VPS13A基因突變致舞蹈病-棘紅細(xì)胞增多癥的診斷及家系研究*

姚念廷，鄭乾，馮占輝，尹建紅，徐子茜，焦玲*，張春林

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 神經(jīng)內(nèi)科，貴州 貴陽(yáng) 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550004)

舞蹈病—神經(jīng)棘紅細(xì)胞增多癥(chorea-acanthocytosis,ChAc)是一種臨床罕見(jiàn)的以舞蹈樣動(dòng)作和外周血棘紅細(xì)胞增多為典型特征的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)主要為口、舌、面不自主運(yùn)動(dòng)、進(jìn)行性舞蹈樣運(yùn)動(dòng)障礙、精神癥狀、認(rèn)知功能下降以及其他多系統(tǒng)損害[1]。該病臨床表現(xiàn)形式多樣，可累及運(yùn)動(dòng)、神經(jīng)、精神以及內(nèi)分泌等全身多個(gè)系統(tǒng)[2-6]，與麥克勞德綜合征(mcLeod neuroacantho cytosis syndrome，MLS)、類亨廷頓病2型(huntington’s disease-like 2，HDL2)、泛酸激酶相關(guān)的神經(jīng)退行性(pantothenate kinase—associated neurodegeneration，PKAN)等疾病的臨床癥狀、實(shí)驗(yàn)室檢查及影像學(xué)表現(xiàn)上存在較多的重疊，其臨床診斷比較困難[7]。目前ChAc還沒(méi)有具體的診斷標(biāo)準(zhǔn)，但ChAc的早期診斷至關(guān)重要，外周血棘紅細(xì)胞是該病的重要特征性的診斷依據(jù)，而分子生物學(xué)及基因檢測(cè)是ChAc診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[8-10]。ChAc是常染色體隱性遺傳疾病[5,7,11]，液泡蛋白分類同源物13A(vacuolar protein sorting homolog 13A,VPS13A)基因是目前唯一與ChAc相關(guān)的致病基因[10,12]，目前已報(bào)道VPS13A基因突變形式多樣化，包括錯(cuò)義突變、無(wú)義突變、移碼突變、缺失或插入突變等，這些不同類型的突變?cè)黾恿薈hAc遺傳診斷復(fù)雜性[5,13]。因ChAc為十分罕見(jiàn)的遺傳病，故本研究通過(guò)收集的1例疑似ChAc病例及其家系的臨床資料，同時(shí)利用掃描電鏡檢測(cè)外周血棘紅細(xì)胞及全外顯子目標(biāo)序列捕獲2代測(cè)序技術(shù)鑒定其基因突變點(diǎn)，探討ChAc的診斷方法，為ChAc的精準(zhǔn)診斷提供可行合理的策略，以期避免誤診或漏診。

1 對(duì)象和方法

1.1研究對(duì)象、主要試劑和儀器

1.1.1研究對(duì)象 收集某院1例臨床表現(xiàn)疑似ChAc先證者及其家系資料，其中先證者符合以下ChAc診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，即肢體舞蹈樣動(dòng)作，口周和(或)口下頜肌張力障礙及進(jìn)食性肌張力障礙，口唇自噬動(dòng)作，顱腦MRI可見(jiàn)尾狀核頭萎縮，血生化提示肌酸激酶(creatine kinase,CK)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzymes，CK-MB)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)及谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)均升高。先證者(Ⅱ3)29歲、男性、漢族、既往體健，先證者父親(Ⅰ1)57歲、漢族，先證者母親(Ⅰ2)55歲、漢族，先證者哥哥(Ⅱ1)35歲時(shí)去世、漢族，先證者姐姐(Ⅱ2)32歲、漢族。

1.1.2主要試劑和儀器 2.5%戊二醛固定液(上海釜誠(chéng)生物科技有限公司)，0.1 mol/L PBS緩沖液(北京百奧萊博科技有限公司)，50%、70%、80%、90%和100%酒精(北京柏奧易思生物科技有限公司)，標(biāo)準(zhǔn)文庫(kù)構(gòu)建試劑盒(北京邁基諾基因科技股份有限公司)，DNA 提取試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)，Illumina標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序試劑盒(美國(guó)NEB公司)；XL-30掃描電鏡(荷蘭PHILIPS公司)，BAL-TEC SCD離子濺射儀(瑞士BAL-TEC公司)，Covaris S2超聲儀(美國(guó)Covaris公司)，ABI 3730XL測(cè)序儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)，Nanodrop 2000 樣本定量檢測(cè)儀(美國(guó)Thermo Fisher科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1先證者臨床信息 收集先證者基本臨床資料、實(shí)驗(yàn)室和影像學(xué)結(jié)果，詢問(wèn)并記錄家系情況并繪制家系圖。

1.2.2電鏡檢查 提取先證者保留外周靜脈血1～2滴加入5 mL新鮮配制的質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛固定液中，輕輕振蕩后靜置于4 ℃冰箱0.5 h，取適量已固定好血樣置于1.5 mL離心管，1 500 r/min低速離心15 min去上清，0.1 mol/L PBS緩沖液漂洗3次、5 min/次，體積分?jǐn)?shù)50%、70%、80%、90%及100%酒精(2次)脫水，加入適量無(wú)水乙醇混勻，滴于潔凈蓋玻片上，室溫自然干燥；用雙面膠帶將干燥后的蓋玻片粘貼在樣品臺(tái)上，利用BAL-TEC SCD離子濺射儀噴金，利用PHILIPS XL-30掃描電鏡觀察棘紅細(xì)胞。

1.2.3篩查致病基因 (1)DNA提取、基因組文庫(kù)構(gòu)建、基因的捕獲及高通量測(cè)序：提取先證者保留外周靜脈血2 mL，使用基因組DNA提取試劑盒對(duì)樣本DNA進(jìn)行核酸提?。蝗∠茸C者的DNA 3 μg稀釋，采用Covaris S2超聲儀進(jìn)行超聲片段化(大小150 bp)；用標(biāo)準(zhǔn)文庫(kù)構(gòu)建試劑盒制備全基因組文庫(kù)，用Nanodrop 2000樣本定量檢測(cè)儀進(jìn)行質(zhì)控；采用GenCap技術(shù)(北京邁基諾基因科技有限責(zé)任公司)捕獲目的基因，用Illumina NextSeq 500進(jìn)行測(cè)序。(2)數(shù)據(jù)篩選和生物信息學(xué)分析：目標(biāo)區(qū)域測(cè)序后，去除測(cè)序數(shù)據(jù)中的接頭和低質(zhì)量數(shù)據(jù) (質(zhì)量值≤20) ，運(yùn)用BWA軟件比對(duì)參考基因組，用GATK軟件對(duì)各個(gè)樣本的比對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多態(tài)性位點(diǎn)的檢測(cè)，對(duì)單核苷酸多態(tài)性( single nucleo- tide polymorphisms，SNPs)和插入缺失突變 (InDels)等數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析；同時(shí)進(jìn)行測(cè)序深度、均一性、探針特異性等數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析；查找SNPs及In-Dels 在千人基因組(http://www.1000genomes.org/)及dbSNP132(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pro-jects/SNP/)數(shù)據(jù)庫(kù)中頻率，利用PolyPhen-2軟件(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)進(jìn)行SNPs及InDels 致病性分析。(3)Sanger測(cè)序驗(yàn)證：根據(jù)需要測(cè)序的DNA片段合成引物，用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)法進(jìn)行擴(kuò)增，用ABI 3730xl 測(cè)序儀以Sanger測(cè)序法進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序后的結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果

2.1先證者的臨床資料和家系圖

先證者(Ⅱ3)，29歲男性，因“進(jìn)行性口面部、四肢不自主運(yùn)動(dòng)2+年，加重半年”于2018年11月22日入院。2+年前先證者無(wú)明顯誘因逐漸出現(xiàn)伸舌、磨牙、扮鬼臉、頭部擺動(dòng)及四肢舞蹈等不自主動(dòng)作，伴反復(fù)下唇咬傷、潰瘍，近半年癥狀逐漸加重，伴吞咽困難，無(wú)法進(jìn)食。神經(jīng)系統(tǒng)查體：言語(yǔ)欠流暢、吐詞含混，張口稍受限，口唇及舌尖有多處咬傷、潰瘍；眼周、口周、頸部、四肢可見(jiàn)不自主運(yùn)動(dòng)；頸部肌張力增高，雙上肢肌力減退，四肢腱反射減弱，四肢共濟(jì)運(yùn)動(dòng)欠穩(wěn)準(zhǔn)。輔助檢查CK、CK-MB、LDH、ALT及AST均升高。神經(jīng)傳導(dǎo)檢查回示感覺(jué)性周圍神經(jīng)損害，顱腦MRI可見(jiàn)尾狀核頭輕度萎縮。先證者哥哥(Ⅱ1)，35歲去世，生前癥狀與先證者一致；先證者父親(Ⅰ1)，先證者母親(Ⅰ2)，近親結(jié)婚，體??；先證者姐姐(Ⅱ2)，體健。見(jiàn)圖1、圖2。

先證者 正常人注：箭頭所指為尾狀核頭。圖1 先證者與正常人的顱腦MRI圖像對(duì)比Fig.1 Comparison of MRI images between the proband's and normal human's brain

圖2 先證者家系圖Fig.2 Family map of the proband

2.2先證者外周血紅細(xì)胞的掃描電鏡

先證者外周血掃描電鏡結(jié)果可見(jiàn)典型棘紅細(xì)胞(正常人外周血無(wú)棘紅細(xì)胞)。見(jiàn)圖3。

注：A為放大倍數(shù)6 000×，B為放大倍數(shù)10 000×；箭頭所示為典型棘紅細(xì)胞。圖3 先證者外周血紅細(xì)胞掃描電鏡結(jié)果Fig.3 Scanning electron micrograph of peripheral blood red blood cells in the proband

2.3致病基因篩查

通過(guò)高通量全外顯子測(cè)序和突變位點(diǎn)生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，先證者檢測(cè)出VPS13A基因且存在c.9403C>T純合突變(基因型為TT純合子)，引起chorein蛋白p.R3135X突變，為無(wú)義突變；SIFT數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)結(jié)果為“damaging”，PolyPhen-2數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)結(jié)果為“probably damaging”。先證者的父親和母親均為c.9403C>T雜合突變。見(jiàn)圖4。

圖4 先證者及其父母VPS13A基因核苷酸c.9403C>T突變位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果Fig.4 Sequencing of nucleotide mutations c.9403C>T in the VPS13A gene of proband and his parents

3 討論

神經(jīng)—棘紅細(xì)胞增多癥 (neuroacanthocytosis，NA) 是一類罕見(jiàn)的神經(jīng)遺傳性疾病，具有低患病率和高臨床變異性的特點(diǎn)[9]。NA可分為ChAc、MLS、HDL2和PKAN4種亞型[14-15]，其中以ChAc最多見(jiàn)[16]。ChAc常見(jiàn)于20～30歲人群，臨床表現(xiàn)包括[14,17-18]：(1)運(yùn)動(dòng)過(guò)多型運(yùn)動(dòng)障礙，如肢體舞蹈樣動(dòng)作，口腔、面、舌不自主運(yùn)動(dòng)，進(jìn)食性肌張力障礙、扮鬼臉、怪異表情等為該病最常見(jiàn)癥狀；(2)口唇自噬動(dòng)作，表現(xiàn)為不自主唇舌咬傷，伴口腔潰瘍，該癥狀對(duì)該病具有特異性診斷價(jià)值[5]；(3)磨牙征，表現(xiàn)為不自主牙齒咀嚼行為；(4)帕金森病樣表現(xiàn)，如運(yùn)動(dòng)遲緩、靜止性震顫、肌張力增高等；(5)癲癇發(fā)作，其中以強(qiáng)直—陣攣發(fā)作多見(jiàn)；(6)認(rèn)知障礙，以注意力和執(zhí)行功能為主；(7)神經(jīng)精神癥狀，表現(xiàn)為淡漠、抑郁及焦慮等；(8)周圍神經(jīng)損害癥狀，表現(xiàn)為麻木、無(wú)力、肌萎縮、腱反射減弱或消失。ChAc在影像學(xué)檢查上可見(jiàn)尾狀核(尤其是尾狀核頭)和豆?fàn)詈宋s、低代謝、低灌注，相應(yīng)可見(jiàn)側(cè)腦室前腳擴(kuò)大[17]；臨床生化檢查中可見(jiàn)肌酶、轉(zhuǎn)氨酶增高，其中肌酸激酶增高更具有特異性[14]。本例患者主要表現(xiàn)為口面部不自主動(dòng)作、口唇自噬及四肢舞蹈樣動(dòng)作，且相關(guān)輔助檢查均符合該疾病的特異表現(xiàn)，故根據(jù)臨床資料高度考慮ChAc。此外，有研究認(rèn)為，此類患者外周血涂片或者掃描電鏡檢測(cè)到典型棘紅細(xì)胞，且典型棘紅細(xì)胞增多大于3%對(duì)于ChAc具有重要診斷價(jià)值[1,5]。本例患者外周血掃描電鏡檢測(cè)到了典型棘紅細(xì)胞，比例約25%，故進(jìn)一步支持ChAc的診斷。但外周血棘紅細(xì)胞在MLS中同樣也較為常見(jiàn)[1,12]，故不易鑒別。

根據(jù)以上臨床資料及掃描電鏡結(jié)果，目前基本可以明確為ChAc，但ChAc與NA其他3種亞型在臨床特征、實(shí)驗(yàn)室檢查及影像學(xué)表現(xiàn)上存在交叉性，鑒別診斷存在較大困難[7]。故本研究進(jìn)一步行基因檢測(cè)。本例先證者檢測(cè)到VPS13A基因的c.9403C>T點(diǎn)純合突變(基因型為TT純合子)，可導(dǎo)致chorein蛋白的p.R3135X突變，且系低頻變異；SIFT數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)結(jié)果為"damaging"，PolyPhen-2數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)結(jié)果為"probably damaging"，按照ACMG發(fā)布的最新基因變異解讀標(biāo)準(zhǔn)和指南，考慮為可能致病(likely pathogenic)。同時(shí)，結(jié)合先證者家系資料，其兄生前具有與先證者一致的臨床表現(xiàn)，均表現(xiàn)頭面部及肢體的舞蹈樣動(dòng)作。而先證者父母均為雜合突變(基因型為CT雜合子)，并且臨床表現(xiàn)無(wú)舞蹈癥狀。因此，說(shuō)明VPS13A(c.9403C>T)點(diǎn)突變?cè)诒狙芯緾hAc遺傳家系中符合常染色體隱性遺傳方式。已有研究表明ChAc以常染色體隱性遺傳為主，定位于9q21的VPS13A基因是目前公認(rèn)已知的致病基因，翻譯產(chǎn)物是chorein蛋白[19]。紅細(xì)胞是由膜脂質(zhì)、膜蛋白及血影蛋白—肌動(dòng)蛋白骨架協(xié)同維持[20]，而chorein蛋白參與了肌動(dòng)蛋白的聚合反應(yīng)，其功能障礙可能導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂和異常的紅細(xì)胞形狀[19]。故VPS13A基因突變導(dǎo)致chorein蛋白的改變對(duì)該疾病有重要的診斷價(jià)值[12]。VPS13A基因突變形式多樣，不同VPS13A基因突變可引起chorein蛋白功能性缺如或合成減少，最終導(dǎo)致ChAc的發(fā)生與發(fā)展[5,21]。目前，VPS13A基因測(cè)序和chorein蛋白定量檢測(cè)被認(rèn)為是ChAc的確診性診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。因此，本文結(jié)果與已經(jīng)報(bào)道的ChAc遺傳家系VPS13A基因遺傳方式相符合[5,16]。在鑒別診斷方面，MLS是一種罕見(jiàn)的X連鎖疾病，由XK基因突變引起[22]；HDL2是一種常染色體顯性遺傳性疾病，由位于6q24-3染色體的JPH3基因內(nèi)的CTG/CAG三核苷酸重復(fù)擴(kuò)增引起[23-24]；PKAN是一種染色體20p13上編碼泛酸激酶2的PANK2基因突變引起的常染色體隱性遺傳疾病[25-26]。因此，通過(guò)基因檢測(cè)不僅可以準(zhǔn)確診斷ChAc，并且在鑒別診斷方面亦有重要的意義。

綜上所述，雖然結(jié)合臨床表現(xiàn)及掃描電鏡檢查可以高度懷疑ChAc，但全外顯子目標(biāo)序列捕獲2代測(cè)序技術(shù)可準(zhǔn)確檢測(cè)VPS13A基因突變，并結(jié)合遺傳家系特點(diǎn)，可作為ChAc首選確診手段。