芒針對(duì)骨關(guān)節(jié)炎大鼠炎癥反應(yīng)及鎮(zhèn)痛作用影響的機(jī)制研究*

范 潔，胡鳳軍，王 波，姜迎萍△

(1．新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，新疆 烏魯木齊830001; 2．廣州市正骨醫(yī)院，廣東 廣州510045)

骨關(guān)節(jié)炎( Osteoarthritis，OA) 是一種多因素造成的關(guān)節(jié)軟骨退化、關(guān)節(jié)畸形等退行性病變［1－2］。近年來(lái)由于我國(guó)人口老齡化加重，OA 的發(fā)病率逐年升高［3］。研究表明OA 的發(fā)生與發(fā)展和機(jī)體炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，減少病變組織炎癥反應(yīng)能顯著減輕關(guān)節(jié)的繼發(fā)性損傷并促進(jìn)運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)［4］。中醫(yī)中藥在OA的對(duì)癥治療中取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，龍膽苦苷、黃芪甲苷、南蛇藤素、黃連素、淫羊藿等越來(lái)越多的中藥單體成分被證明在抑制OA 的早期炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［5］，另一方面，針灸治療OA 具有操作方便、療效顯著、無(wú)毒副作用等優(yōu)點(diǎn)，溫針、火針、電針等針灸療法均已普遍應(yīng)用于OA 患者的臨床治療中［6－7］，而芒針作為傳統(tǒng)針灸的一部分，其對(duì)OA 的治療效果及作用機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型，探討芒針對(duì)OA 大鼠炎癥反應(yīng)及鎮(zhèn)痛作用的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)材料

華佗牌0．25 mm×40 mm 針灸針( 蘇州醫(yī)療用品廠有限公司) ;泰盟PL－200 型熱刺痛儀( 成都泰盟科技有限公司) ; von Frey hair 纖毛機(jī)械刺激針( 北京中昊萬(wàn)通科技有限公司) ;JL2B 型電脈沖刺激儀( 蘇州醫(yī)療用品廠有限公司) ; NO、SOD、MDA 檢測(cè)試劑盒( 自南京建成生物工程研究所) ; RIPA 裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒( 碧云天) ; anti － IL －6、anti － TNF － α、anti－iNOS 抗體及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG( CST) ;大鼠IL－6、TNF－α、iNOS ELISA 檢測(cè)試劑盒( 上海北諾生物) 。

1．2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

30 只SD 大鼠購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，體質(zhì)量(200 ±20) g，分籠飼養(yǎng)于無(wú)特定病原體級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格遵守動(dòng)物倫理保護(hù)法等相關(guān)規(guī)定，所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后分組實(shí)驗(yàn)。

1．3 實(shí)驗(yàn)分組及造模

將大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組和治療組，每組10 只。模型組和治療組大鼠給予5%水合氯醛腹腔麻醉后行仰臥位固定，配制100 mL 含1．6%木瓜蛋白酶溶液和0．3 mol/L 半胱氨酸溶液的混合液，向2 組大鼠雙后肢膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射混合液，每3 天造模注射1次，共注射3 次，正常組注射等量生理鹽水，同時(shí)根據(jù)超疲勞易致OA 發(fā)病的特點(diǎn)，每天強(qiáng)迫大鼠運(yùn)動(dòng)1 ～2 h。造模10 天后，隨機(jī)選取各組大鼠2 只頸椎脫臼處死，暴露膝關(guān)節(jié)，取各組大鼠關(guān)節(jié)組織觀察造模是否成功，造模成功后給予治療組大鼠芒針針灸治療。

1．4 治療方法 模型組大鼠造模成功后不予治療，同時(shí)正常組大鼠不做任何處理。治療組大鼠采用自制固定器仰臥位固定于解剖板，彎曲大鼠雙膝呈45°固定。參照世界衛(wèi)生組織制定的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)穴位選取膝前、后三里二穴，針刺部位采用75%酒精常規(guī)消毒，取針刺入穴位4 ～5 mm深，捻轉(zhuǎn)1 min，將針灸針連接于JL2B型電脈沖刺激儀上，設(shè)置參數(shù)為2/100 Hz、1 mA，留針刺激15 min，左右隔次交替。每天治療1 次，5 天為1個(gè)療程，療程間隔休息2 天，共治療2 個(gè)療程。實(shí)驗(yàn)完成后采用斷髓法處死全部大鼠，收集保存相應(yīng)組織標(biāo)本進(jìn)行后續(xù)指標(biāo)檢測(cè)。

1．5 大鼠行為學(xué)指標(biāo)檢測(cè)

1．5．1 熱板致痛閾值檢測(cè) 最后1 個(gè)療程芒針治療結(jié)束后2 h，加熱熱板維持溫度在( 55 ±0．5) ℃，將各組大鼠分別置于熱板上，觀察從接觸熱板后1 min 內(nèi)大鼠舔后足的反應(yīng)時(shí)間，超過(guò)1 min 大鼠無(wú)明顯疼痛反應(yīng)則取出大鼠終止實(shí)驗(yàn)，記錄上述各組大鼠的疼痛反應(yīng)時(shí)間為熱痛閾值( Paw withdraw ther－mal latency，PWTL) 。

1．5．2 機(jī)械性撤足閾值檢測(cè) 機(jī)械性撤足閾值檢測(cè)采用von Frey hair 方法［8］，熱板致痛反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后平靜大鼠恢復(fù)至正常狀態(tài)，1 ～2 h 后將各組大鼠放置于箱底為金屬網(wǎng)板的丙烯酸籠內(nèi)，適應(yīng)15 ～30 min 后通過(guò)網(wǎng)孔采用von Frey hair 纖維絲分別向大鼠兩后足底部施加機(jī)械性刺激，持續(xù)4 ～6 s，觀察并記錄大鼠受到刺激后是否出現(xiàn)撤足或舔足反應(yīng)，出現(xiàn)即記為陽(yáng)性反應(yīng)，產(chǎn)生陽(yáng)性反應(yīng)的最小纖維絲刺激力為大鼠雙側(cè)后肢撤足閾值( Paw withdrawal threshold，PWT) 。

1．6 血清NO、SOD、MDA 含量檢測(cè)

治療完成后采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉各組大鼠，固定大鼠并取腹主動(dòng)脈血3 mL，室溫靜置2 h后4℃4 000 r/min 低速離心10 min，分離上層血清，分別采用硝酸還原酶法、羥胺法及硫代巴比妥酸( TBA) 法對(duì)血清內(nèi)一氧化氮( NO) 、超氧化物歧化酶( SOD) 及丙二醛( MDA) 含量進(jìn)行檢測(cè)，比較各組大鼠血清內(nèi)NO、SOD、MDA 含量差異。

1．7 HE 染色觀察關(guān)節(jié)軟骨組織病理變化

取治療完成后各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織，采用4%多聚甲醛固定液4℃固定軟骨組織12 h 至過(guò)夜，12．5%EDTA 溶液脫鈣1 ～2 周，取出組織梯度酒精脫水，行常規(guī)石蠟包埋冠狀面10 mm 連續(xù)切片后經(jīng)蘇木素伊紅( HE) 染色液染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織病理變化情況，取清晰視野拍照保存。

1．8 大鼠軟骨組織相關(guān)炎性因子表達(dá)檢測(cè)

1．8．1 Western Blot 取實(shí)驗(yàn)結(jié)束后各組大鼠軟骨組織40 ～60 mg 置于5 mL 管中，加入1 mL 含1%蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液充分勻漿研磨，冰浴裂解30 min。裂解完成后4℃12 000 r/min 離心收集蛋白上清，定量后加入1 × loading buffer 100℃變性蛋白5 min。取各組樣品等量蛋白行10%SDS －PAGE 凝膠電泳分離目的條帶并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，5%BSA 封閉孵育1 h，4℃一抗孵育至過(guò)夜。加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h。將條帶轉(zhuǎn)移至凝膠成像儀，滴加發(fā)光液后曝光成像，拍照統(tǒng)計(jì)條帶上各組蛋白灰度值。

1．8．2 ELISA 取各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織，充分勻漿裂解15 min，4℃4 000 rpm 低速離心15 min 收集上清。參照雙抗夾心ELISA 試劑盒說(shuō)明書，取等量樣品加入反應(yīng)孔中于37℃水浴45 min，充分洗滌5 次，加入生物素標(biāo)記的抗體37℃反應(yīng)30 min，充分洗滌后再加入鏈霉親和素－過(guò)氧化物酶混勻37℃水浴30 min。加入顯色劑避光孵育15 min，終止顯色，上酶標(biāo)儀檢測(cè)各反應(yīng)孔于450 nm 波長(zhǎng)處吸光值。

1．9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

上述全部數(shù)據(jù)均采用SPSS 19．0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以 珋±s 表示，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次取均值，兩兩比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，組間差異采用單因素方差分析( ANOVA) ，P ＜0．05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 芒針對(duì)膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理變化的影響

造模后可見(jiàn)模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織表面凹凸、增生嚴(yán)重，HE 染色顯示模型組大鼠軟骨細(xì)胞數(shù)量較正常組顯著減少，細(xì)胞形態(tài)畸變，出現(xiàn)過(guò)渡層細(xì)胞排列紊亂、組織間隙充血、腫脹、炎性細(xì)胞嚴(yán)重浸潤(rùn)等病變現(xiàn)象，提示大鼠OA 模型造模成功。給予芒針治療后，治療組大鼠軟骨組織肉眼可見(jiàn)表面較為光滑平整，光鏡下顯示細(xì)胞排列有序，與模型組相比，少量可見(jiàn)細(xì)胞偏于一側(cè)，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)顯著減少，詳見(jiàn)圖1。

2．2 芒針對(duì)OA 大鼠的鎮(zhèn)痛作用

通過(guò)熱板致痛及von Frey hair 方法比較芒針治療對(duì)OA 大鼠鎮(zhèn)痛作用的影響，見(jiàn)表1，結(jié)果顯示相較于正常組，模型組大鼠熱板致痛反應(yīng)敏感，PWTL 值顯著降低( P ＜0．05) ;治療2 療程后，芒針施治對(duì)大鼠熱板致痛反應(yīng)有明顯鎮(zhèn)痛作用，大鼠痛閾值較模型組顯著增加( P ＜0．05) 。同時(shí)，比較3 組大鼠機(jī)械撤足閾值( PWT) 結(jié)果顯示，模型組與治療組大鼠PWT 值均較正常組顯著降低，但治療組PWT 值較模型組顯著增大，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＜0．05) 。

2．3 各組大鼠血清NO、SOD、MDA 含量比較

檢測(cè)血清中NO、SOD、MDA 含量變化以驗(yàn)證3 組大鼠抗自由基損傷作用能力，結(jié)果顯示，模型組較正常組大鼠血清內(nèi)NO、MDA 含量顯著升高，而SOD 含量減少( P ＜0．05) ，給予芒針治療后，治療組大鼠體內(nèi)NO、MDA 含量較模型組顯著降低，但與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＜0．05) ，SOD 含量較模型組顯著提升，且與正常組大鼠血清SOD 含量間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＞0．05) ，芒針促進(jìn)大鼠體內(nèi)抗自由基損傷作用增強(qiáng)，詳見(jiàn)表2。

圖1 HE 染色觀察3 組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理變化(400 ×)

圖2 芒針治療對(duì)3 組大鼠膝關(guān)節(jié)炎性因子表達(dá)影響

表1 芒針治療對(duì)3 組大鼠熱痛閾值、機(jī)械撤足閾值的影響 (珋±s)

表1 芒針治療對(duì)3 組大鼠熱痛閾值、機(jī)械撤足閾值的影響 (珋±s)

注:與正常組相比，aP ＜0．05;與模型組相比，bP ＜0．05。

組別 n PWTL( s) PWT( g)正常組10 42．61 ±3．17 27．39 ±1．32模型組 10 14．56 ±2．05a 10．75 ±0．96a治療組 10 29．15 ±4．11ab 18．03 ±2．21 ab

表2 芒針治療對(duì)3 組大鼠血清內(nèi)NO、SOD、MDA 含量的影響 (珋±s)

表2 芒針治療對(duì)3 組大鼠血清內(nèi)NO、SOD、MDA 含量的影響 (珋±s)

注:與正常組相比，aP ＜0．05;與模型組相比，bP ＜0．05。

組別 n NO［c/( mmol·kg) ］SOD［ρ/( U·mL) ］MDA［c/( nmol·L) ］正常組10 2．51 ±0．41 161．10 ±11．37 2．06 ±0．70模型組 10 17．38 ±1．78a 129．58 ±14．01a 10．71 ±1．69a治療組 10 8．38 ±1．19ab 147．62 ±6．88a 6．33 ±1．20 ab

2．4 各組大鼠膝關(guān)節(jié)炎性因子表達(dá)變化

Western Blot 和ELISA 用于檢測(cè)各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中炎性介質(zhì)表達(dá)變化，如圖2A，WB 結(jié)果顯示模型組大鼠組織內(nèi)TNF －α、IL －6 以及iNOS 蛋白表達(dá)較正常組大鼠顯著增加( P ＜0．05) ，而與模型組相比，治療組大鼠上述蛋白表達(dá)均有減少。ELISA 結(jié)果顯示芒針治療后，治療組大鼠TNF －α、IL －6、iNOS表達(dá)較模型組顯著降低，與WB 結(jié)果一致，各組炎性因子表達(dá)見(jiàn)圖2B，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＜0．05) 。

3 討論

中醫(yī)治療一直是國(guó)內(nèi)臨床醫(yī)治OA 的重要手段［9－10］，從中醫(yī)理論出發(fā)，OA 被歸結(jié)為“痹證”范疇，血虛風(fēng)擾、濕郁化熱、風(fēng)寒濕相搏等均有可能成為OA潛在的致病機(jī)制，與此同時(shí)，根據(jù)郭躍等［11］對(duì)OA 的辨證論治，將OA 患者證候分為氣滯血瘀型、肝脾腎陽(yáng)虛型、肝腎虧虛型3 類，并根據(jù)不同證候的患者提供了不同的治療方法和手段。芒針發(fā)源于古代九針之一的“長(zhǎng)針”，具有取穴少、透穴多、針感強(qiáng)、傳導(dǎo)快等諸多特點(diǎn)［12］，已被報(bào)道在神經(jīng)系統(tǒng)疾病、胃腸道疾病及婦科疾病中發(fā)揮重要作用［13－14］，近期研究表明，芒針可以通過(guò)改善脊髓損傷后的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡促進(jìn)脊髓功能修復(fù)和后肢運(yùn)動(dòng)能力的提升［15］，而關(guān)于芒針對(duì)OA 患者的治療機(jī)制未見(jiàn)報(bào)道，故展開(kāi)本研究。

伴隨OA 的發(fā)生發(fā)展，膝關(guān)節(jié)軟骨組織及周圍骨質(zhì)代償性增生、關(guān)節(jié)滑膜組織的炎癥浸潤(rùn)是加劇軟骨穩(wěn)態(tài)破壞和膝骨損傷的重要因素，因此維持膝關(guān)節(jié)骨細(xì)胞正常代謝和關(guān)節(jié)組織形態(tài)是治療過(guò)程中的重要考量因素，HE 染色結(jié)果顯示，芒針給予OA 大鼠治療2個(gè)療程后，治療組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織病變較模型組顯著改善，過(guò)渡層細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，提示芒針可能通過(guò)促進(jìn)膝關(guān)節(jié)組織損傷修復(fù)，減輕炎癥反應(yīng)，治療并改善OA 病癥。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，芒針促進(jìn)OA 大鼠鎮(zhèn)痛作用增強(qiáng)，治療組大鼠PWTL 值及PWT 值均較模型組顯著升高( P ＜0．05) ，同時(shí)PWT 是反應(yīng)神經(jīng)根疼痛的常用指標(biāo)，PWT 的大小與神經(jīng)根疼痛程度呈顯著負(fù)相關(guān)［16］，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明芒針可能通過(guò)緩解神經(jīng)根疼痛提高OA 大鼠PWT 值，促進(jìn)OA 大鼠鎮(zhèn)痛作用增強(qiáng)。另一方面，既往研究表明，體液內(nèi)高水平的氧自由基是造成骨關(guān)節(jié)損傷、炎癥反應(yīng)爆發(fā)的重要因素［17］，NO 作為一種重要的炎癥介質(zhì)，其在血液中的含量與動(dòng)物體內(nèi)炎癥反應(yīng)顯著相關(guān)，NO 的積聚更會(huì)誘發(fā)嚴(yán)重的關(guān)節(jié)損傷［18］; 與此同時(shí)，動(dòng)物體內(nèi)的自由基與脂質(zhì)體發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)產(chǎn)生的MDA 會(huì)對(duì)動(dòng)物體自身產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，MDA、NO 的超負(fù)荷均會(huì)對(duì)大鼠的炎癥反應(yīng)及生存狀態(tài)產(chǎn)生重要影響。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠體內(nèi)NO、MDA 含量較正常組顯著升高，反之SOD 含量顯著減少，由此說(shuō)明OA 大鼠體內(nèi)抗自由基損傷作用嚴(yán)重減弱，芒針治療后，治療組大鼠體內(nèi)NO、MDA 及SOD 含量變化提示，芒針施治OA大鼠膝前、后三里等穴位能夠顯著抑制大鼠體內(nèi)NO、MDA 的產(chǎn)生及積聚，同時(shí)促進(jìn)SOD 含量升高，最終起到清除體內(nèi)自由基、抑制炎癥反應(yīng)發(fā)生的作用。由此，進(jìn)一步檢測(cè)OA 大鼠體內(nèi)iNOS 蛋白的表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)治療組大鼠iNOS 表達(dá)較模型組顯著降低，iNOS 作為機(jī)體NOS 活性氮自由基產(chǎn)生的重要催化酶，iNOS 表達(dá)的降低進(jìn)一步解釋了芒針抑制NO 的合成機(jī)制。同時(shí)，IL－6、TNF－α 已被報(bào)道參與OA 相關(guān)的NF－κB、MAPKs 等信號(hào)通路調(diào)控［19］，參與誘導(dǎo)無(wú)菌性炎癥爆發(fā)，WB 和ELISA 結(jié)果進(jìn)一步證明了芒針能夠顯著抑制OA 大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織IL－6、TNF－α的表達(dá)，起到促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)、抑制炎癥反應(yīng)的作用。

綜上所述，本研究根據(jù)近部取穴、循經(jīng)取穴的原則，給予OA 大鼠芒針施治膝前、后三里二穴，益氣補(bǔ)血、消炎化瘀，發(fā)揮對(duì)膝關(guān)節(jié)軟骨組織的局部治療作用，療效確切。選穴配穴參照以往的研究報(bào)道［20－21］，一方面針刺膝前穴位是對(duì)深膝肌群的肌力訓(xùn)練及恢復(fù)，能夠平衡在OA 的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中軟骨細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)及軟骨下骨三者偶聯(lián)產(chǎn)生的力學(xué)平衡失衡現(xiàn)象。另一方面，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“針必取三里，灸必加關(guān)元”，針刺后三里具有疏經(jīng)通絡(luò)、強(qiáng)壯身體的作用，臨床已將足三里配伍其穴學(xué)位，通過(guò)電針、水針、激光針灸等用于多種鎮(zhèn)痛及經(jīng)絡(luò)調(diào)理的治療中。本研究首次選用足三里配伍膝前穴位，采用芒針針灸的方法對(duì)骨關(guān)節(jié)炎大鼠的炎癥反應(yīng)及鎮(zhèn)痛作用和機(jī)制進(jìn)行了探究，結(jié)果表明該針灸療法可能與降低軟骨組織IL －6、TNF－α、iNOS 的表達(dá)、促進(jìn)大鼠體內(nèi)抗自由基損傷作用有關(guān)，通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)，發(fā)揮OA 大鼠抗炎鎮(zhèn)痛、改善膝骨關(guān)節(jié)功能、緩解骨關(guān)節(jié)炎病證的作用。