基于TCGA數(shù)據(jù)庫及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析HDAC1基因在胃癌中的表達(dá)和臨床意義*

李抄，陳定宇，張曉怡，趙艷，王琴容，周建獎(jiǎng)，鮑麗雅，謝淵**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 地方病與少數(shù)民族性疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州省醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州醫(yī)科大學(xué) 分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 感染科 肝炎實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550004)

胃癌(gastric cancer,GC)是全球發(fā)病率第4位的惡性腫瘤，在腫瘤中致死率居第2位，是最常見的癌癥類型之一[1]。GC的傳統(tǒng)治療方法有胃切除術(shù)和放化療，但其復(fù)發(fā)率和死亡率很高，5年總生存率(overall survival，OS) 低于25%[2-3]。GC的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多階段多因素參與的過程，幽門螺桿菌(helicobacterpylori,H.pylori)毒力因子、眾多的細(xì)胞因子及信號(hào)通路在其中扮演重要角色[4]，因此，尋找與GC早期診斷、治療和預(yù)后密切相關(guān)的新靶點(diǎn)一直是近年來研究的熱點(diǎn)。細(xì)胞毒素相關(guān)基因A蛋白(cytotoxin associated gene A,CagA)是H.pylori的主要毒力因子，是已知的唯一注入胃上皮細(xì)胞的癌蛋白，可引起正常細(xì)胞分化的修飾，改變細(xì)胞極性和細(xì)胞黏附，與炎癥反應(yīng)增加、消化性潰瘍和GC發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)[5-7]。本課題組前期用CagA轉(zhuǎn)染胃上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，cagA基因可引起組蛋白去乙?；?(histone deacetylase 1，HDAC1)表達(dá)增高。有研究發(fā)現(xiàn)HDAC1在人GC細(xì)胞中高表達(dá)，且與預(yù)后相關(guān)[8]；組蛋白乙?；?去乙?；{(diào)控是表觀遺傳學(xué)中研究的主要內(nèi)容，HDAC1催化組蛋白去乙?；磻?yīng)，下調(diào)組蛋白乙?；?，可使染色質(zhì)被壓縮成致密構(gòu)象，轉(zhuǎn)錄活性下降[9]；組蛋白乙?；?去乙?；降氖Ш饣蚱湔{(diào)節(jié)酶的異常與GC發(fā)生、發(fā)展存在密切的聯(lián)系[10]。這些研究提示HDAC1可能作為GC臨床預(yù)后評(píng)估的指標(biāo)以及靶向治療的新靶點(diǎn)。因此，本研究通過對(duì)癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)公共數(shù)據(jù)庫，分析HDAC1 mRNA在GC組織和正常胃組織中的表達(dá)差異，分析GC中HDAC1表達(dá)水平量與臨床病理特征參數(shù)的相關(guān)性，預(yù)測(cè)HDAC1可能的相關(guān)信號(hào)通路及參與的功能富集，為GC發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制提供研究線索。

1 資料與方法

1.1 資料

從TCGA數(shù)據(jù)庫(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)中下載并預(yù)處理GC數(shù)據(jù)集中444例標(biāo)本的HDAC1 mRNA表達(dá)RNASeqV2數(shù)據(jù)，其中正常胃組織且HDAC1 mRNA表達(dá)量正常樣本36例作為正常組，408例GC組織樣本中再篩選出性別、年齡、瘤體大小(T1、T2、T3、T4) 、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N0、N1、Nx) 、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(M0、M1、Mx)及美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)(American Joint Committe on cancer ，AJCC)病理特征分期完整的371例作為GC組。GC組男239、女132例，年齡≤60歲122例、>60歲249例，T1+T2期53例、T3+T4期318例，N0期113例、N1期112例及Nx期146例，M0期326例、M1期24例及Mx期21例，Stage I+Stage II 51例、Stage III+Stage IV 320例；正常組男23例、女13例，年齡≤60歲7例、>60歲122例。此外，按GC組患者HDAC1 mRNA表達(dá)量均值大小將GC組分為高表達(dá)組(高于均值)271例和低表達(dá)組(低于均值)100例，一般資料見表1。

1.2 方法

1.2.1HDAC1相關(guān)基因篩選 登錄LinkedOmics數(shù)據(jù)庫(http://www.linkedomics.org/)首頁，選擇腫瘤類型為“GC”，靶點(diǎn)為“HDAC1”，數(shù)據(jù)集選擇TCGA數(shù)據(jù)集，分析與HDAC1表達(dá)相關(guān)的基因。

1.2.2基因功能富集分析(Omicsbean-Canner) 利用 Omicsbean-Canner V1.0網(wǎng)站(http://www.omicsbean.cn/)按照網(wǎng)站操作步驟對(duì)HDAC1基因進(jìn)行GO Enrichment分析，包括Molecular Function、Biological Process及Cell Component 富集結(jié)果等，進(jìn)一步結(jié)合既往對(duì)GC研究的靶點(diǎn)基因，選取有意義的信號(hào)通路。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 HDAC1基因表達(dá)量

GC組標(biāo)本HDAC1基因平均表達(dá)量(5.29±0.55)，明顯高于正常組(4.59±0.63)，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.88，P<0.01)，見圖1。

注：(1)與正常組比較，P<0.01。圖1 GC組與正常組被檢者HDAC1基因表達(dá)Fig.1 HDAC1 differential expression in GC and normal subjects

2.2 GC組HDAC1 mRNA基因表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

HDAC1 mRNA基因高、低表達(dá)組GC患者間的臨床病理參數(shù)比較結(jié)果顯示，HDAC1 mRNA基因的表達(dá)高低與患者的年齡、T分期、AJCC分期及幽門螺桿菌(H.pylori)感染等病理參數(shù)呈正相關(guān)性(P<0.05)，但與性別、N分期及M分期等病理參數(shù)無相關(guān)性(P>0.05)。見表1。

表1 GC患者HDAC1 mRNA基因表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab.1 Correlation of HDAC1 mRNA gene expression level and clinicopathological parameters in patients with GC

2.3 GC組HADC1 mRNA表達(dá)與預(yù)后

對(duì)TCGA數(shù)據(jù)集中GC患者的預(yù)后進(jìn)行Kaplan-Meier分析，繪制生存函數(shù)曲線，結(jié)果表明，HDAC1 mRNA高、低表達(dá)與GC患者生存無相關(guān)性(P>0.05)，見圖2。

圖2 HDAC1高、低表達(dá)組GC患者預(yù)后的Kaplan-Meier分析Fig.2 Kaplan-Meier analysis of overall survival in GC patients with HDAC1-high and -low expression groups

2.4 GC組HADC1相關(guān)基因分析

使用LinkedOmics數(shù)據(jù)庫對(duì)GC組HADC1進(jìn)行相關(guān)基因分析，以P<0.05為界限，共檢索到HADC1基因表達(dá)與AK2(adenylate kinase 2)、EIF3I(eukaryotic translation initiation factor 3 subunit I)及MARCKSL1(MARCKS like 1)等9 118個(gè)基因表達(dá)量呈正相關(guān)，與GNAL(G protein subunit alpha L)、ARMCX2(armadillo repeat containing X-linked 2)及CCDC46(centrosomal protein 112)等10 907個(gè)基因表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，見圖3。

2.5 HDAC1的功能基因富集分析

Omicsbean-Canner功能富集分析結(jié)果表明，HDAC1基因功能顯著富集到細(xì)胞周期、notch信號(hào)通路及Transcriptional misregulation in cancer等，見圖4。

3 討論

GC作為一種高發(fā)惡性腫瘤，給人民群眾的健康帶來了巨大的威脅，也給社會(huì)帶來了沉重的負(fù)擔(dān)[11]。雖然GC的診斷和治療技術(shù)有了持續(xù)進(jìn)展，但GC的發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明[12]。因此，尋找新的靶點(diǎn)對(duì)于GC的診斷和治療有著重要的意義。TCGA組學(xué)數(shù)據(jù)庫有著樣本量大、數(shù)據(jù)信息豐富完整及隨訪時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)；因此得到的結(jié)論較為可靠，有利于充分認(rèn)識(shí)基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用[13-14]。通過生物醫(yī)學(xué)大數(shù)據(jù)分析，可以為進(jìn)一步研究基因在腫瘤的功能和調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

注：A 為HDAC1關(guān)聯(lián)結(jié)果，B為正相關(guān)基因，C為負(fù)相關(guān)基因。圖3 HADC1相關(guān)基因分析Fig.3 HADC1-related gene analysis

圖4 HADC1基因的功能富集Fig.4 The functional enrichment of HADC1 gene

乙?；饔迷谡婧思?xì)胞的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起核心作用。在細(xì)胞核內(nèi)，組蛋白乙?；c組蛋白去乙?；^程處于動(dòng)態(tài)平衡；并由組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferase,HAT)和組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDAC)共同調(diào)控[15]。HAT將乙酰輔酶A的乙?；D(zhuǎn)移到組蛋白氨基末端特定的賴氨酸殘基上，HDAC使組蛋白去乙?；?，與帶負(fù)電荷的DNA緊密結(jié)合，染色質(zhì)致密卷曲，基因的轉(zhuǎn)錄受到抑制[16]；HDAC還參與調(diào)節(jié)組蛋白乙?；?，組蛋白乙酰化也可能作為一種信號(hào)，傳達(dá)信息改變相鄰核小體上組蛋白之間的功能狀態(tài)，影響組蛋白與轉(zhuǎn)錄因子間的作用，HDAC與HTA共同作用維持細(xì)胞內(nèi)乙酰化與去乙?；钠胶鉅顟B(tài)，如這一平衡被打破可能導(dǎo)致疾病發(fā)生[17-18]；HDAC抑制劑已被應(yīng)用于臨床治療惡性腫瘤，有越來越多的研究證實(shí)HDAC抑制劑能夠誘導(dǎo)不同的腫瘤細(xì)胞增殖停滯、細(xì)胞分化、凋亡等。

本研究發(fā)現(xiàn)，GC組標(biāo)本HDAC1基因平均表達(dá)量明顯高于正常組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示HDAC1可能是GC中的一個(gè)重要的促癌基因；進(jìn)一步分析HDAC1與GC患者臨床特征的關(guān)系，結(jié)果顯示HDAC1基因的表達(dá)水平與患者的年齡、T分期、AJCC分期及H.pylori感染呈正相關(guān)(P<0.05)，但與性別、N分期及M分期無相關(guān)(P>0.05)，以上結(jié)果表明HDAC1基因高表達(dá)可能是GC的預(yù)后一種不利因素。為了進(jìn)一步探索HDAC1在GC中可能的作用機(jī)制，本研究通過LinkedOmics數(shù)據(jù)庫分析HDAC1密切相關(guān)的基因，結(jié)果顯示HDAC1表達(dá)與AK2、EIF3I及MARCKSL1顯著正相關(guān)，與GNAL、ARMCX2及CCDC46 顯著負(fù)相關(guān)，EIF3I的體外過表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞大小增加，增殖增強(qiáng)，細(xì)胞周期進(jìn)程和錨定非依賴性生長(zhǎng)，EIF3I過表達(dá)促進(jìn)mTOR(mechanistic target of rapamycin)將生長(zhǎng)信號(hào)整合到mRNA翻譯過程中，從而促進(jìn)蛋白質(zhì)合成和腫瘤生長(zhǎng)[19-20]，MARCKSL1在細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用，并已顯示出維持抗腫瘤和轉(zhuǎn)移抑制的特性[21-22]，以上可能為HDAC1潛在的上下游分子。在Omicsbean-Canner中以HDAC1基因目標(biāo)顯著富集到細(xì)胞周期、notch信號(hào)通路、Transcriptional misregulation in cancer等信號(hào)通路及功能。有研究發(fā)現(xiàn)Notchl信號(hào)通路過表達(dá)可能參與胃黏膜的癌變過程，而且Notchl的表達(dá)與GC惡性程度負(fù)相關(guān),表明Notch信號(hào)通路在GC組織中的雙重效應(yīng)[23-26]，推測(cè)CagA可能通過HDAC1高表達(dá)途徑來調(diào)控細(xì)胞周期及Notch信號(hào)通路等來促進(jìn)GC的進(jìn)展。

綜上所述，本研究通過對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫基因芯片數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)挖掘，可知HDAC1基因在GC中呈高表達(dá)，并與GC患者的年齡、T分期、AJCC分期及H.pylori感染顯著相關(guān)，與預(yù)后無相關(guān)。然而本研究也存在一些不足，比如TCGA數(shù)據(jù)庫中為RNASeq數(shù)據(jù)，可能無法完全代表HDAC1蛋白表達(dá)水平以及研究數(shù)據(jù)部分分組樣本量較少可能造成統(tǒng)計(jì)學(xué)偏差，提示后續(xù)研究可通過Western blot和免疫組織化學(xué)技術(shù)從蛋白質(zhì)表達(dá)水平驗(yàn)證HDAC1分子機(jī)制與信號(hào)通路，為探明GC的發(fā)生發(fā)展和靶向治療提供新的思路。