毛發(fā)移植中的毛囊保存液的應(yīng)用和研究進展

張 舒，蔣 獻

（四川大學(xué)華西醫(yī)院 皮膚性病科，四川 成都，610041）

雄激素性禿發(fā)(androgenetic alopecia，AGA)是最常見的一種禿發(fā)疾病，在我國AGA患者總數(shù)超過1億，其中以 III-IV級禿發(fā)最多見[1]，且很難通過單純藥物治療獲得令人滿意的效果[2]。1959年Orentreich提出枕部頭皮為雄激素非敏感區(qū)，這個區(qū)域可為毛發(fā)重建提供理想的種子[3]。該“優(yōu)勢供區(qū)”原則的發(fā)現(xiàn)，開啟了現(xiàn)代毛發(fā)移植的發(fā)展。毛發(fā)移植技術(shù)的出現(xiàn)為脫發(fā)患者帶來了轉(zhuǎn)機。盡管毛發(fā)移植已廣泛應(yīng)用于臨床，但近20年來該技術(shù)尚未取得突破性進展。受到供區(qū)毛囊數(shù)量的不足的局限，如今的毛發(fā)移植依然難以滿足重度禿發(fā)或者彌漫性禿發(fā)患者的治療需求[2,4-5]。為了解決毛囊種子不足的問題，毛發(fā)再生醫(yī)學(xué)逐漸興起，盡管近期人工毛囊技術(shù)取得了令人驚喜的進展[6]，但距離臨床應(yīng)用還有漫長的路要走[7]。

在毛發(fā)移植術(shù)中影響毛囊存活率的關(guān)鍵在于毛囊組織離體階段，而毛囊保存液是離體階段的重要環(huán)節(jié)。盡管有大量的研究關(guān)注于改善毛發(fā)移植手術(shù)技巧和探索毛囊生理機制，然而毛囊保存液卻往往被忽視。關(guān)于毛囊保存液有三個重要的問題：(1) 是否可以找到比生理鹽水更好的保存液？哪種方案是最好的?有什么證據(jù)支持這種方案？（2）理想的保存液應(yīng)具備哪些功能？(3)評價的終點是什么？為解決上述問題，我們必須將我們的想法建立在對大量研究回顧的基礎(chǔ)上。

1 現(xiàn)有的毛囊保存液方案

在器官移植手術(shù)中，可用到的三大類移植物保存液：靜脈輸注用液體、培養(yǎng)基、低溫組織保存液（表1）。

1.1 生理鹽水保存液

在先今的植發(fā)手術(shù)中，大多數(shù)醫(yī)生選擇使用生理鹽水作為毛囊的保存液（包括磷酸鹽緩沖的生理鹽水）。若毛囊的“離體”時間短，此時用生理鹽水進行簡單的水合就足以保護組織。但是隨著手術(shù)時間的延長，毛囊離體時間在2小時內(nèi)、24小時、48小時，其移植后存活率分別為95.7%、84%和68%[8]。2-4小時內(nèi)毛囊存活率不受離體時間影響，但4個小時后存活率開始下降[9]。有證據(jù)表明保存液會影響移植物的生存能力，特別是針對小移植物的毛發(fā)移植[10]。綜上，若毛囊離體時間小于4小時，使用生理鹽水是合理的。而對于移植物較小、移植數(shù)量較大、毛囊離體時間較長的情況，尋找更佳的保存液保障毛囊存活率則顯得更有價值。

1.2 組織培養(yǎng)液/培養(yǎng)基

細胞培養(yǎng)基是為在37°C的專門CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞和組織而設(shè)計的，并不適合用作冷凍保存液。在評價培養(yǎng)基作為毛囊保存液的研究中，結(jié)果各不相同。有學(xué)者認為與DMEM相比，平衡液中保存的移植物的存活率更高[11]。另一些研究著眼于含有附加成分的培養(yǎng)基，例如：bis(maltolato)oxova-nadium(BMOV)[10]、一氧化氮抑制劑[12]、氨基胍[13]，這些附加成分可能是提高移植物存活率的先決條件。研究發(fā)現(xiàn)，與保存在磷酸鹽緩沖鹽水中的移植物相比，在DMEM中室溫保存5小時并加入凋亡抑制劑（如氨基胍）的移植物在隨后的組織培養(yǎng)中表現(xiàn)出毛干長度更大及生長因子的上調(diào)[13]。小規(guī)模的研究已顯示了一些益處，尚待更大規(guī)模、高質(zhì)量的對照研究進一步評估。

1.3 低溫組織保存液

在生理溫度下 (37°C)保存器官可以加速組織ATP的分解，并由于較高的代謝活動而轉(zhuǎn)向厭氧糖酵解。目前臨床上減少缺血引起的組織損傷的主要實用技術(shù)是降低組織溫度——使用冷凍儲存溶液。當(dāng)組織溫度從37°C降低到0°C時，新陳代謝所需的能量也相應(yīng)降低了12倍[14]。在4°C，代謝率是正常生理溫度的10%[15]。與常溫相比，低溫保存的移植物表現(xiàn)出更少的脂質(zhì)過氧化(自由基損傷)[16]。然而，這種益處可能會被一種稱為“冷損傷”的過程所抵消：低溫會導(dǎo)致細胞膜ATP Na/K泵的中斷，鈉離子迅速進入細胞，隨后導(dǎo)致細胞水腫。同時，低溫可導(dǎo)致細胞內(nèi)鈣的積累，可以激活降解酶[17]。冷損傷可能是導(dǎo)致低溫保存的移植物存活率較室溫保存無明顯差異的原因之一[18]。

在器官移植領(lǐng)域，一些抗“冷損傷”的低溫存儲溶液被商業(yè)開發(fā)[例如，Viaspan?(杜邦Phar-maceutical,Wilmington,Delware,USA)，diol?(IMTX Sangstat,Lyon,France)，Celsior?(Methapharm Inc.)]。這些溶液通過維持腫脹壓和防止水分進入細胞壁保護細胞免受冷損傷。研究發(fā)現(xiàn)，用威斯康星大學(xué)肝移植保存液（the University of Wisconsin solution，UW) 保存48小時的各組織存活率明顯高于生理鹽水組[19]。使用組氨酸色氨酸酮戊二酸酯(HTK)保存液進行器官移植的遠期并發(fā)癥少于UW保存液[20]。一個較新的低溫保存液——HypoThermosol-FRS?(BioLife Solutions,Inc.Bothell，美國華盛頓)已被用作頭發(fā)移植的移植物保存溶液[21]，與生理鹽水相比，HypoThermosol-FRS保存的移植物表現(xiàn)出更少的脂質(zhì)過氧化(自由基損傷)[16]。

表1 不同保存液的基本特征

2 毛囊保存液應(yīng)具備的功能

2.1 對抗缺血和缺血再灌注損傷

離體組織的攜氧動脈血液供應(yīng)不足，氧的消耗會導(dǎo)致線粒體中電子傳遞鏈的崩潰，這對于細胞ATP（adenosine triphosphate）的氧化磷酸化/有氧呼吸非常重要[22]。毛囊中含有快速分裂的上皮細胞，因此需要較高的ATP。在器官移植領(lǐng)域，氧合全氟碳化合物、含氫溶液作為血紅蛋白替代物的保存液[23,24]，或直接向組織提供ATP均可有效克服缺血性損傷[25]。在植發(fā)領(lǐng)域，使用含ATP的保存液，離體5小時的毛囊表現(xiàn)出更好的組織生存能力，毛干生長速度更快[26]?？紤]到ATP通常不能很好地被細胞膜吸收，有學(xué)者嘗試使用三磷酸腺苷脂質(zhì)體配方，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體和ATP均在缺血損傷后維持細胞代謝活性和防止細胞壞死方面發(fā)揮作用[27]。

缺血-再灌注損傷（Ischemia-reperfusion injuries，IRI）可導(dǎo)致AMP向ATP轉(zhuǎn)化延遲，ATP的產(chǎn)生下降[28]，也是導(dǎo)致組織損傷和移植物存活率降低的重要臨床現(xiàn)象。強自由基清除劑對各種組織IRI具有保護作用[29]。與生理鹽水相比，HypoThermosol-FRS保存的毛囊的自由基活性明顯降低、Bcl-2表達增加[16,21]。

2.2 調(diào)節(jié)毛囊的生長周期

一個毛囊平均一生經(jīng)歷10-30個生長周期(Hair cycle,HC)，毛發(fā)的生長不是一個連續(xù)的過程，毛囊會被周期性更新，HC包括：生長期（anagen）、退行期(catagen)、休止期(telogen)、空毛囊期（部分）(exogen)。HC是毛囊干細胞（hair follicle stem cells,HFSCs）和毛乳頭（dermal papilla,DP）共同作用的結(jié)果[7,30-33]，并且受到多種生長通路的影響，例如Wnt/β-catenin、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、轉(zhuǎn)化生長因子(TNF-b)和Notch等信號通路[34-36]。

保存液作用于調(diào)節(jié)HC已取得一定的臨床進展。保存在添加有一氧化氮抑制劑的培養(yǎng)液中的毛囊，持續(xù)生長性更好，休止期更不明顯[12]。DP和真皮鞘細胞（dermal sheath，DS）作為毛發(fā)生長調(diào)節(jié)劑已獲得專利[37]。頭皮平滑肌是HC的重要調(diào)節(jié)靶點[38]，局部外用含有a1雄激素受體拮抗劑可調(diào)節(jié)頭皮血管的平滑肌中氨基酸相關(guān)受體受到，同時調(diào)節(jié)立毛肌的收縮，使頭發(fā)抗拉扯能力增加400%，減少脫發(fā)[39]。齊墩果酸（Oleanolic acid，OA）是一種五環(huán)三萜類化合物，OA通過Wnt/β-catenin通路可以在體外模型中刺激毛發(fā)基質(zhì)細胞增殖，促進毛發(fā)生長[40]。

近期研究發(fā)現(xiàn)淋巴管也參與調(diào)節(jié)毛發(fā)的HC。毛囊由休止期進入生長期前后，周圍的毛細淋巴管發(fā)生重構(gòu)，當(dāng)皮膚下毛細淋巴管凋亡、淋巴引流少，原本處于靜止狀態(tài)的毛囊干細胞開始活動，小鼠全身的毛囊進入生長期[41]。研究證實，淋巴管內(nèi)皮細胞的條件培養(yǎng)基可促進人真皮乳頭細胞的生長[42]。

3）保護毛囊干細胞

HFSCs生態(tài)位的維持和干細胞的靜止-激活狀態(tài)的交替血管、淋巴管、脂肪組織或皮膚內(nèi)的直接細胞-細胞相互作用等因素的影響[43-45]。脂肪細胞前體細胞分泌血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF-a)可激活毛乳頭的PDGF，進而激活DP[46]。富含Ancocyanin的黑醋栗萃取物（blackcurrant extract，BCE)可使毛囊干細胞標記物角蛋白19和其他干細胞標志物CD34的表達顯著增強[47]。旁分泌因子EGF、TGF-β、IGF -1、HGF和VEGF具有調(diào)節(jié)細胞遷移增殖、重構(gòu)細胞外基質(zhì)(ECM)和促進血管生成的作用[48]，是調(diào)節(jié)毛發(fā)生長的關(guān)鍵旁分泌因子[49]。富含生長因子的富血小板血漿(platelet-rich plasma,PRP)與保存液混合后，毛囊再生速度更快，再生毛發(fā)更多[50,51]。用含干細胞的培養(yǎng)基培養(yǎng)的HFSCs具有更短的種群倍增時間、更高的存活率和更好的間充質(zhì)干細胞特性的保存性，用該方法處理的毛囊移植體內(nèi)后毛囊數(shù)量顯著增加生長、休眠期毛囊數(shù)量明顯減少[52]。含脂肪干細胞的HFSCs懸液可激活WNT通路和I型聚集（I型聚集物可表達早期毛囊標志物）[53]。毛囊與人臍血間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)可提高體外DP的活力并上調(diào)Bcl-2、磷酸化Akt和ERK的水平，促進毛發(fā)生長[54-55]。

3 問題與展望

毛囊不僅是治療脫發(fā)的關(guān)鍵因素，還可應(yīng)用于多種學(xué)科的再生醫(yī)學(xué)。HFSCs具有高度的可塑性和分化能力，它們可以通過分化成皮膚中的表皮、真皮和部分毛囊來促進皮膚傷口的愈合[56]。此外，研究證實HFSCs還可分化為神經(jīng)細胞、膠質(zhì)細胞、角質(zhì)形成細胞、平滑肌細胞、心肌細胞和黑色素細胞[57,58]，移植的HFSCs可促進周圍神經(jīng)和脊髓損傷的恢復(fù)，并具有心臟再生的潛力[59,60]?？紤]到毛囊很容易從每個人身上獲得，不易形成腫瘤，HFSCs可以冷凍保存而不喪失分化潛能，可見毛囊具有廣闊的發(fā)展前景。

基于上述研究成果，毛囊保存液是毛囊再生醫(yī)學(xué)中不容忽視的一個重要環(huán)節(jié)，它直接或間接的影響著毛囊的存活率。時至今日，大多數(shù)外科醫(yī)生仍然繼續(xù)使用生理鹽水作為毛囊保存液，其他的醫(yī)師會選擇使用乳酸林格氏鹽或優(yōu)化pH為7.4的生理鹽水，很少有外科醫(yī)生使用任何其他保存液方案。盡管初步研究表明一些其他的保存溶液可能會提高移毛囊移植物的存活率和/或有利于毛發(fā)再生，然而，這些有限的研究尚存在一些矛盾的結(jié)論[61]，尚且缺乏大型的隨機對照研究可以指導(dǎo)我們選擇保存液。

考慮到現(xiàn)代大多數(shù)植發(fā)手術(shù)的存活率可高達85-90%，未來毛發(fā)再生醫(yī)學(xué)的焦點將關(guān)注于對HFSCs和HC的調(diào)控。HypoThermosol-FRS保存液的出現(xiàn)很好的解決了缺血再灌注和冷損傷的問題，在此基礎(chǔ)上，通過優(yōu)化保存液的成分構(gòu)成，使保存液具有促進HFSCs增殖分化、延長毛囊生長期、提高移植物血管化等功能將是保存液未來的發(fā)展趨勢。此外，毛發(fā)移植中尚存在一些懸而未決的問題，例如術(shù)后急性休止期脫發(fā)的機制是什么？可以利用保存液方案解決該問題嗎？都有待進一步的研究進行探索，從而克服毛囊體外保存的技術(shù)壁壘，促進毛發(fā)移植技術(shù)的革新。