾竞谝馆椛浔┞秾Υ笫笱獫{Mel水平較白天明顯。

2.3 微波輻照對大鼠血漿T水平晝夜節(jié)律的影響

照射組與對照組在微波輻射暴露后血漿T水平相位響應曲線如圖2所示。由圖可知，6個時點微波輻射后各組大鼠血漿T水平相位響應曲線均發(fā)生了變化。對照組血漿T水平相位響應曲線各個時點振幅A和照射組比較，如圖2所示，對各組振幅A作F檢驗，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。將照射組和對照組相位響應曲線參數(shù)進行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示，6 ∶00 PM暴露于微波輻射的大鼠峰值時點為(0.61±0.76)ZT，對照組為(12.72±0.83)ZT，照射組與對照組比較，峰值時點提前12.11 h，在6個時點中變化最大；10 ∶00 AM暴露于微波輻射的大鼠血漿T水平相位響應曲線峰值時點為(9.17±0.69)ZT、對照組為(12.18±0.68)ZT，與對照組比較，照射組峰值時點提前3.01 h，在6個暴露時點中變化最??；白天輻射暴露(2 ∶00 PM、6 ∶00 PM和10 ∶00 AM)峰值時點總差值為18.94 h，黑夜(2 ∶00 AM、6 ∶00 AM和10 ∶00 PM)峰值時點總差值為20.02 h。結(jié)果提示，6 ∶00 PM左右是大鼠血漿T對微波輻射最為敏感的時間點，對其影響最大；10 ∶00 AM左右是大鼠血漿T對微波輻射最不敏感的時間點，對其影響最?。惶崾竞谝馆椛浔┞秾Υ笫笱獫{T水平影響較白天明顯。

注:A為10 ∶00 AM、B為10 ∶00 PM、C為2 ∶00 AM、D為2 ∶00 PM、E為6 ∶00 AM、F為6 ∶00 PM，圖中ZT0點為自然時間9 ∶00 AM，橫軸灰色部分代表黑夜，白色部分代表白天。圖1 大鼠血漿Mel水平相位響應曲線結(jié)果Fig.1 PRCs for plasma of rats melatonin concentrations

注：A為10 ∶00 AM、B為10 ∶00 PM、C為2 ∶00 AM、D為2 ∶00 PM、E為6 ∶00 AM、F為6 ∶00 PM，圖中ZT0點為自然時間9 ∶00 AM，橫軸灰色部分代表黑夜，白色部分代表白天。圖2 大鼠血漿T水平相位響應曲線結(jié)果Fig.2 PRCs for plasma of rats testosterone concentrations

3 討論

WHO不育癥防治專題組的研究表明生殖功能紊亂是男性不育最重要的病因之一。全世界具有不同程度生育障礙的育齡夫婦中約50%是男方因素。由于短時間內(nèi)遺傳變異造成的影響是有限的，過去50年中男性生殖功能有所下降，有可能是受到了某些環(huán)境有害因素的影響[8-9]。伴隨科技的發(fā)展，各種電磁輻射暴露也越來越多，生殖器官作為電磁輻射的敏感器官，使得人們越來越重視其帶來的影響。

本實驗選擇Mel水平作為篩選條件是由于松果體產(chǎn)生的Mel受光周期制約，體內(nèi)Mel的含量呈晝夜性節(jié)律改變，從而使生物體的功能活動與外界的環(huán)境變化相適應，且Mel可通過下丘腦-垂體-性腺軸對生殖系統(tǒng)進行調(diào)節(jié)，下丘腦是Mel調(diào)節(jié)生殖系統(tǒng)的主要部位及靶器官[2,10-11]。本實驗中照射組在輻射后Mel和T水平各個時點組均升高，提示Mel的變化可能對血漿T水平有影響，這與Shou等[12]的研究結(jié)果類似，其研究顯示Mel可通過Leydig細胞的Mel受體影響睪丸的內(nèi)分泌活動，影響血漿性激素水平。性激素對生殖系統(tǒng)功能起著關(guān)鍵作用，同時對環(huán)境適應、維持機體平衡和神經(jīng)系統(tǒng)等也起著重要作用。雄性動物體內(nèi)中T是最重要的性激素，T水平異?？筛蓴_生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)，影響雄激素生物學作用，導致生殖功能紊亂，其激素改變可能是微波輻射影響雄性生殖功能的基礎[13]。Myung等[14-15]的研究也認為電磁輻射能影響機體生殖內(nèi)分泌功能。本實驗顯示不同時點微波暴露對血漿激素水平的影響不同，證實了電磁輻射對Mel和T的影響。2 ∶00 AM微波輻射對血漿Mel影響最大，說明其對微波輻射敏感時間為2 ∶00 AM左右；而微波輻射對血漿T影響最大的敏感時間段為6 ∶00 PM左右。由于機體對外界環(huán)境刺激的敏感度在一天中并不穩(wěn)定，這也就解釋了不同時點微波輻射對激素影響不同。本實驗結(jié)果顯示微波輻射在黑夜對大鼠血漿激素水平的影響較白天更為明顯。然而，細胞感受電磁輻射物理信號、電磁輻射能量在生物組織轉(zhuǎn)化及傳遞和引起敏感組織與細胞的損傷機理仍不清楚，電磁輻射影響的機制還需要進一步的研究。

本實驗中，微波輻射在各個時點暴露對血漿Mel和T水平均有影響，表現(xiàn)為振幅和峰值時點改變、中值增高，但機體對不同時點微波輻射的敏感度不同，這也提示，可通過避免暴露于機體對微波輻射敏感的時間段來降低電磁輻射影響，為電磁輻射防護提供新思路和理論依據(jù)。