黃沙鱉致病性蠟樣芽孢桿菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

黎姍梅，吳柳青，許飄尹，盛雪晴，賀曉晨，肖雙燕，邱梓晟，梁靜真，韓書煜*，黃 鈞*

(1.廣西水生動(dòng)物病害診斷實(shí)驗(yàn)室/廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530004；2. 廣西水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，廣西 南寧 530022；3.武宣縣水產(chǎn)技術(shù)推廣站，廣西 武宣 545900)

【研究意義】中華鱉(Pelodiscussinensis)的地理種群黃沙鱉廣泛分布于廣西的左江、右江、郁江及西江流域[1]，具有較強(qiáng)的繁殖力和抗病性，易于飼養(yǎng)，其體色鮮黃、裙邊寬厚、肉嫩味美，是廣西名特優(yōu)水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一。近年來，隨著黃沙鱉養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，其各種病害頻繁暴發(fā)[2-4]，嚴(yán)重影響廣西黃沙鱉養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。2016年7月，廣西武宣縣某養(yǎng)殖場黃沙鱉出現(xiàn)表皮充血發(fā)炎、疥瘡和腐皮等多種病癥，并陸續(xù)發(fā)病死亡，疑似由蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)引起，但目前有關(guān)黃沙鱉蠟樣芽孢桿菌病的研究尚未見報(bào)道。因此，對(duì)黃沙鱉進(jìn)行病原菌分離鑒定和藥物敏感性試驗(yàn)，對(duì)防治黃沙鱉蠟樣芽孢桿菌病具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】蠟樣芽孢桿菌是一種需氧或兼性厭氧、具有芽孢的革蘭氏陽性桿菌，廣泛分布于自然界的空氣、水體和土壤中[5-6]，該菌抗逆性較強(qiáng)，能分泌抗菌素和超氧化物歧化酶等有益生物活性物質(zhì)，作為微生態(tài)制劑和飼料添加劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用[7-9]。蠟樣芽孢桿菌屬于條件性致病菌，能引起人類食物中毒、傷口感染，甚至引起肺炎、腦膜炎及敗血病等嚴(yán)重疾病[10]，也能引起牛乳房炎[11]和子宮內(nèi)膜炎[12]、馬表皮潰爛[13]、豬腹瀉[14]等家畜疾病，還能引起半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)[15]、羅非魚(Oreochromis)[16]、棘胸蛙(Quasipaaspinosa)[17]和中華鱉[18]等水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物發(fā)病死亡。目前已知的鱉細(xì)菌性疾病有紅底板病、紅脖子病、白底板病、腐皮病、癤瘡病、白點(diǎn)病和愛德華氏菌病等，病原菌有遲緩愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)[19]、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila[2，20]、溫和氣單胞菌(A.sobria)[21]和類志賀鄰單胞菌(Plesimonasshigelloides)[4]等?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，蠟樣芽孢桿菌作為病原菌引起爬行類動(dòng)物致病僅見譚愛萍等[17]對(duì)中華鱉的報(bào)道，而關(guān)于黃沙鱉感染該菌的研究尚無報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對(duì)廣西武宣縣某養(yǎng)殖場患病黃沙鱉進(jìn)行病原菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)，為確定引起黃沙鱉患病的病原及在生產(chǎn)中進(jìn)行有效防治提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

病樣為廣西武宣縣某養(yǎng)殖場患病黃沙鱉，平均體重1410.7 g/只，病癥為表皮充血發(fā)炎、疥瘡及腐皮等。用于人工感染試驗(yàn)的健康黃沙鱉購自廣西武宣縣另一個(gè)養(yǎng)殖場，平均體重約116.4 g/只，試驗(yàn)前在廣西大學(xué)水產(chǎn)教學(xué)科研基地暫養(yǎng)30 d，期間黃沙鱉的攝食及活動(dòng)正常，生長良好，無任何肉眼可見病癥，人工感染前3 d隨機(jī)抽樣檢測(cè)均未從心臟和肝臟中分離到細(xì)菌。

普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、腦心浸液培養(yǎng)基和兔血瓊脂培養(yǎng)基均購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司；新霉素、多西環(huán)素和恩諾沙星原料藥購自浙江國邦藥業(yè)有限公司；API 20E和API 50CH生化鑒定試劑條及所需配套試劑均購自法國梅里埃公司；PCR擴(kuò)增試劑盒購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。

1.2 細(xì)菌分離

先對(duì)患病黃沙鱉外觀癥狀進(jìn)行檢查并記錄，然后采用常規(guī)方法對(duì)病樣進(jìn)行解剖，肉眼觀察并記錄其腸道、胃、心臟、肝臟和咽喉等各內(nèi)臟器官的病變情況。用75 %酒精棉球?qū)Ω闻K、腎臟和脾臟等器官的取樣部位進(jìn)行擦拭，并取樣劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，挑取優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)后置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 人工感染試驗(yàn)

1.3.1 無菌濾液人工感染試驗(yàn) 按韓書煜等[21]的方法，取患病黃沙鱉的心臟、肝臟、腎臟和脾臟等內(nèi)臟組織勻漿，10 ℃下10 000 r/min離心30 min后取上清液，采用0.22 μm細(xì)菌濾器過濾得到無菌濾液，涂布于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上觀察是否有菌落生長。取健康黃沙鱉分成對(duì)照組和試驗(yàn)組，每組20只。對(duì)照組和試驗(yàn)組分別腹腔注射滅菌PBS和無菌濾液，每只注射量均為0.5 mL，各組均設(shè)3個(gè)平行，然后進(jìn)行15 d的飼養(yǎng)觀察。若發(fā)生死亡現(xiàn)象即取剛死或?yàn)l死個(gè)體內(nèi)臟組織再制成無菌濾液并進(jìn)行人工感染試驗(yàn)。

1.3.2 分離菌株的人工感染試驗(yàn) 用滅菌PBS配制分離菌株的菌懸液，以細(xì)菌比濁儀將細(xì)菌濃度調(diào)為5.07×107CFU/mL。取健康黃沙鱉分成對(duì)照組和試驗(yàn)組，每組20只。試驗(yàn)組腹腔注射菌懸液0.5 mL/只，對(duì)照組注射等量的滅菌PBS，各組均設(shè)3個(gè)平行。注射后分別飼養(yǎng)于相同條件的不同水族箱中，連續(xù)觀察15 d。按照1.2的方法對(duì)具有與自然患病癥狀相似的瀕死個(gè)體進(jìn)行生化分離。第2次人工感染試驗(yàn)步驟與第1次相同，所注射的菌懸液(4.95×107CFU/mL)為第1次人工感染試驗(yàn)分離純化得到的細(xì)菌制備而成。

1.4 細(xì)菌鑒定

1.4.1 生化鑒定 將活化后的菌株分別劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和兔血瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后觀察菌落的顏色、形態(tài)和溶血性，經(jīng)革蘭氏染色后觀察細(xì)菌的形態(tài)特征。根據(jù)染色結(jié)果和細(xì)菌形態(tài)選擇API 50CH試劑條、API 50CHB培養(yǎng)基和API 20E試劑條(前12個(gè)項(xiàng)目)進(jìn)行生化鑒定。利用APIWEB服務(wù)器(https://apiweb.biomerieux.com/login)的API 50CHB V4.0對(duì)鑒定結(jié)果進(jìn)行判斷。

1.4.2 分子生物學(xué)鑒定 對(duì)GXWXAA菌株的16S rRNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。按黃鈞等[3]的方法提取細(xì)菌基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。PCR擴(kuò)增使用的上游引物為8F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)、下游引物為1492R(5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)。 反應(yīng)體系25.0 μl：TaqMix 12.5 μl，ddH2O 8.5 μl，10 μmol/L上下游引物各1.0 μl，DNA模板2.0 μl。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至深圳華大基因科技有限公司測(cè)序。

1.5 藥敏試驗(yàn)

參照黃艷華等[2]的方法進(jìn)行K-B紙片擴(kuò)散法操作，按生產(chǎn)廠家提供的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷；最小抑菌濃度(MIC)采用二倍稀釋法進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)K-B紙片擴(kuò)散法的試驗(yàn)結(jié)果選用恩諾沙星、新霉素和多西環(huán)素進(jìn)行MIC測(cè)定；參照黃新財(cái)?shù)萚22]的方法，用滅菌PBS將藥物配制成1000 μg/mL母液；在無菌條件下，向96孔微量板每孔分別加入120 μl腦心浸液培養(yǎng)基，向第1孔加入母液120 μl，用移液槍混勻后取120 μl移至第2孔中，混勻后再取120 μl移至第3孔中，依次類推，直至第14孔吸取120 μl混合液并棄去，最后向每孔中加入1.2×108CFU/mL菌懸液120 μl。至此，第1～14孔中抗生素終濃度分別為250.00、125.00、62.50、31.30、15.60、7.81、3.91、1.95、0.98、0.49、0.24、0.12、0.061和0.031 μg/mL。設(shè)一個(gè)不加菌液的藥物為空白對(duì)照組和一個(gè)加菌液不加藥液的陽性對(duì)照。30 ℃下培養(yǎng)48 h后，以用肉眼觀察無細(xì)菌生長第1個(gè)孔的藥物濃度為該藥物對(duì)受試菌株的MIC。MIC按美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)2017版微生物藥物敏感性試驗(yàn)的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)判斷。

2 結(jié)果與分析

2.1 患病黃沙鱉的臨床癥狀

觀察發(fā)現(xiàn)，病鱉行動(dòng)緩慢、四肢無力；底板充血發(fā)炎，有疥瘡和腐皮等癥狀，裙邊潰爛發(fā)炎，頸部充血腫大。解剖可見腹部有大量淡紅色腹水，腸道充血發(fā)炎，肝臟發(fā)黑變硬(圖1)。

2.2 病原菌分離結(jié)果

從病鱉的肝臟中分離獲得1株優(yōu)勢(shì)菌株，編號(hào)為GXWXAA。該菌株為革蘭氏陽性桿菌，兩端鈍圓，平均約1.0 μm×4.0 μm，呈單個(gè)或鏈狀排列；具有芽孢，芽孢呈卵圓形，位于菌體中央或近端，芽孢小于菌體橫徑，不突出于菌體外。在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基30 ℃培養(yǎng)24 h后，菌落直徑約1.64 mm，呈乳白色，表面不透明，粗糙似蠟狀，邊緣不平整；在兔血瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后呈明顯的β-溶血(圖2)。

2.3 人工感染試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 無菌濾液的人工感染試驗(yàn)結(jié)果 涂布在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的無菌濾液在37 ℃經(jīng)24 h培養(yǎng)未觀察到菌落生長。注射無菌濾液和滅菌PBS緩沖液的黃沙鱉經(jīng)15 d連續(xù)觀察，活動(dòng)和攝食正常，均未出現(xiàn)病癥或死亡。據(jù)此認(rèn)為廣西武宣縣某養(yǎng)殖場黃沙鱉患病由病毒引起的可能性較小。

2.3.2 分離菌株人工感染試驗(yàn)結(jié)果 以菌株GXWXAA制備菌懸液進(jìn)行第1次人工感染試驗(yàn)，分離純化得到的菌株命名為GXWXAA1；以GXWXAA1制備菌懸液再進(jìn)行第2次人工感染試驗(yàn)，分離純化得到的菌株命名為GXWXAA2。從圖3可看出，2次人工感染試驗(yàn)(GXWXAA和GXWXAA1的菌懸液濃度分別為5.07×107和4.95×107CFU/mL)的第2天(注射后第2天)黃沙鱉開始死亡，第2～3天為死亡高峰期，至第5～6天全部死亡，死亡率均為100.0 %，而注射滅菌PBS組觀察15 d均無黃沙鱉死亡現(xiàn)象，活動(dòng)及進(jìn)食均正常，無任何病癥。說明GXWXAA和GXWXAA1菌株對(duì)黃沙鱉均具有較強(qiáng)的致病力。

圖1 患病黃沙鱉的主要臨床癥狀Fig.1 Main symptoms of diseased Huangsha turtle

圖2 黃沙鱉病原菌株GXWXAA的革蘭氏染色結(jié)果、菌落形態(tài)和溶血性Fig.2 Gram staining morphology，colony morphology and hemolysis of strain GXWXAA of Huangsha turtle

在第1次人工感染試驗(yàn)中，大部分黃沙鱉出現(xiàn)反應(yīng)遲緩和不攝食等現(xiàn)象，解剖后可見部分黃沙鱉的喉部有潰瘍，腹腔有不同程度的腹水和腸道發(fā)炎，底板輕微發(fā)紅，外觀與自然患病黃沙鱉的癥狀基本吻合；第2次人工感染試驗(yàn)受試黃沙鱉的癥狀與第1次人工感染試驗(yàn)基本一致(圖4)，且2次人工感染試驗(yàn)分離到的菌株GXWXAA1和GXWXAA2的菌落和菌體形態(tài)與自然患病鱉分離的菌株GXWXAA一致，說明GXWXAA是引起廣西武宣縣某養(yǎng)殖場黃沙鱉發(fā)病死亡的病原菌。

2.4 細(xì)菌生化鑒定結(jié)果

使用API 50CH試劑條、API 50CHB培養(yǎng)基和API 20E試劑條(前12個(gè)項(xiàng)目)進(jìn)行細(xì)菌生化鑒定，結(jié)果(表1～2)表明，菌株GXWXAA、GXWXAA1和GXWXAA2的生理生化特征一致。經(jīng)APIWEB服務(wù)器的API 50CHB V4.0分析，菌株GXWXAA、GXWXAA1和GXWXAA2均鑒定為蠟樣芽孢桿菌，置信度為99.0 %。

圖3 2次人工感染試驗(yàn)黃沙鱉的累計(jì)死亡率Fig.3 Total mortality rate of double batches of artificial infection of Huangsha turtle

左：底板輕微發(fā)紅；中：第1次人工感染試驗(yàn)黃沙鱉解剖圖；右：第2次人工感染試驗(yàn)黃沙鱉解剖圖Left：slight rubedo of plastron；Centre：anatomical figures of Huangsha turtle in the first artificial infection test；Right：anatomical figures of Huangsha turtle in the second artificial infection test圖4 人工感染試驗(yàn)黃沙鱉的解剖癥狀Fig.4 Anatomical symptoms of Huangsha turtle in the artificial infection test

表1 菌株GXWXAA、GXWXAA1和GXWXAA2的API 50CH鑒定結(jié)果Table 1 Results of API 50CH identification of GXWUAA,GXWXAA1 and GXWXAA2 strains

注：“-”和“+”分別表示反應(yīng)為陰性和陽性，下同。

Note:‘-’ and ‘+’ represented negative and positive reaction，respectively，the same as below.

表2 菌株GXWXAA、GXWXAA1和GXWXAA2的API 20E鑒定結(jié)果Table 2 Results of API 20E identification of GXWUAA，GXWXAA1 and GXWXAA2 strains

2.5 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

對(duì)菌株GXWXAA、GXWXAA1和GXWXAA2的16S rRNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均獲得約1500 bp條帶(圖5)。測(cè)序結(jié)果表明，GXWXAA、GXWXAA1和GXWXAA2間的序列相似性均為100.0 %?；?6S rRNA序列相似性構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(圖6)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株GXWXAA、GXWXAA1和GXWXAA2與蠟樣芽孢桿菌JY5 (HQ833024)、JY7 (HQ833025)、JY9 (HQ833026)和VBE16(MG027671)聚為一支，親緣關(guān)系最近，相似性均為99.9 %；與大腸桿菌U5/41 (NR_024570)的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，相似性均為76.6 %。綜合生化鑒定結(jié)果(表1和表2)和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，確定菌株GXWXAA、GXWXAA1和GXWXAA2為蠟樣芽孢桿菌。

1：菌株GXWXAA；2：菌株GXWXAA1；3：菌株GXWXAA2；M：DL2000 DNA Marker；N：陰性對(duì)照1：Strain GXWXAA；2：Strain GXWXAA1；3：Strain GXWXAA2；M：DL2000 DNA Marker；N：Negative control圖5 16S rRNA序列的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 PCR amplification result of 16S rRNA sequence

圖6 基于16S rRNA序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree based on the 16S rRNA gene sequences similarity

2.6 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，菌株GXWXAA對(duì)各種抗生素的敏感性各不相同，其中對(duì)新霉素、恩諾沙星和多西環(huán)素等15種抗生素敏感，對(duì)頭孢曲松、環(huán)丙沙星和依諾沙星中介，對(duì)青霉素G、氨芐青霉素、復(fù)達(dá)欣、復(fù)方新諾明和多粘菌素B耐藥。MIC試驗(yàn)結(jié)果(表4)表明，菌株GXWXAA對(duì)多西環(huán)素、新霉素和恩諾沙星均敏感，其MIC排序?yàn)樾旅顾?多西環(huán)素>恩諾沙星，與K-B紙片擴(kuò)散法的判斷結(jié)果(表3)一致。

表3 菌株GXWXAA的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果(K-B紙片擴(kuò)散法)Table 3 Results of antibiotic sensitivity test of strain GXWXAA(K-B disc diffusion test)

注：S表示敏感；I表示中介；R表示不敏感，下同。

Note:S indicates sensitive；I indicates moderately sensitive；R indicates resistant，the same as below.

表4 3種藥物對(duì)菌株GXWXAA的最小抑菌濃度(μg/mL)Table 4 Minimum inhibitory concentration of three kinds of antibiotics against strain GXWXAA

3 討 論

廣義的蠟樣芽孢桿菌被稱為蠟樣芽孢桿菌群，包括蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)、炭疽芽孢桿菌(B.anthraci)和蕈狀芽孢桿菌(B.mycoides)等，這幾種細(xì)菌DNA的同源性較高，形態(tài)和生化特征較相近[23]。目前，國內(nèi)外對(duì)蠟樣芽孢桿菌的鑒定方法包括生化鑒定和分子生物學(xué)鑒定等[24]。本研究從患病黃沙鱉肝臟中分離到1株菌株GXWXAA，經(jīng)人工感染試驗(yàn)供試健康黃沙鱉感染死亡率達(dá)100.0 %；可觀察到與自然病癥相似的癥狀，且從感染發(fā)病黃沙鱉內(nèi)臟分離到與菌株GXWXAA形態(tài)、分子和生理生化特征一致的菌株，表明菌株GXWXAA是導(dǎo)致武宣縣某養(yǎng)殖場黃沙鱉患病死亡的致病菌；通過革蘭氏染色和形態(tài)特征分析發(fā)現(xiàn)，菌株GXWXAA為具有芽孢的革蘭氏陽性菌；基于16S rRNA序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹和相似性分析結(jié)果可知，菌株GXWXAA與蠟樣芽孢桿菌JY5、JY7、JY9和VBE16聚為一支，相似性均為99.9 %。綜合細(xì)菌形態(tài)特征、生理生化特征及16S rRNA序列分析結(jié)果，GXWXAA菌株鑒定為蠟樣芽孢桿菌。

蠟樣芽孢桿菌在自然界分布廣泛，已廣泛應(yīng)用于對(duì)養(yǎng)殖水質(zhì)控制[8-9]。但近年來的研究表明，蠟樣芽孢桿菌對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物和人類產(chǎn)生了廣泛的危害，除可導(dǎo)致奶牛[11]、馬[13]、豬[14]、半滑舌鰨[15]、羅非魚[16]、棘胸蛙[17]、中華鱉[18]和家蠶(Bombyxmori)[25]等多種養(yǎng)殖動(dòng)物發(fā)病死亡外，還可引起人類的眼疾、敗血癥和心腦膜炎等疾病[10]，因此，需高度關(guān)注其致病機(jī)理研究。動(dòng)物感染蠟樣芽孢桿菌后表現(xiàn)出的癥狀因種類不同而存在明顯差異。仔豬感染主要表現(xiàn)生長不良、消瘦和腹瀉[14]；家蠶感染主要表現(xiàn)上吐下瀉和中腸破裂，死亡率達(dá)100.0 %[25]；羅非魚人工感染后主要表現(xiàn)離群獨(dú)游、肛門紅腫、體表充血和腎充血發(fā)黑等，死亡率達(dá)60.0 %[16]；馬感染后表現(xiàn)皮膚發(fā)生膿腫潰瘍[13]；棘胸蛙感染后表現(xiàn)頭部真皮層腐爛、肝充血淤血，反應(yīng)變慢、食欲減退[17]；半滑舌鰨感染主要表現(xiàn)皮膚充血潰爛、腹部紅腫[15]；中華鱉感染后表現(xiàn)癥狀包括腹甲有出血斑、頸部充血腫大、四肢無力、反應(yīng)遲鈍等[18]。本研究中，蠟樣芽孢桿菌感染引起黃沙鱉發(fā)病的臨床癥狀主要為底板充血發(fā)炎、疥瘡和腐皮，裙邊潰爛發(fā)炎，頸部充血腫大，腹腔中有大量腹水，腸道充血發(fā)炎，肝臟發(fā)黑變硬等，與上述文獻(xiàn)報(bào)道其他動(dòng)物的部分發(fā)病癥狀相似，其中包括行動(dòng)緩慢、腐皮、腸道發(fā)炎和腹水等。細(xì)菌通常是通過傷口進(jìn)入機(jī)體，經(jīng)血液循環(huán)或淋巴循環(huán)引起各臟器等全身性感染[13]，推測(cè)本研究中蠟樣芽孢桿菌對(duì)黃沙鱉的感染可能也與表皮受損有關(guān)。致病性蠟樣芽孢桿菌通常攜帶腹瀉型腸毒素，如溶血素BL、非溶血性腸毒素Nhe、細(xì)胞毒素CytK、腸毒素T、腸毒素HlyⅡ及嘔吐型毒素等，而這些毒素能引起人類或動(dòng)物腹瀉或嘔吐型腸道疾病[14，25]。根據(jù)本研究中黃沙鱉的發(fā)病癥狀和分離菌株GXWXAA的溶血性推測(cè)，菌株GXWXAA可能攜帶有溶血素BL等腸毒素，從而引起黃沙鱉大量死亡。已知的蠟樣芽孢桿菌包括有益菌和致病菌，建議生產(chǎn)上加強(qiáng)對(duì)含蠟樣芽孢桿菌的微生態(tài)制劑或飼料添加劑進(jìn)行相關(guān)致病基因攜帶情況檢測(cè)和監(jiān)控，避免因使用存在致病性菌株而對(duì)養(yǎng)殖造成人為的疾病傳播、流行和損失，同時(shí)建議養(yǎng)殖戶控制黃沙鱉的養(yǎng)殖密度，防止黃沙鱉相互撕咬造成表皮受損而感染病原。

目前，抗生素仍是防控龜鱉細(xì)菌性疾病的主要手段。本研究對(duì)菌株GXWXAA進(jìn)行藥敏檢測(cè)，結(jié)果表明該菌株對(duì)新霉素等15種抗生素敏感，對(duì)頭孢曲松等3種抗生素中介，對(duì)青霉素G等5種抗生素耐藥，與黃俊云等[26]對(duì)44株醫(yī)院臨床標(biāo)本的蠟樣芽孢桿菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果(對(duì)頭孢唑林、氨芐西林、青霉素和復(fù)方新諾明的耐藥率較高，對(duì)氧氟沙星和慶大霉素敏感率較高等)相似，但與其他來源蠟樣芽孢桿菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果存在差異，如菌株GXWUAA對(duì)多西環(huán)素、鏈霉素和頭孢拉定敏感，對(duì)頭孢曲松中介，而中華鱉源蠟樣芽孢桿菌JY2、JY5、JY7和JY9對(duì)頭孢拉定和頭孢曲松均為耐藥[18]，羅非魚源蠟樣芽孢桿菌FJLF對(duì)鏈霉素中介、對(duì)多西環(huán)素耐藥[16]等?？梢?，不同地區(qū)不同動(dòng)物來源的蠟樣芽孢桿菌其藥物敏感性不完全相同，可能與各地區(qū)養(yǎng)殖戶的用藥習(xí)慣不同有關(guān)。本研究還檢測(cè)了菌株GXWXAA對(duì)多西環(huán)素、新霉素和恩諾沙星的MIC，結(jié)果顯示菌株GXWXAA對(duì)這3種國標(biāo)漁藥均為敏感，與K-B紙片擴(kuò)散法檢測(cè)結(jié)果相符，可為給藥劑量的確定提供參考依據(jù)。已有學(xué)者對(duì)鯉科魚類給藥劑量和病原菌MIC的關(guān)系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)鯉科魚類理想的給藥劑量為分離菌MIC的8.1倍[27]，但本研究未針對(duì)黃沙鱉源蠟樣芽孢桿菌的MIC確定給藥劑量，有待進(jìn)一步研究確定。建議在黃沙鱉養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中不使用抗生素預(yù)防疾病，發(fā)生病情時(shí)應(yīng)基于藥敏試驗(yàn)結(jié)果選擇內(nèi)服敏感抗生素治療，避免使用低濃度抗生素或長期使用同種抗生素[3，22，28]，以免誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。

4 結(jié) 論

引起廣西武宣縣某養(yǎng)殖場黃沙鱉發(fā)病的病原菌屬于蠟樣芽孢桿菌，建議選擇新霉素、恩諾沙星和多西環(huán)素等抗生素對(duì)患病黃沙鱉拌飼料內(nèi)服進(jìn)行治療。