恒溫?cái)U(kuò)增法快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的臨床應(yīng)用

韓珍，朱惠慧，范遠(yuǎn)珍

(惠州市職業(yè)病防治院檢驗(yàn)科，廣東 惠州 516008)

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染而引起的慢性傳染性疾病。雖然其病因、診斷、治療方法都已經(jīng)相對(duì)明確，但隨著耐藥結(jié)核病的不斷流行，結(jié)核病防治仍然是世界范圍內(nèi)的難題[1-2]。因此，盡早發(fā)現(xiàn)和治療結(jié)核病是目前臨床工作中的重點(diǎn)。

目前臨床上常用檢測(cè)痰樣本中結(jié)核分枝桿菌的方法有痰涂片法和羅氏培養(yǎng)法，痰涂片法簡(jiǎn)單快捷，但敏感性卻相對(duì)較低；而羅氏培養(yǎng)法則常被認(rèn)為是結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，但其檢測(cè)耗時(shí)2～8 w，過程繁瑣且對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件要求較高，難以在臨床實(shí)驗(yàn)室，尤其是不發(fā)達(dá)地區(qū)的臨床實(shí)驗(yàn)室中常規(guī)開展。恒溫?cái)U(kuò)增熒光法一種結(jié)核分枝桿菌快速分子診斷技術(shù)，采用恒溫?zé)晒鈹U(kuò)增技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)在60 min內(nèi)判定病患標(biāo)本是否含有結(jié)核分枝桿菌，較傳統(tǒng)檢測(cè)方法有更高的檢出率，是一種快速、高靈敏、高特異性的檢測(cè)技術(shù)，極有可能替代傳統(tǒng)的痰涂片法和羅氏培養(yǎng)法而在臨床實(shí)驗(yàn)室中開展[3-4]。本研究擬對(duì)本所1000例已確診肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本同時(shí)使用3種方法(痰涂片法、羅氏培養(yǎng)法、恒溫?cái)U(kuò)增熒光法)進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)，對(duì)這3種方法檢測(cè)結(jié)果的陽性率進(jìn)行比較；分析恒溫?cái)U(kuò)增熒光法與羅氏培養(yǎng)法的檢測(cè)結(jié)果一致性；比較3種檢測(cè)方法在臨床使用中的優(yōu)缺點(diǎn)，為臨床工作中對(duì)結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)的方法選擇提供依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 以2018年1月至2019年5月期間在惠州市結(jié)核病防治研究所結(jié)核科就診的1000名肺結(jié)核患者為研究對(duì)象，采集晨痰標(biāo)本，每份標(biāo)本不低于2 mL，共1000份。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 痰涂片法和羅氏培養(yǎng)法 痰涂片法(Zhiel-Neelsen染色法)和羅氏培養(yǎng)法(L-J培養(yǎng)基)的具體操作參考2015版中華醫(yī)學(xué)會(huì)《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》和中國防癆協(xié)會(huì)《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》[5-6]。

1.2.2 恒溫?cái)U(kuò)增熒光法 操作中使用的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測(cè)試劑盒(恒溫?cái)U(kuò)增法)和實(shí)時(shí)恒溫?zé)晒鈾z測(cè)儀(DEAOU-308C，國食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2013第3402079號(hào)、粵械注準(zhǔn) 20142400245)均來自廣州迪澳生物公司。具體步驟如下：(1)標(biāo)本處理：痰樣本的分離、預(yù)處理方法與羅氏培養(yǎng)法相同，均參考《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》和《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》。將待測(cè)標(biāo)本按11 400 rpm離心5 min，棄上清液；加入生理鹽水1 mL進(jìn)行洗滌，棄上清液；加入50 μL TB稀釋液重懸后，300 W超聲處理15 min，并按11 400 rpm離心5 min后備用；(2)擴(kuò)增檢測(cè)：取處理物2 μL，加入30 μL擴(kuò)增檢測(cè)液。將微量反應(yīng)管置于恒溫?zé)晒鈾z測(cè)儀中，按63 ℃ 45 min的程序進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)(擴(kuò)增程序設(shè)定方法詳見恒溫?zé)晒鈾z測(cè)儀308C使用說明書)。結(jié)束并完成結(jié)果判讀后，將反應(yīng)管(閉管)小心從檢測(cè)儀中取出放入密封袋，將封口封嚴(yán)，按污染源處理；(3)結(jié)果判讀：點(diǎn)擊檢測(cè)儀的“檢測(cè)結(jié)果”按鈕查看檢測(cè)結(jié)果，樣本曲線與閾值曲線交叉點(diǎn)的橫坐標(biāo)讀數(shù)為出峰時(shí)間dt,若dt≤35 min則為陽性；dt﹥40 min則為陰性；若35 min﹤dt≤ 40 min則重復(fù)檢測(cè)，以復(fù)測(cè)值為準(zhǔn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。3種檢測(cè)方法的陽性率比較采用χ2檢驗(yàn)；3種檢測(cè)方法的一致性評(píng)價(jià)采用采用Kappa檢驗(yàn)(0.4

2 結(jié) 果

2.1 3種方法的檢測(cè)陽性率比較 對(duì)1000例已確診肺結(jié)核病人的痰樣本進(jìn)行結(jié)核桿菌檢測(cè)，同時(shí)采用傳統(tǒng)痰涂片法、羅氏培養(yǎng)法和恒溫?cái)U(kuò)增熒光法，3種方法的陽性率(靈敏度)分別為44.7%、55.4%和70.3%。恒溫?cái)U(kuò)增熒光法陽性率顯著高于傳統(tǒng)痰涂片法(χ2=134.1，P﹤0.01)、及羅氏培養(yǎng)法(χ2=47.5，P﹤0.01)，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

表1 痰涂片法、羅氏培養(yǎng)法、恒溫?cái)U(kuò)增熒光法檢測(cè)結(jié)果比較

注：*痰涂片法：Zhiel-Neelsen染色法；**羅氏培養(yǎng)法：L-J培養(yǎng)基

2.2 恒溫?cái)U(kuò)增熒光法與羅氏培養(yǎng)法的一致性檢驗(yàn)

臨床上常以羅氏(L-J)培養(yǎng)法得到結(jié)核分枝桿菌作為診斷結(jié)核病的“金標(biāo)準(zhǔn)”，因此在本研究中，我們將恒溫?cái)U(kuò)增熒光法與羅氏培養(yǎng)法的結(jié)果進(jìn)行了一致性分析。由表可見，Kappa值為0.592，且P﹤0.01，可以認(rèn)為兩種檢測(cè)方法的結(jié)果具有中等程度的一致性，見表2。

3 討 論

我國肺結(jié)核發(fā)病率居世界第二位，但在臨床上，由于既往檢測(cè)方法的缺陷，我國的結(jié)核發(fā)現(xiàn)率卻較低。近年來，針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的分子檢測(cè)方法，尤其是恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)法，由于其簡(jiǎn)單、便捷、高效的特點(diǎn)，受到了越來越多的關(guān)注。本研究采集了1000名肺結(jié)核患者的晨痰樣本，同時(shí)采用3種方法對(duì)痰樣本中的結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)恒溫?cái)U(kuò)增熒光法的檢測(cè)陽性率顯著高于其他方法，且其與臨床金標(biāo)準(zhǔn)(羅氏培養(yǎng)法)的檢測(cè)結(jié)果具有中等程度的一致性。

表2 恒溫?cái)U(kuò)增熒光法與羅氏培養(yǎng)法的一致性分析

本研究中傳統(tǒng)痰涂片法、羅氏培養(yǎng)法和恒溫?cái)U(kuò)增熒光法的陽性率(靈敏度)分別為44.7%、55.4%和70.3%，這一結(jié)果與既往多數(shù)研究相符合。既往的研究痰涂片法陽性率多在20.0%～57.1%間；羅氏培養(yǎng)法多在27.9%～47.5%之間[7-8]；而恒溫?cái)U(kuò)增熒光法多在46.8%～71.4%之間[9-10]。此外，本研究發(fā)現(xiàn)恒溫?cái)U(kuò)增熒光法的陽性率顯著高于傳統(tǒng)涂片法和羅氏培養(yǎng)法，這與既往研究基本一致[7-8]389-391，498-499。值得注意的是，本研究發(fā)現(xiàn)恒溫?cái)U(kuò)增熒光法與羅氏培養(yǎng)法的檢測(cè)結(jié)果有中等程度的一致性(Kappa=0.592，P﹤0.01)，但一致性并不是很高。我們認(rèn)為這是因?yàn)樵谂R床應(yīng)用中，培養(yǎng)法的敏感性、特異性不高，因而導(dǎo)致恒溫?cái)U(kuò)增熒光法與培養(yǎng)法的檢測(cè)結(jié)果符合率并不是很高，因此Kappa值僅有0.592，并未達(dá)到較高的一致性。

恒溫?cái)U(kuò)增熒光法是基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)建立起來的，通過特異的引物與結(jié)核分枝桿菌的DNA特定區(qū)域結(jié)合，采用多對(duì)引物，在恒溫條件下進(jìn)行擴(kuò)增的分子檢測(cè)方法。近年來，不少研究者分析對(duì)比了其與傳統(tǒng)檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)，以期為臨床工作中檢測(cè)方法的選擇提供依據(jù)。從單次檢測(cè)耗時(shí)來看，傳統(tǒng)痰涂片法、恒溫?cái)U(kuò)增熒光法、羅氏培養(yǎng)法單次檢測(cè)耗時(shí)分別為10 min、60 min和2～8 w，見表3?？梢钥吹?，痰涂片法耗時(shí)最少但敏感度低，易漏診。羅氏培養(yǎng)法耗時(shí)最多，敏感度高于痰涂片法，但其繁瑣的操作和極長(zhǎng)的檢測(cè)耗時(shí)限制了其在臨床中的應(yīng)用。恒溫?cái)U(kuò)增熒光法單次檢測(cè)耗時(shí)僅需60 min，且檢測(cè)敏感度最高。在結(jié)果讀取方面，傳統(tǒng)痰涂片和羅氏培養(yǎng)法都受到操作者主觀的影響，而恒溫?cái)U(kuò)增熒光法則通過客觀數(shù)據(jù)來確定結(jié)果。在3種方法的操作過程中，操作者感染結(jié)核桿菌的風(fēng)險(xiǎn)在恒溫?cái)U(kuò)增熒光法中是最低的，見表3。

表3 恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)與痰涂片法、羅氏培養(yǎng)法的比較

綜上所述，恒溫?cái)U(kuò)增熒光法的檢測(cè)敏感度顯著高于痰涂片法和羅氏培養(yǎng)法法，且其檢測(cè)結(jié)果與羅氏培養(yǎng)法有中等程度的一致性。恒溫?cái)U(kuò)增熒光法陽性率高、準(zhǔn)確性好、耗時(shí)短、操作簡(jiǎn)單，適于在臨床推廣使用，有利于早期發(fā)現(xiàn)和早期治療結(jié)核病，以取得更好的治療效果。