限制性外切酶I(EXO1)的合成、克隆與表達

謝鈺珍，覃鴻妮，張 勇，趙文瑋

(1. 蘇州工業(yè)園區(qū)服務外包職業(yè)學院, 江蘇 蘇州 215123；2. 金唯智生物科技有限公司，江蘇 蘇州 215123)

【研究意義】基因組DNA作為真核生物最重要的遺傳物質，決定人的相貌身高特征以及疾病的發(fā)生、發(fā)展。因此，生命體遺傳信息的快速獲得對于生命科學的研究十分重要。DNA測序法是檢測基因序列的最可靠方法。PCR產物直接測序最關鍵的因素就是模板質量。但PCR 產物中往往存在多余的引物和dNTP，這些小核苷酸片段的存在會使測序的底峰特別高，嚴重影響測序結果[1-3]。【前人研究進展】核酸外切酶I(Exonuclease I, Exo1)是一種單鏈的核酸外切酶，能夠按照3'→5’的方向水解單鏈DNA，釋放5'-單核苷酸并保持末端 5'-二核苷酸完整[4]。因其可降解 PCR 混合物中的所有單鏈 DNA，所以在涉及測序或標記方法應用的 PCR 產物制備中極為有用。【本研究切入點】目前，由于表達量低、提純步驟繁瑣、得率低等因素的制約，商品化的核酸外切酶價格居高不下。而國內外研究中所使用的Exo1主要從各商業(yè)公司購置，對于開展大量測序工作的實驗室來說，科研成本昂貴?！緮M解決的關鍵問題】本研究通過重疊PCR技術體外合成sbcB基因，構建重組質粒后導入大腸桿菌，通過條件優(yōu)化，實現該酶的異源大量表達，通過消化單鏈DNA和雙鏈DNA驗證其活性，旨在設計一種簡單、高效和低成本的核酸外切酶I制備方法，為更多核酸酶的實驗室制備提供科學的參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 目的基因 sbcB基因編碼的是核酸外切酶I，基因總長度為1428 bp，序列如圖1。

1.1.2 菌株、質粒 載體質粒pET-30a，感受態(tài)細胞E.coliTop10，E.coliBL21(DE3)購自Novagen公司，T 7 expressionE.coli由本實驗室保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 目的基因的合成 ①重疊PCR合成sbcB基因:根據基因序列設計了42條引物，委托金唯智生物科技有限公司完成合成。將引物稀釋到10 pmol/μl，每條引物取3 μl混勻作為引物混液(mix)，通過2輪PCR擴增出目的基因。PCR擴增體系及程序見表1。②PCR產物的檢測與回收:吸取50 μl的二輪PCR產物點入濃度為1.5 %的回收膠，電泳儀220 V，280 mA電泳20 min。回收產物即所得目的基因。

圖1 sbcB基因序列Fig.1 The sequence of sbcB gene

表1 PCR體系和PCR程序Table 1 PCR system and PCR procedure

1.2.2 重組表達載體的構建及轉化 ①將質粒pET30a用NdeI 和KpnI酶切，酶切體系見表2；酶切體系配好后，37 ℃水浴鍋反應30 min。瓊脂糖凝膠電泳切膠回收。②將酶切后的表達載體pET-30a與sbcB基因進行連接，構建重組載體pET-30a-sbcB。連接體系見表3。PCR儀50 ℃連接60 min后，將連接產物轉化至Top10感受態(tài)中，37 ℃過夜培養(yǎng)。

表2 酶切反應體系Table 2 Enzyme digestion system

1.2.3 陽性克隆的篩選與鑒定 挑取24個單克隆37 ℃擴大培養(yǎng)，利用菌落PCR擴增目的基因(菌檢體系及程序見表4)，電泳檢測到目的條帶的克隆送測序進一步驗證。

表3 重組反應體系(20 μl)Table 3 Recombination reaction system(20 μl)

表4 菌檢PCR反應體系及程序Table 4 Reaction system and procedure of Colony PCR

1.2.4 重組質粒在大腸桿菌中的表達及純化 將測序正確的陽性重組質粒轉化至BL21(DE3)中，菌液涂布于含kan抗性的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過夜。選取多個重組菌落接種LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r/min培養(yǎng)至OD值為0.6～0.8時，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG繼續(xù)誘導2 h。離心，收集菌體。將誘導后的菌體重懸于lysisbuffer，超聲破碎后離心去沉淀，收集樣品液。蛋白純化機純化蛋白。10 %聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定表達產物，檢測表達產物的分子量及純化效果。

1.2.5 表達產物的功能驗證 以S1核酸外切酶為標準對照，分別用該酶和表達產物EXO1酶消化僅含單鏈DNA的樣本(stap-tri-ssDNA)和單雙鏈混合的DNA樣本(DSG-SSDNA)，瓊脂糖凝膠電泳檢測消化結果。

2 結果與分析

2.1 目的基因的合成

因目的基因總長1428 bp，為了提高合成成功率，分兩段進行合成。目的基因的電泳檢測結果如圖2所示，sbcb(1～22)和sbcb(21～42)的理論值分別為785和791 bp。從圖上可看出擴增的條帶大小均在750～1000 bp之間，與預期理論值基本相符，可判斷目的基因擴增成功。

1～4為sbcb(1～22)重復樣；5～8為sbcb(21～42)重復樣，M為DNA 5000 Marker1-4: Amplification of sbcB(1-22);5-8: Amplification of sbcB(21-42);M:DNA 5000 Marker圖2 sbcB基因PCR擴增產物Fig.2 PCR amplification of sbcB gene

圖3 重組表達載體菌落Fig.3 Bacterial colony of pET-30a-sbcB

2.2 重組質粒載體pET-30a-sbcB的篩選與鑒定

2.2.1 LB固體培養(yǎng)基菌落生長情況 經隔夜培養(yǎng)，固體培養(yǎng)基上長出了菌落，菌落白色圓潤無其他雜菌(圖3)，挑選出單斑進行菌檢PCR。

2.2.2 菌落PCR電泳圖 菌檢時使用的引物為T7和T7T，這是一對在載體pet30a與目的產物連接處附近最恰當的引物，菌檢出的目的條帶的大小應為1674 bp。從電泳圖上可以看出，大部分克隆的大小在1500～2000 bp之間，與理論值相符(圖4)。隨機挑取4個大小相符的克隆測序，結果與目的基因序列一致，陽性克隆篩選成功。

2.3 重組蛋白的表達與純化

重組pET-30a-sbcB質粒在大腸桿菌BL21中以胞內可溶性形式高效表達。超聲破菌后，經親和柱層析，15 %SDS-PAGE鑒定顯示目的蛋白。從圖5可以看出，表達產物在54.5 KD處呈現清晰的蛋白帶，分子量大小與預期結果一致，蛋白純化成功。

2.4 表達產物的功能驗證

2.4.1 消化單鏈DNA樣本(stap-tri-ssDNA) stap-tri-ssDNA大小為350 bp左右。從圖6看出，陽性對照(Line4)條帶正常，說明樣品沒問題。Line2和Line3 350 bp處均無條帶，說明EXO1和S1一樣，能去除單鏈。且由Line1和Line2的對比可顯示出，EXO1對于單鏈的去除有非常重要的作用，有FastAP無EXO1，則無法去除單鏈。

圖4 菌落PCR產物Fig.4 Colony PCR products

M：低分子量標準蛋白質；1：BL21(DE3)/pET-30a-sbcB 的誘導表達產物M：Low molecular protein marker；1：Induced expression of BL21(DE3)/pET-30a-sbcB圖5 重組表達載體pET-30a-sbcB誘導表達蛋白的SDS-PAGEFig.5 SDS-PAGE of induced recombinant pET-30a-sbcB

Line1為只加FastAP、未加EXO1消化后條帶；Line2為有FastAP和EXO1存在下的消化后條帶；Line3為S1消化后條帶；Line4為未加任何酶消化的stap-tri-ssDNA條帶Line1: The result of the functioning of FastAP without EXO1;Line2: The result of the functioning of FastAP with EXO1;Line3: The result of the functioning of Exonucleases S1;Line4: Blank control圖6 S1核酸外切酶和EXO1分別消化stap-tri-ssDNA結果圖Fig.6 Digestion products of stap-tri-ssDNA

2.4.2 消化單雙鏈DNA混合樣本(DSG-SSDNA) DSG-SSDNA樣品中既有單鏈又含有雙鏈，雙鏈條帶大小理論值為594 bp，單鏈條帶大小理論值為400 bp。由圖7可以看出，陽性對照Line3明顯有兩條帶，大小與理論值相符，說明樣品及加樣操作無問題。Line1和Line2只有1條帶，大小594 bp左右，說明樣品中的單鏈均被消化掉了。證明表達產物EXO1和S1核酸外切酶一樣，可消化單鏈，但并不會消化雙鏈。

3 結論與討論

核酸外切酶是一類能從多核苷酸鏈的一端開始按序催化水解3’-5’-磷酸二酯鍵，降解核苷酸的酶，其水解的最終產物是單個核苷酸。按作用的特性差異可將其分為單鏈的核酸外切酶和雙鏈的核酸外切酶。核酸外切酶I(Exonuclease 1, EXO1)屬于單鏈的核酸外切酶，能夠從單鏈DNA(ssDNA)的3’-OH到5’-P末端逐個催化水解堿基對之間的磷酸二酯鍵，釋放5'-單核苷酸并保持末端 5'-二核苷酸的完整。EXO1除了參與DNA復制、DNA錯配修復(MMR)以及DNA雙鏈斷裂修復等過程外，還與肝癌、肺癌、卵巢早衰等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關[5-7]。

近年來，隨著基因組學研究的深入，測序技術發(fā)展迅猛[8]。PCR產物作為常見的測序模板，其質量直接影響測序結果。有研究證實，純化后的PCR產物測序的成功率及測序質量明顯高于非純化的PCR產物。因此，要得到理想的測序結果，必須在測序前對PCR產物進行純化，以清除PCR反應中殘留的dNTPs、引物和鹽離子。因核酸外切酶 I 可降解原PCR反應中殘存的的單鏈引物和任何在PCR中產生的外來單鏈DNA。蝦堿性磷酸酶(SAP)可去除PCR混合物中殘留的dNTPs，SAP-EXO1純化法成為了測序前PCR產物處理的常用方法之一[9]。縱觀國內外研究，實驗用EXO1大多購自商業(yè)公司，雖然該法操作簡單、快捷，昂貴的EXO1一定程度上限制了其應用。若能自行合成，并高效表達目的蛋白，可極大程度的降低科研成本。

Line1為EXO1酶消化后的條帶；Line2為S1核酸外切酶消化后的條帶；Line3是空白對照，為未加任何酶消化的DSG-SSDNA條帶；Line4為MarkerLine1: The result of the functioning of EXO1;Line2: The result of the functioning of Exonucleases S1;Line3: Blank control;Line4: Marker圖7 S1核酸外切酶和EXO1酶分別消化DSG-SSDNA結果圖Fig.7 Digestion products of DSG-SSDNA

sbcB基因，一種大腸桿菌中的核酸外切酶I，天然存在于E.colik-12中。由于生長環(huán)境及其他因素的影響，目的蛋白表達嚴重受限，表達量低。大腸桿菌T7噬箘體有一套專一性非常強的轉錄體系，利用這一體系中的元件為基礎構建的表達系統(tǒng)稱為T7表達系統(tǒng)。T7噬箘體基因1編碼的T7 RNA聚合酶選擇性的激活T7噬箘體啟動子的轉錄。它是一種高活性的RNA聚合酶，合成mRNA的速度比大腸桿菌RNA聚合酶快5倍，并可以轉錄某些不能被大腸桿菌RNA聚合酶有效轉錄的序列。在細胞中存在T7 RNA聚合酶和T7噬箘體啟動子的情況下，大腸桿菌宿主本身基因的轉錄競爭不過T7噬箘體轉錄體系，最終受T7噬箘體啟動子控制的基因的轉錄能達到很高的水平[10-11]。因此本研究首先用重疊PCR技術體外人工合成sbcB基因，成功構建重組載體sbcB-pET-30a后再將該質粒轉化到BL21(DE3)感受態(tài)中，誘導表達并獲得目的蛋白。因BL21(DE3)大腸桿菌的染色體中已經被整合了編碼T7RNA聚合酶的基因，并且位于LacUV5啟動子的下游，所以在質粒轉入后，T7RNA能夠特異性識別T7啟動子，開啟下游基因的轉錄，最終實現了目的蛋白(EXO1)的高效表達。后續(xù)的功能驗證也證實：EXO1可消化單鏈且不會消化雙鏈，能夠適用于實驗室中測序前PCR產物的處理，并且在單鏈DNA QC時或許可以代替S1核酸外切酶。事實上EXOI酶的功能遠不止這些，該酶的成功表達為后續(xù)更深入的功能研究奠定了良好基礎，也為其他核酸酶的發(fā)現與成功克隆提供了一定的參考價值。