夾竹桃花揮發(fā)油的GC-MS分析及β-葡萄糖苷酶對夾竹桃花的增香和豚鼠離體子宮平滑肌的作用

劉語, 劉錚錚, 宋寧, 南冠君, 楊廣德

(西安交通大學(xué)藥學(xué)院，西安 710061)

夾竹桃(NeriumindicumMill.)，為龍膽目夾竹桃科夾竹桃屬常綠直立大灌木，原產(chǎn)于伊朗、印度、尼泊爾等地。中國各省區(qū)均有栽培，尤以中國南方為多[1-2]。其性味苦、寒，有毒[1]，毒性成分為各種夾竹桃甙，主要毒性成分是強(qiáng)心甙[1]，在醫(yī)藥上用于強(qiáng)心藥。具有較高的藥用價(jià)值和觀賞價(jià)值。

夾竹桃具有強(qiáng)心利尿、發(fā)汗催吐、鎮(zhèn)痛作用[2]。夾竹桃花大、艷麗、花期長，常作觀賞。夾竹桃花也是一種較理想的酸堿指示劑[3]，其花外涂可以治療口腔潰瘍[4]。夾竹桃花乙醇提取物對菜粉蝶幼蟲的拒食作用和對其成蟲的產(chǎn)卵忌避作用均較顯著[1]、夾竹桃花乙醇粗提物對蚜蟲的致死作用較明顯[5]。其花、葉、根皮的植物提取液具有較高的殺線蟲作用[6]。

有文獻(xiàn)對黃花夾竹桃的藥理作用進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)其具有強(qiáng)心作用，能使子宮肌張力增加[7]。有研究發(fā)現(xiàn)紅白兩種夾竹桃成分不同，含量不同，生理作用也不同[2]。

β-葡萄糖苷酶，它能夠水解多種β-葡萄糖苷，同時釋放出葡萄糖和相應(yīng)的配基[8-9]。β-葡萄糖苷酶來源廣泛，其酶學(xué)性質(zhì)變化不一，即使同一種生物，特別是高等作物，其體內(nèi)的β-葡萄糖苷酶存在多種形式，性質(zhì)也存在較大的差異[10-11]。近年來，β-葡萄糖苷作為風(fēng)味酶的應(yīng)用已日益受到人們的重視，其中尤以其對果汁、果酒和茶葉的增香研究較多，而有關(guān)β-葡萄糖苷酶酶解植物香料的增香報(bào)道甚少[12]，也用于植物有效成分的提取[13-15]。

本文將結(jié)合GC-MS對夾竹桃花揮發(fā)油成分進(jìn)行分析，為以后夾竹桃花的研究提供可科學(xué)依據(jù)，利用β-葡萄糖苷酶水解夾竹桃花，以驗(yàn)證β-葡萄糖苷酶對其是否具有增效作用。

1 儀器與試藥

1.1 儀器GCMS-TQ8040型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津公司)；AY120電子天平(日本島津公司)；BLG420S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)；JH-2型張力換能器(成都泰盟科技有限公司)；HW-400E型恒溫水浴平滑肌槽(成都泰盟科技有限公司)；揮發(fā)油提取器(無錫久平儀器有限公司)。

1.2 動物雌性豚鼠體重250～280 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.3 試藥夾竹桃花采于2018年7月采自西安交通大學(xué)藥學(xué)院的藥園，由西安交通大學(xué)藥學(xué)院牛曉峰教授鑒定為唇形科植物夾竹桃(NeriumindicumMill.)的花；正己烷，色譜純(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；無水硫酸鈉，分析純(西安化學(xué)試劑廠)；二甲基亞砜，分析純(西安化學(xué)試劑廠)；縮宮素注射液(南京新百藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字 H32025280，規(guī)格：10 U/mL，使用時用生理鹽水配成1 U/mL)；戊酸雌二醇片(拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司，規(guī)格：1 mg/片，使用時用純水配成 0.8 mg/mL)。

2 方法與結(jié)果

2.1 β-葡萄糖苷酶水解反應(yīng)

分別稱取兩份200 g新鮮夾竹桃花于500 mL pH 5.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液中，其中一份加0.2 g β-葡萄糖苷酶，同時置于搖床中50 ℃恒溫水浴5 h。同法制備空白溶液。

2.2 揮發(fā)油的提取

分別置于2000 mL圓底燒瓶中，加水800 mL，沸石數(shù)粒，搖勻，按2015版《中國藥典》四部通則2204揮發(fā)油測定法甲法提取揮發(fā)油，保持微沸4 h。讀取揮發(fā)油體積并收集所得揮發(fā)油，加入少量無水硫酸鈉，靜置。然后，稱取夾竹桃花揮發(fā)油適量，加正己烷溶解并稀釋，待測(用于GC-MS分析)。稱取夾竹桃花揮發(fā)油適量，臨用前用DMSO配成0.1 g/mL(用于豚鼠離體子宮試驗(yàn))。未加β-葡萄糖苷酶處理所提取的夾竹桃花揮發(fā)油為揮發(fā)油(1)，加β-葡萄糖苷酶處理后提取的夾竹桃花揮發(fā)油為揮發(fā)油(2)。

2.3 GC-MS的色譜條件

采用SHIMADZU SH-Rxi-5sil MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)毛細(xì)管色譜柱；載氣：He(≥99.99 %)；流速：1 mL/min；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；分流比：5∶1；升溫程序：色譜柱始溫60 ℃，保持3 min，以3 ℃/min升溫至150 ℃，保持5 min，以4 ℃/min升溫至200 ℃，保持3 min，以15 ℃/min升溫至280 ℃，保持1 min；質(zhì)譜：接口溫度為250 ℃，離子源溫度：230 ℃，電子轟擊源EI，電子能量：70 eV，質(zhì)量掃描范圍：45～550 m/z；溶劑峰切除時間為2.5 min，質(zhì)譜檢測起始時間為3.0 min。進(jìn)樣量1.0 μL。

2.4 數(shù)據(jù)處理

所得的色譜和質(zhì)譜信息經(jīng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)與其內(nèi)存譜庫(NIST)自動檢索和解析，并用峰面積歸一法測定了各化學(xué)成分在揮發(fā)油中的相對百分含量。

3 結(jié)果

3.1 GC-MS分析

采用GC-MS對夾竹桃花的揮發(fā)油提取物進(jìn)行分析，其有酶、無酶的情況下總離子流圖結(jié)果見圖1和圖2。

圖1 無酶夾竹桃花揮發(fā)油(1)的GC-MS總離子流圖

通過分析比較，確定色譜條件篩選后的GC-MS法對色譜峰可以達(dá)到較好的分離。通過計(jì)算機(jī)譜庫檢索及核對質(zhì)譜圖，β-葡萄糖苷酶水解前后的夾竹桃花揮發(fā)油提取物的化學(xué)成分分析見表1。

圖2 有酶夾竹桃花揮發(fā)油(2)的GC-MS總離子流圖

續(xù)表1

保留時間/min化合物中文名稱分子式相對峰面積(%)有酶揮發(fā)油(2)無酶揮發(fā)油(1)52.673十五醛C15H30O1.651.7753.5303,7,11-三甲基-1-十二烷醇C15H32O1.611.4454.804肉豆蔻酸C14H28O21.17-55.662苯甲酸辛酯C15H22O20.350.2256.540正二十一烷C21H441.412.6057.116十六醛C16H32O5.126.18

經(jīng)GC-MS分析并結(jié)合NIST譜庫檢索，鑒定出無酶夾竹桃花揮發(fā)油58種化合物，有酶夾竹桃花揮發(fā)油57種化合物。由表1可知，在有酶夾竹桃花揮發(fā)油提取物中含有許多烷類和醛酮類物質(zhì)，其主要物質(zhì)為2,6,10-三甲基十三烷(24.58%)、壬醛(18.55%)、十一烷(10.58%)、十六醛(5.12%)、十四醛(4.72%)。與無酶夾竹桃花揮發(fā)油提取物相比新增加了順式-3-己烯-1-醇(0.11%)、月桂酸(0.77%)、肉豆蔻酸(1.17%)三種化合物，減少了α-蒎烯、β-蒎烯、對傘花烴、十三醛、異蛇床酞內(nèi)酯五種化合物。這些物質(zhì)在無酶夾竹桃花揮發(fā)油提取物中的含量分別為0.70%、0.13%、0.50%、1.82%、0.78%。

無酶夾竹桃花揮發(fā)油提取物中所含化合物的主要成分與有酶相比類似，含量稍微有所不同，分別為：2,6,10-三甲基十三烷(24.62%)、十一烷(15.86%)、十六醛(6.18%)、十四醛(5.95%)、壬醛含量較小為0.44%。

通過表1的對比，可知在夾竹桃花中β-葡萄糖苷酶存在作用。對比可知在加入β-葡萄糖苷酶后壬醛、鄰二甲苯、正己醇、4-甲基庚醇、愈創(chuàng)木酚、水楊酸甲酯等物質(zhì)的相對含量也有所增加。同時可以觀察到正辛烷、庚醛、桉葉油醇、苯乙醛、十一烷、2,6,10-三甲基十二烷、癸醛、正十七烷等物質(zhì)的相對含量降低。

同時通過對夾竹桃花揮發(fā)油的成分分析，發(fā)現(xiàn)加入酶之后除少數(shù)物質(zhì)，如壬醛、鄰二甲苯之外，大部分物質(zhì)都降低，增加了與增香作用有關(guān)的肉豆蔻酸、月桂酸、順式-3-己烯-1-醇。而與增香作用有關(guān)的了ɑ-蒎烯、β-蒎烯、對傘花烴、十三醛減少，甚至消失。但其含量均較低。而與增香作用有關(guān)的壬醛大幅度增加，含量較高，且增加的肉豆蔻酸等與增香作用有關(guān)，且含量較高。故推測于β-葡萄糖苷酶的加入，對夾竹桃花有較弱增香作用。

3.2 豚鼠離體子宮試驗(yàn)[7,16-17]

取健康、成年雌性未孕豚鼠，在實(shí)驗(yàn)前2 d，每天按8 mg/kg灌胃戊酸雌二醇溶液，復(fù)制動情期豚鼠模型。于實(shí)驗(yàn)第3 d，頸椎脫臼處死豚鼠并迅速剖取子宮，置于盛有洛氏液(取NaCl 9.2 g、KCl 0.42 g、CaCl20.24 g、NaHCO30.15 g、葡萄糖1.0 g，用生理鹽水制備成1 000 mL的溶液，即得)的玻璃皿中，輕輕剝離子宮上附有的結(jié)締組織和脂肪組織，然后取中間段子宮平滑肌2～3 cm。

將離體子宮平滑肌一端固定于盛有洛氏液20 mL的浴槽，另端與張力換能器相接，保持浴槽中的營養(yǎng)液溫度為(37±0.5)℃，并通以95% O2+5% CO2的混合氣體，速度為1～2個小氣泡/s，用BLG420S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)先記錄一段正常曲線后，分別加入縮宮素、揮發(fā)油(1)和揮發(fā)油(2)，則浴槽內(nèi)藥物終濃度為：縮宮素0.002 U/mL、揮發(fā)油(1) 0.06 mg/mL，揮發(fā)油(2) 0.06 mg/mL?？瞻讓φ战M浴槽中加入等體積DEMO。每次給藥后記錄10 min子宮收縮曲線，然后用洛氏液清洗3次，待子宮活動再次穩(wěn)定后，給予下一組藥物。比較子宮收縮張力。試驗(yàn)重復(fù)10次。結(jié)果見表2。

表2 給藥前后豚鼠離體子宮張力的影響

注：與給藥前比較，P<0.05

空白對照組豚鼠正常離體子宮活動比較穩(wěn)定，揮發(fā)油(1)和揮發(fā)油(2)單獨(dú)給藥后，顯著增加收縮平均張力(P<0.05)；揮發(fā)油(1)和揮發(fā)油(2)進(jìn)行比較，揮發(fā)油(2)增加收縮平均張力更大(P<0.05)。說明經(jīng)過β-葡萄糖苷酶處理后再提取的揮發(fā)油能增加組豚鼠正常離體子宮平均張力。

4 結(jié)論

通過建立并優(yōu)化夾竹桃花揮發(fā)油的GC-MS方法，測定了其揮發(fā)油的化學(xué)成分主要以烷類化合物為主，為進(jìn)一步開發(fā)和利用夾竹桃資源提供了理論依據(jù)。β-葡萄糖苷酶對夾竹桃花有較弱增香作用，但能增加豚鼠離體子宮收縮。