辛二酰苯胺異羥肟酸聯(lián)合索拉菲尼對人肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響*

蔡爽，韓冰，鄭璐，湯雷，馬子華，陳雨絲，楊婷，楊勤，謝汝佳

(貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州省常見慢性疾病發(fā)病機(jī)制及藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 病理生理學(xué)教研室，貴州 貴陽 550025)

肝癌是世界上第六大常見癌癥，每年約有84.1萬新病例和78.2萬人死亡[1]。肝癌惡性程度高，復(fù)發(fā)率高，容易侵襲轉(zhuǎn)移，且大多數(shù)患者確診時已處于中晚期階段，不適合手術(shù)、肝移植或局部消融等治療方法[2-3]，因此非手術(shù)治療在肝癌的治療中占有重要地位。索拉菲尼(sorafenib,SOR)是美國FDA批準(zhǔn)用于晚期肝癌治療的分子靶向藥物[4-5]，研究表明，SOR可以通過抑制血管內(nèi)皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)和血小板衍生生長因子受體(platelet-derived growth factor receptor,PDGFR)的表達(dá)、從而阻斷腫瘤血管生成[6-7]；此外，SOR還具有抗絲氨酸(Ser)/蘇氨酸(Thr)激酶Raf的活性，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[8]。盡管SOR在臨床肝癌的治療中取得了一定的突破和進(jìn)展，但總體效果并不十分滿意。因此，如何提高SOR的臨床療效成為迫切需要解決的難題。近年來有研究報道，辛二酰苯胺異羥肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid,SAHA)，一種用于臨床血液系統(tǒng)惡性腫瘤治療的新型抗癌藥物與SOR聯(lián)合應(yīng)用時可顯著增強(qiáng)SOR對肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用，但其具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明。本研究旨在觀察SAHA聯(lián)合SOR對人肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并初步探討HepG2細(xì)胞中葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)、蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PKR-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)、磷酸化PERK(p-PERK)、及活化轉(zhuǎn)錄因子4(activating transcription factor 4,ATF4)蛋白表達(dá)的分子機(jī)制，為臨床肝癌的治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌細(xì)胞株HepG2購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心上海細(xì)胞庫(KCB 200507YJ)，索拉菲尼由貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院肛腸外科詹瑋博士惠贈，SAHA購自英國Abcam公司，胎牛血清購自美國ScienCell公司，DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胰酶購自Biological Industry，彩虹 Marker購自上海愛必信生物科技有限公司，BCA蛋白定量試劑盒和AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)有限公司，兔抗GAPDH、兔抗GRP78、兔抗PERK、兔抗ATF4購自英國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞株HepG2用含10%胎牛血清，1%雙抗(青霉素和鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)皿置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中，2～3 d換1次液，細(xì)胞密度85% 時以1 ∶2傳代。本實(shí)驗(yàn)所使用細(xì)胞均處于對數(shù)生長期。

1.2.2細(xì)胞活力檢測 采用MTT法取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，以104個/孔密度接種于96孔板，放置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度的SOR(0.5、1、3、6、12、25、50 μmol/L)、SAHA(0.5、1、3、6、12、25、50 μmol/L)及同劑量的SAHA 聯(lián)合SOR(劑量同前)處理細(xì)胞，同時設(shè)置陰性對照組和空白對照組，每個濃度均設(shè)5個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入5 g/L MTT 20 μL培養(yǎng)4 h，小心吸去上清液，加入二甲基亞砜(DMSO)150 μL ，置于搖床上低速震蕩10 min 、在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm處測定各孔的吸光度值(OD)，計(jì)算各組細(xì)胞存活率并繪制生長曲線。存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.2.3細(xì)胞凋亡 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測，隨機(jī)將對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞分為對照(control)組、SOR組(12 μmol/L)、SAHA組(6 μmol/L)及SAHA聯(lián)合SOR組(6 μmol/L+12 μmol/L)。給藥48 h后，使用不含EDTA的胰酶消化收集各組細(xì)胞，2 000 r/min離心5 min后棄上清，加入的binding buffer液500 μL懸浮細(xì)胞，再加入5 μL annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶(PI)，充分混勻，室溫避光反應(yīng)15 min后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.2.4GRP78、PERK、p-PERK及ATF4蛋白水平 采用Western blot法檢測，收集各組細(xì)胞，用蛋白裂解液提取細(xì)胞中的總蛋白，BCA 蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。取40 μg總蛋白上樣，經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白后，濕轉(zhuǎn)蛋白至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上，用5%脫脂奶粉封閉90 min，加入相應(yīng) I 抗，4 ℃ 孵育過夜。第2天用TBST洗膜3次后加入Ⅱ抗，室溫孵育90 min，TBST洗膜后ECL發(fā)光成像，Bio-Rad凝膠成像儀系統(tǒng)獲取圖像。用Image Lab圖像分析軟件對每個條帶進(jìn)行定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 SAHA聯(lián)合SOR對HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用

MTT法結(jié)果顯示,與對照組比較，不同濃度的SAHA和SOR均能明顯抑制HepG2細(xì)胞的增殖，且SAHA或SOR對HepG2的抑制作用呈明顯的劑量依賴性。與單獨(dú)的SAHA和SOR組比較，SAHA聯(lián)合SOR對HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用更為顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖1。根據(jù)MTT結(jié)果，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇6 μmol/L SAHA、12 μmol/L SOR及6 μmol/L SAHA聯(lián)合12 μmol/L SOR處理HepG2細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

注：(1)與control比較，P<0.01；(2)與SAHA組比較，P<0.01 ；(3)與SOR組比較，P<0.01。圖1 SAHA、SOR及兩藥聯(lián)合對HepG2細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effect of SAHA,SOR and two drugs on survival rate of HepG2 cells

2.2 SAHA聯(lián)合SOR對HepG2細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)，6 μmol/L SAHA 、12 μmol/L SOR及兩藥聯(lián)合均能明顯誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡。6 μmol/L SAHA處理HepG2細(xì)胞48 h后的凋亡率為(10.85±0.86)%，12 μmol/L SOR處理HepG2細(xì)胞48 h后的凋亡率為(13.57±1.12)%，SAHA聯(lián)合SOR處理HepG2細(xì)胞48 h后的凋亡率為(23.20±1.06)%；上述3組細(xì)胞凋亡率均顯著高于對照組,其中以聯(lián)合用藥組凋亡率最高，與SOR和SAHA單藥組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖2。

2.3 HepG2細(xì)胞中GRP78、PERK、p-PERK及ATF4蛋白表達(dá)

與對照組比較，SAHA和SOR單藥組可在一定程度上調(diào)HepG2細(xì)胞GRP78、p-PERK、ATF4蛋白的表達(dá)，兩藥聯(lián)合上述效應(yīng)更加顯著，差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而SAHA、SOR及兩藥聯(lián)合對PERK蛋白的表達(dá)無明顯影響，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

注：(1)與control組比較，P<0.01；(2)與SAHA組比較，P<0.01 ；(3)與SOR組比較，P<0.01。圖2 SOR、SAHA及兩藥聯(lián)合對HepG2細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effects of SOR,SAHA and two drugs on apoptosis of HepG2 cells

注：(1)與control組比較，P<0.05 ；(2)與SAHA組比較，P<0.05 ；(3)與SOR組比較，P<0.05。圖3 SOR、SAHA及兩藥聯(lián)合對HepG2細(xì)胞中GRP78、PERK、p-PERK及ATF4蛋白表達(dá)的影響(Western blot)Fig.3 Effects of SOR,SAHA and two drugs on the expression of GRP78,PERK,p-PERK and ATF4 in HepG2 cells(Western blot)

3 討論

SOR是一種多靶點(diǎn)口服抗腫瘤藥物，也是一種多激酶抑制劑，因其對腎細(xì)胞癌和肝細(xì)胞癌的療效，在臨床上，已被批準(zhǔn)用于治療晚期腎細(xì)胞癌和肝細(xì)胞癌[4-5]。SOR具有雙重的抗腫瘤作用，一方面它可通過阻斷由RAF/MEK/ERK介導(dǎo)的細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路而直接抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[8-9]；另一方面它還可通過抑制VEGFR和PDGFR而阻斷腫瘤新生血管的形成，從而間接地抑制腫瘤細(xì)胞的生長[6-7]。雖然SOR為臨床肝癌的治療打開了一扇希望之窗，但總體效果并不十分令人滿意，因此，如何提高SOR的臨床療效成為迫切需要解決的難題。近年來Yuan H[10]的研究發(fā)現(xiàn)，SAHA與SOR聯(lián)合應(yīng)用時可顯著抑制體外培養(yǎng)肝癌細(xì)胞的增殖。本次研究結(jié)果也證實(shí)了SAHA與SOR聯(lián)合應(yīng)用能夠顯著抑制人肝癌細(xì)胞HepG2的增殖，表明兩藥具有協(xié)同效應(yīng)，因此，兩藥聯(lián)合可能為臨床上治療肝癌提供更優(yōu)的治療效果。

SAHA是一種廣譜組蛋白去乙?；敢种苿?，有研究表明，它可通過抑制細(xì)胞周期進(jìn)程、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和分化從而抑制肝癌細(xì)胞的生長[11]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)SAHA可以激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)凋亡通路從而誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡[12]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)是真核細(xì)胞中重要的細(xì)胞器，幾乎所有分泌型蛋白(包括膜結(jié)合蛋白)都在ER中產(chǎn)生。ER不僅參與了蛋白質(zhì)的合成和折疊，還參與了鈣平衡的調(diào)節(jié)以及膽固醇和類固醇等脂質(zhì)的生物合成，以此來調(diào)節(jié)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[13]。而當(dāng)這些過程受到多種生理性或病理性因素的干擾時，會導(dǎo)致未折疊或錯誤折疊蛋白質(zhì)在ER中積累，最終導(dǎo)致ER穩(wěn)態(tài)失去平衡，引發(fā)ERS。在ERS條件下，細(xì)胞能夠激活未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)，通過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑以減輕或終止ERS，從而恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。然而，當(dāng)刺激因素持續(xù)時間過長或強(qiáng)度過大時，UPR也可激活細(xì)胞凋亡通路導(dǎo)致細(xì)胞死亡[14-15]。ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在很多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要意義。因此，通過激活ERS凋亡通路促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，有望成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)[16-17]。

當(dāng)前的研究報道可知，UPR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程主要由以下3種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜效應(yīng)蛋白所啟動：活化轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6,ATF6)、肌醇需求酶1(inositol-requiring enzyme 1,IRE1)和PERK[14]。正常情況下ATF6、IRE1和PERK與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78緊密結(jié)合，從而處于無活性狀態(tài)。發(fā)生ERS時，由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中積累的未折疊或錯誤折疊蛋白與GRP78競爭結(jié)合，導(dǎo)致GRP78與3種跨膜蛋白發(fā)生解離。解離后的PERK、IRE1和ATF6通過各自的途徑被激活，例如，與GRP78解離后的PERK可通過自身二聚化和磷酸化被激活，并進(jìn)一步促進(jìn)其下游的ATF4及CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[18]。在本次研究中，流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明兩藥聯(lián)合能顯著促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡，說明兩藥聯(lián)合不僅能抑制肝癌細(xì)胞的增殖，同時還促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的凋亡。進(jìn)一步通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)SAHA組和SOR組的GRP78、p-PERK和ATF4表達(dá)均較對照組顯著上調(diào)，說明SAHA、SOR均可通過激活ERS凋亡信號通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡；而SAHA聯(lián)合SOR能進(jìn)一步促進(jìn)上述蛋白的表達(dá)，提示ERS凋亡通路可能是SAHA增強(qiáng)SOR促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡的靶點(diǎn)之一，其機(jī)制可能是經(jīng)SAHA和SOR聯(lián)合處理肝癌細(xì)胞后，通過阻斷蛋白質(zhì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的運(yùn)輸，誘導(dǎo)了高水平的ERS，從而激活了PERK-ATF4信號通路，啟動細(xì)胞凋亡信號。

綜上所述，SAHA和SOR能夠協(xié)同增強(qiáng)對肝癌細(xì)胞HepG2的增殖抑制作用，且能顯著誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡，其協(xié)同作用可能與激活ERS凋亡通路有關(guān)。