化痰散結(jié)方含藥血清體外抗胃癌作用

王華 郭維 孫琪

【摘要】 目的：研究化痰散結(jié)方含藥血清對(duì)胃癌細(xì)胞株增殖抑制作用。方法：以MGC803和MKN45胃癌細(xì)胞株為研究對(duì)象，加入化痰散結(jié)方含藥血清，CCK-8法檢測(cè)化痰散結(jié)方含藥血清對(duì)2種胃癌細(xì)胞株增殖抑制作用。結(jié)果：化痰散結(jié)方含藥血清對(duì)MGC803和MNK45胃癌細(xì)胞均具有抑制作用，其中對(duì)MGC803胃癌細(xì)胞最佳干預(yù)濃度為20%，最佳干預(yù)時(shí)間為48 h;對(duì)MKN45胃癌細(xì)胞最佳干預(yù)時(shí)間為72 h，最佳干預(yù)濃度為20%。結(jié)論：化痰散結(jié)方含藥血清對(duì)胃癌細(xì)胞株的增殖具有抑制作用，為后期開展實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】 化痰散結(jié)方 含藥血清 胃癌細(xì)胞增殖

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2020.07.003??文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A??文章編號(hào) 1674-6805（2020）07-000-03

Anti-gastric Cancer Effect in Vitro of Huatan Sanjie Prescription Containing Drug Serum/WANG Hua， GUO Wei， SUN Qi. //Chinese and Foreign Medical Research， 2020， 18（7）： -8

[Abstract] Objective： To study the inhibitory effect of Huatan Sanjie Prescription on proliferation of gastric cancer cell lines. Method： The MGC803 and MKN45 gastric cancer cell lines were taken as the research object， adding Huatan Sanjie Prescription containing drug serum， and the CCK-8 method was used to detect the effect of Huatan Sanjie Prescription containing drug serum on the proliferation inhibition of the two gastric cancer cell lines. Result： The Huatan Sanjie Prescription containing drug serum had cytotoxic effects on both MGC803 and MKN45 gastric cancer cell lines. The optimal intervention concentration for gastric cancer cells of MGC803 was 20% and the optimal intervention time was 48 h， for MKN45 gastric cancer cells， the optimal intervention time was 72 h and the optimal intervention concentration was 20%. Conclusion： The serum containing Huatan Sanjie Prescription has inhibitory effect on the proliferation of gastric cancer cell lines， which laid a foundation for the later experimental research.

[Key words] Huatan Sanjie Prescription Containing drug serum Cell proliferation in gastric cancer

First-authors address： Traditional Chinese Medicine School of Ningxia Medical University， Yinchuan 750004， China

胃癌（gastric cancer，GC）是在亞洲地區(qū)常見的消化道腫瘤，因其侵襲和轉(zhuǎn)移致患者預(yù)后極差，死亡率很高[1]。因此，增加對(duì)GC發(fā)病和進(jìn)展的理解，可能有助于改善臨床和治療。中醫(yī)認(rèn)為，痰濁與胃癌的發(fā)病有密切關(guān)系。痰的特點(diǎn)是膠著難去，隨氣升降，無處不到[2-3]，其特點(diǎn)與腫瘤的特性十分相似?！兜は姆ā吩唬骸胺踩松?，上中下有塊者，多是痰。”這也充分說明痰與腫瘤的關(guān)系[4]。基于此理論，化痰法治療腫瘤成為臨床常用的一種大法，本課題組前期自擬化痰散結(jié)方治療胃癌，取得較好的療效，進(jìn)一步從基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)探索其作用機(jī)制，具體如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和動(dòng)物

MGC803和MKN45人胃癌細(xì)胞株（兩株細(xì)胞系均購于中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心）;健康SD雄性大鼠10只，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[許可證號(hào)SCXK90（寧）2015-0001]。

1.2 藥物

化痰散結(jié)方由以下藥物組成：半夏15 g，天南星15 g，浙貝10 g，生牡蠣30 g，全蝎6 g，地龍6 g，守宮6 g，烏賊骨15 g，炙甘草6 g，木蝴蝶15 g，鳳凰衣15 g，刺猬皮10 g，山甲粉3 g，蜈蚣6 g，藤梨根15 g（制成的水煎劑濃度為1.56 g/ml），由寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬回醫(yī)中醫(yī)醫(yī)院提供。

1.3 試劑

四季清胎牛血清（浙江天杭生物科技公司）;CCK-8試劑 （日本同仁化學(xué)）;胰蛋白酶 （北京索萊寶生物有限公司），RPMI-1640培養(yǎng)基（HyClon公司）。

1.4 儀器

恒溫CO2培養(yǎng)箱HF-90 （Thermo Scientific） ;倒置顯微鏡CKX31 （OLYMPUS Corporation） ;連續(xù)波長及核酸蛋白微量檢測(cè)酶標(biāo)議（Tecan瑞士）。

1.5 方法

1.5.1 含藥血清的制備 SD 大鼠10只，體重（180±20）g，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后，隨機(jī)分為空白組和給藥組，每組5只。給藥組給予化痰散結(jié)方藥液，每日灌胃，2 ml/次。空白組給予等量生理鹽水，兩組均連續(xù)灌胃7 d。末次灌藥（灌藥前禁食不禁水12 h）2 h 后，10%水合氯醛麻醉，心尖采血，靜置2 h后，3 500 r/min離心10 min 后收集血清，同組血清混合置于離心管中，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，-80 ℃分裝保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 MGC803和MNK45胃癌細(xì)胞分別接種于T25的培養(yǎng)皿中，在5% CO2 、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長成對(duì)數(shù)生長期進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。按照處理?xiàng)l件不同分組為空白血清組（10%空白血清）、5%組（5%含藥血清）、10%組（10%含藥血清）、15%組（15%含藥血清）和20%組（20%含藥血清）。

1.5.3 CCK-8法檢測(cè)胃癌細(xì)胞株增殖 用胰酶消化處于對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，用培養(yǎng)基分別稀釋成細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，每孔100 μl（MGC803，6×103個(gè)/孔;MKN45，5×103個(gè)/孔），培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁。棄去原有培養(yǎng)液，加無血清培養(yǎng)液，饑餓12 h后，分別加入含藥血清或空白血清培養(yǎng)液100? μl，繼續(xù)分別培養(yǎng)24、48、72 h。每孔加入10 μl CCK-8溶液，再培養(yǎng)1 h。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在波長450 nm處讀取光密度（OD值）。每組每時(shí)段均設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。抑制率計(jì)算方法：抑制率（%）=（給藥組平均OD值-空白組平均OD值）/給藥組平均OD值×100%。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以資料（x±s） 表示，采用單因素方差分析， 組間比較用LSD，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 化痰散結(jié)方含藥血清對(duì)MGC803胃癌細(xì)胞株增殖的影響

10%組、15%組及20%組24 h內(nèi)OD值均低于空白血清組，5%組、10%組、15%組及20%組48、72 h內(nèi)OD值均低于空白血清組，隨著藥物濃度及時(shí)間的增加，抑制率也隨之升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

2.2 化痰散結(jié)方含藥血清對(duì)MKN45胃癌細(xì)胞株增殖的影響

5%組、10%組、15%組及20%組48、72 h內(nèi)OD值均低于空白血清組，隨著藥物濃度及時(shí)間的增加，抑制率也隨之增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

3 討論

CCK-8檢測(cè)法的特征是操作簡(jiǎn)單，結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性佳，比MTT檢測(cè)法對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的毒副作用較安全[5]。

目前手術(shù)加化療是胃癌最常見的治療手段，但其化療副作用顯著，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量。中醫(yī)藥能夠改善患者生活質(zhì)量，減輕化療毒副反應(yīng)，提高化療耐藥[6-7]，其作用機(jī)制值得深入探索。

化痰散結(jié)方含藥血清對(duì)MGC803和MNK45胃癌細(xì)胞均具有抑制作用，其中對(duì)MGC803胃癌細(xì)胞抑制作用較好，最佳干預(yù)濃度為20%，最佳干預(yù)時(shí)間為48 h。對(duì)MKN45胃癌細(xì)胞最佳干預(yù)時(shí)間為72 h，最佳干預(yù)濃度為20%。為本實(shí)驗(yàn)后續(xù)的高通量測(cè)序提供基礎(chǔ)。中藥復(fù)方抗腫瘤的機(jī)制尚不明確，需要進(jìn)一步對(duì)腫瘤移植到動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)研究。

腫瘤乃有形實(shí)邪，治療多以“結(jié)者散之”“堅(jiān)者削之”法[8]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，化痰散結(jié)法聯(lián)合化療治療中晚期胃癌，改善患者生存質(zhì)量，增效減毒[9-10]。實(shí)驗(yàn)研究表明溫陽化痰散結(jié)方對(duì)患乳腺癌荷瘤鼠具有抑制腫瘤生長，改善生存期[11]。有學(xué)者運(yùn)用化痰散結(jié)類中藥，抑制腫瘤生長轉(zhuǎn)移[12-14]，逆轉(zhuǎn)耐藥[15]。

胃癌當(dāng)屬于中醫(yī)學(xué)“積聚”“癥瘕”等范疇?！动兛菩牡眉吩疲骸鞍┝稣?， 非陰陽正氣所結(jié)腫， 乃五臟瘀血濁氣痰滯而成?！睂?dǎo)師郭維在臨床診治中體會(huì)到，腫瘤并非單一邪氣所為，也非單純的寒證和熱證，而是寒熱膠結(jié)[16]，再與痰瘀等邪氣相合，日久成積化毒致癌。故擬此方，本方由半夏、天南星燥濕化痰，浙貝、生牡蠣軟堅(jiān)散結(jié)，此四藥共為君藥。全蝎、地龍、守宮、蜈蚣和山甲粉通絡(luò)散結(jié)共為臣藥?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明一些動(dòng)物藥中所含的成分具有抑制或殺滅癌細(xì)胞、增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫力、抑制轉(zhuǎn)移、止癌性疼痛等作用。木蝴蝶和胃，鳳凰衣養(yǎng)陰，刺猬皮散瘀止痛，烏賊骨制酸消炎止痛，藤梨根清熱解毒活血共為佐藥。炙甘草調(diào)和諸藥為使藥。該方辛開苦降，寒熱并用，具有化痰散結(jié)，和胃止痛，養(yǎng)陰解毒之功。

綜上所述，化痰散結(jié)方含藥血清對(duì)胃癌細(xì)胞株的增殖具有抑制作用，為后期開展實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2019-11-06） （本文編輯：馬竹君）

基金項(xiàng)目：寧夏高等學(xué)校一流學(xué)科建設(shè)（中醫(yī)學(xué)學(xué)科）資助項(xiàng)目

（項(xiàng)目編號(hào)：NXYLXK2017A06）

寧夏回族自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：NZ17076）

①寧夏醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院 寧夏 銀川 750004

②寧夏醫(yī)科大學(xué)回醫(yī)藥現(xiàn)代化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

通信作者：郭維