Hcy水平無明顯差異的H型高血壓患者M(jìn)THFR C677T基因多態(tài)性與腦卒中的相關(guān)性*

盧宏艷，張晉，趙英，索麗，李書華，解娜，孫艷玲，武劍

(1.房山區(qū)第一醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，北京 102400；2.清華大學(xué)附屬北京清華長(zhǎng)庚醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，北京 102218)

隨著我國人口老年化以及生活水平的提高，我國腦卒中的發(fā)病率逐年升高，2017年我國腦卒中發(fā)病率為24.68/萬人、死亡率為11.48/萬人[1]，并有流行病學(xué)調(diào)查顯示，每年我國腦卒中發(fā)病率為379/10萬，124/10萬人死于腦卒中，且每年以8.3%的速度上升[2]。腦卒中有很多的危險(xiǎn)因素，提前識(shí)別危險(xiǎn)因素并進(jìn)行干預(yù)可預(yù)防80%的腦卒中發(fā)生[3]。在報(bào)道的所有危險(xiǎn)因素中高血壓和高同型半胱氨酸(hyperhomocysteinemia，Hhcy)居于首位，高血壓可刺激血管、引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化，而同型半胱氨酸(Hcy)則能激活細(xì)胞組分，抑制血管內(nèi)皮修復(fù)，促進(jìn)炎癥因子的產(chǎn)生，引起內(nèi)膜增厚和血小板聚集，從而損傷血管[4]。同時(shí)，Hcy還能通過影響血管緊張素轉(zhuǎn)化酶Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)的活性、一氧化氮(NO)的濃度、刺激血管平滑肌增生、降低血管順應(yīng)性及增加循環(huán)阻力而加重高血壓。有75%的高血壓患者伴有Hhcy血癥(Hcy>10 μmol/L)，稱之為H型高血壓。有研究表明，收縮壓每升高10 mmHg可使腦卒中危險(xiǎn)性可增加49%[5]，而Hhcy血癥合并高血壓可使腦卒中風(fēng)險(xiǎn)增加12.1倍。亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)是Hcy甲基化途徑的關(guān)鍵酶，通過將5,10-亞甲基四氫葉酸還原為5-甲基四氫葉酸，后者為Hcy甲基化的供體[6-7]。故MTHFR的穩(wěn)定性改變可使Hcy甲基化減慢而濃度升高，導(dǎo)致Hhcy血癥。目前研究發(fā)現(xiàn)MTHFR至少有65個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)，其中最常見的是第4個(gè)外顯子的第677位T(胸腺嘧啶)和C(胞嘧啶)突變。近年來對(duì)MTHFRC677T基因多態(tài)性與Hcy水平的研究備受關(guān)注，認(rèn)為MTHFRC677T基因是Hcy濃度增高的影響因素，但在Hcy水平無明顯差異的情況下，MTHFRC677T基因與腦卒中的關(guān)系尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究以H型高血壓患者為研究對(duì)象，探討MTHFRC677T基因多態(tài)性與H型高血壓發(fā)生腦卒中的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象

選取2016年1月-2017年12月因急性腦卒中入院的合并H型高血壓的患者500例做病例組，根據(jù)第四屆全國腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議關(guān)于腦卒中標(biāo)準(zhǔn)診斷，按血Hcy水平，以每2 μmol/L為梯度進(jìn)行分層，以性別和年齡為匹配條件；選取同期就診的且從未發(fā)生腦卒中的500例H型高血壓患者做對(duì)照組。本研究方案經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所入患者均簽署知情同意書。入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《中國高血壓防治指南2010》高血壓診斷標(biāo)準(zhǔn)，(2)確診為H型高血壓的患者(血Hcy≥10 μmol/L或正在進(jìn)行降Hcy治療)，(3)簽署知情同意書。排出標(biāo)準(zhǔn)：(1)存在腦腫瘤、腦血管畸形、非血管性腦卒中及創(chuàng)傷等患者，(2)存在明顯其他軀體疾病、異常實(shí)驗(yàn)室檢查、或研究者認(rèn)為不適合入組的患者，(3)嚴(yán)重精神疾病、或無法表達(dá)意愿患者，(4)無法長(zhǎng)期隨訪者。病例組中男326例、女174例，年齡46～73歲、平均(58±6.83)歲，平均Hcy(19.7±7.98)μmol/L；對(duì)照組中男305例、女195例，年齡42～69歲、平均(55±7.93)歲，平均Hcy(19.3±8.07)μmol/L；2組患者一般基礎(chǔ)資料比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。病例組的腦卒中包括缺血性腦卒中、出血性腦卒中382例，其余類型118例；按照TOAST分型，大動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死104例、小動(dòng)脈閉塞性腦梗死232例、心源性腦梗死4例、其他原因腦梗死42例及出血性腦卒中118人；均根據(jù)2014年的腦出血和腦缺血的診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)頭顱CT或MRI證實(shí)。

1.2方法

1.2.1資料收集 所有患者在入組后進(jìn)行問卷調(diào)查，登記年齡、性別、血壓、心率、身高、體質(zhì)量、吸煙史、飲酒史及基礎(chǔ)疾病等，觀察患者心電圖；收集血樣本(全血8 mL)-20℃冷保存，檢測(cè)血Hcy、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、三酰甘油(TG)、血糖(GLU)濃度，測(cè)定患者M(jìn)THFRC677T基因型。所取血樣均為禁食12 h后的空腹血樣。

1.2.2Hcy水平檢測(cè) Hcy檢測(cè)試劑盒(速率法)購自秦樂德醫(yī)療有限公司，取血樣本5 mL恢復(fù)室溫后，于3 500 r/min離心20 min，采用循環(huán)酶法檢測(cè)Hcy水平。

1.2.3MTHFR基因分型檢測(cè)MTHFR基因檢測(cè)試劑盒購自北京旌準(zhǔn)醫(yī)療科技有限公司，取血樣本2 mL按DNA試劑盒說明書提取DNA，按照MTHFR基因檢測(cè)試劑盒說明書要求進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取產(chǎn)物進(jìn)行酶切，用2%瓊脂糖凝膠電泳分析酶切結(jié)果。根據(jù)酶切結(jié)果分為3種基因型：含有174及72 bp片段為TT純合子，含有246、174及72 bp片段為CT雜合子，含有246 bp片段為CC純合子。

1.3觀察指標(biāo)

比較2組患者一般基線資料(糖尿病、房顫、飲酒及吸煙人數(shù))、體格檢查指標(biāo)[收縮壓、舒張壓、心率及體質(zhì)量指數(shù)(BMI)]及實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)[血TC、HDL-C、TG及LDL-C]，比較2組患者M(jìn)THFRC677T基因型及等位基因頻率；以有無卒中為因變量，將P<0.1的因素作為自變量，納入Logistic回歸分析，分析H型高血壓患者發(fā)生腦卒中的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1一般基線資料、體格檢查及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)

2組患者糖尿病、房顫及飲酒人數(shù)等一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但病例組的吸煙人數(shù)明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；2組患者體格檢查指標(biāo)中的收縮壓、舒張壓、心率及BMI比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；2組患者實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)中的血TC、HDL-C及TG濃度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但病例組的LDL-C濃度明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組患者一般基線資料、體格檢查及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較Tab.1 Comparison of baseline data,physical examination and laboratory indicators between the two groups

2.2MTHFRC677T基因型及等位基因頻率

經(jīng)檢驗(yàn)，2組患者的C677T基因頻率均符合Hardy-weinberg平衡定律，均具有群體代表性。結(jié)果顯示，2組患者CC、CT基因型，C、T等位基因頻率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；病例組患者CC、CT的TT基因型明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組患者M(jìn)THFR C677T基因型及等位基因頻率比較Tab.2 Comparison of MTHFR C677T genotype and allele frequency between the two groups

2.3腦卒中多因素Logistic回歸分析

以有無發(fā)生腦卒中為因變量，將P<0.1的吸煙、收縮壓、LDL-C濃度及TT基因型為自變量，納入Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，吸煙、高LDL-C血癥及TT基因型是H型高血壓患者發(fā)生腦卒中的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表3。

表3 腦卒中多因素Logistic回歸分析Tab.3 Multivariate Logistic regression analysis of stroke

3 討論

Hcy主要由食物獲取，經(jīng)食物蛋白中的甲硫氨酸轉(zhuǎn)化生成，為甲硫氨酸和半胱氨酸在生物合成中的正常中間產(chǎn)物。Hcy可促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展，是心腦血管疾病的獨(dú)立性危險(xiǎn)因素[8]，血清Hcy水平越高,腦血管及神經(jīng)損傷程度越高[9]。有研究表明，血Hcy濃度每增高5 μmol/L，可使腦卒中風(fēng)險(xiǎn)增加59%，每降低3 μmol/L，可使腦卒中風(fēng)險(xiǎn)下降29%[10]。從目前的研究來看，Hcy的升高可從多種途徑增加腦卒中的發(fā)生率，機(jī)制為：(1)主要以氧化形式存在的Hcy，可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮產(chǎn)生氧化應(yīng)激，刺激血管內(nèi)皮，引起血管重構(gòu)、使血管內(nèi)皮增厚、硬化而易堵塞、破裂[11]；(2)Hcy可抑制凝血酶調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)，并激活血小板、抑制纖溶活性，使血液粘稠，誘導(dǎo)血栓生成[12-13]；(3)Hcy通過氧化應(yīng)激而刺激血管收縮，減少NO生成及利用，降低血管順應(yīng)性而致高血壓[14]；(4)Hhcy可使5-甲基四氫葉酸去甲基化生成四氫葉酸，而四氫葉酸是促進(jìn)蛋白合成發(fā)育的重要物質(zhì)，四氫葉酸減少能減弱受損內(nèi)皮的修復(fù)能力，加重血管損傷;(5)Hhcy可逆向轉(zhuǎn)化生成S-腺苷Hcy，S-腺苷Hcy可抑制基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基轉(zhuǎn)移酶，影響啟動(dòng)子正常甲基化，干擾基因正常表達(dá)，促進(jìn)疾病發(fā)展[15]。所以Hcy的升高是腦卒中的一個(gè)危險(xiǎn)因素。Hcy通常有2種去路，一種是在MTHFR以及甜菜堿的作用下甲基化變成蛋氨酸，另一種途徑是在胱硫醚β合酶(CBS)的作用下與絲氨酸生成不可逆的胱硫醚，影響其代謝的酶主要有MTHFR、CBS、蛋氨酸合成酶(MS)等，任何一個(gè)關(guān)鍵酶受損都會(huì)影響Hcy升高。腦血管因缺少甜菜堿甲基化的保護(hù)作用，因此5,10- MTHFR的活性改變是腦卒中的常見影響因素。目前發(fā)現(xiàn)的MTHFR基因型有MTHFRC677T基因型、MTHFRA1298C基因型、MTHFRA66G基因型及MTHFD1 G158A基因型等，其中最常見的是C677T基因型突變，其對(duì)血Hcy濃度的影響最大。

本研究發(fā)現(xiàn)，腦卒中患者的TT基因型明顯多于未發(fā)生腦卒中的患者，進(jìn)一步Logistic分析顯示，TT基因型是H型高血壓發(fā)生腦卒中的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。該結(jié)果與眾多研究結(jié)果一致。目前有研究表明，該位點(diǎn)突變使MTHFR中的丙氨酸在轉(zhuǎn)錄的過程中被纈氨酸替代，使MTHFR具有不穩(wěn)定性[16-17]，有研究指出，MTHFRC677T基因的TT型能使MTHFR的酶活性降低70%，而CT型能使MTHFR酶活性降低35%[18]，這一原因可以解釋為何TT基因型和CT基因型患者血Hcy濃度升高。但本研究還發(fā)現(xiàn)，即便Hcy水平無明顯差異，MTHFR基因的TT基因型仍能增加腦卒中風(fēng)險(xiǎn)。另外，根據(jù)本研究Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，吸煙和高LDL-C血癥也是患者發(fā)生腦卒中的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。該研究的不足之處在于沒有記錄患者的治療方案對(duì)腦卒中發(fā)生率的影響，也沒有記錄患者的飲食、生活習(xí)慣，可能會(huì)對(duì)研究結(jié)果有一些干擾。目前的H型高血壓的主要治療方案為降壓聯(lián)合補(bǔ)充葉酸，合并或不合并B族維生素(維生素B12與維生素B6)。國外Meta分析顯示，強(qiáng)化補(bǔ)充葉酸可以使血漿Hcy的濃度降低23%，同時(shí)補(bǔ)充維生素B12可以使Hcy濃度降低30%[19]。一項(xiàng)針對(duì)中國人群的飲食調(diào)查結(jié)果顯示，在補(bǔ)充了葉酸的條件下，可使腦血管疾病的死亡率減少37%。但是不同基因型的患者對(duì)補(bǔ)充葉酸的敏感性不同[20]。Zeng等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在相同飲食的條件下，TT基因型女性患者的Hcy水平對(duì)補(bǔ)充葉酸敏感，而CC基因型和CT基因型對(duì)補(bǔ)充葉酸的敏感性較差，這類患者補(bǔ)充維生素B12較好。也有研究報(bào)道，大劑量補(bǔ)充葉酸可能會(huì)增加前列腺癌和肺癌的發(fā)生率，也會(huì)加重糖尿病和腎功能不全患者的負(fù)擔(dān)[22]。因此早期識(shí)別H型高血壓患者的MTHFR基因型，選擇合理的飲食方案進(jìn)行個(gè)體化干預(yù)，才能有效減小發(fā)病率，減少不良反應(yīng)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)H型高血壓發(fā)生急性腦卒中的患者中吸煙人數(shù)、血LDL-C濃度及TT基因型明顯高于H型高血壓患者；吸煙、高LDL-C血癥及TT基因型是H型高血壓患者發(fā)生腦卒中的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。說明MTHFRC677T基因多態(tài)性影響H型高血壓的腦卒中發(fā)生率，TT基因型是H型高血壓患者發(fā)生腦卒中危險(xiǎn)因素。但該研究結(jié)果不排除以下影響因素：(1)Hcy濃度受食物、生活等多種因素影響，而本研究所調(diào)查的卒中患者Hcy值為入院時(shí)Hcy值，非腦卒中患者的Hcy值為門診就診時(shí)的Hcy值，不排除研究是否受入院的規(guī)律化飲食及生活影響；(2)本研究只采取一次樣本，MTHFR基因的TT基因型的患者更容易導(dǎo)致Hcy升高，Hcy處于較高水平的時(shí)間可能比其他基因型長(zhǎng)，對(duì)血管損傷更嚴(yán)重，更容易發(fā)生心腦血管終點(diǎn)事件。因此，具體原因還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。