金種子優(yōu)質(zhì)窖泥高產(chǎn)己酸菌的篩選鑒定及其應(yīng)用性能分析

程 偉，李 娜，張 杰，潘天全，彭 兵，鞏子路，吳麗華，吳宏萍

（1.安徽金種子酒業(yè)股份有限公司，安徽阜陽 236023；2.安徽金種子集團(tuán)有限公司檢測中心，安徽阜陽 236018）

濃香型白酒在白酒市場上的銷售占有率較高， 是最普遍的一種白酒香型，主要分布在四川、蘇魯豫皖等地區(qū)，其產(chǎn)量和質(zhì)量對(duì)白酒行業(yè)的發(fā)展具有重要的影響[1]。濃香型白酒主體香味物質(zhì)己酸乙酯，是由己酸菌產(chǎn)生的己酸與發(fā)酵過程中產(chǎn)生的乙醇發(fā)生酯化反應(yīng)而成，己酸菌作為窖泥中的重要功能微生物，對(duì)濃香型白酒風(fēng)味的形成具有重要作用[2-3]。篩選出優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)量的己酸菌是眾多學(xué)者研究的重要方向，高素潔等[4]從富裕酒廠窖泥中分離1 株高產(chǎn)己酸菌株，其己酸含量最高可達(dá)540 mg/100 mL；謝圣凱等[5]采用厭氧法從窖泥中篩選出Clostridium guangxiensestrain xsk1 和Clostridium kogasensisstrain xsk2 己酸菌，其己酸產(chǎn)量分別為4.51 g/L、2.5 g/L。窖泥質(zhì)量的優(yōu)劣影響著濃香型白酒質(zhì)量，窖泥質(zhì)量不僅取決于其理化指標(biāo)，更取決于窖泥中有益窖泥功能菌的種類、數(shù)量及產(chǎn)物的代謝能力，以及營養(yǎng)成分的合理比例，窖泥養(yǎng)護(hù)及人工窖泥復(fù)配中離不開己酸菌液的應(yīng)用[6-8]。本研究采用乙酸鈉培養(yǎng)基從優(yōu)質(zhì)老窖泥中篩選出高產(chǎn)己酸菌，從溫度耐受性、乙醇耐受性及己酸菌液的硫酸鎂、硫酸銨、磷酸氫二鉀、乙醇等添加量對(duì)己酸產(chǎn)量的影響等方面研究篩選己酸菌的生理生化特性，并結(jié)合16S rDNA 分析及其系統(tǒng)發(fā)育學(xué)地位，從而為窖池養(yǎng)護(hù)及人工窖泥培養(yǎng)提供優(yōu)質(zhì)菌株及其培養(yǎng)條件。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 樣品來源

優(yōu)質(zhì)老窖泥：取濃香型釀酒車間13 個(gè)大曲酒發(fā)酵老窖池的優(yōu)質(zhì)窖泥，作為菌種篩選的樣品來源，并分別編號(hào)為JKY1-JKY13。

1.1.2 培養(yǎng)基

乙酸鈉培養(yǎng)基(質(zhì)量分?jǐn)?shù)%)：乙酸鈉0.5%、酵母膏0.1%、硫酸鎂0.02%、磷酸氫二鉀0.04%、硫酸銨0.05%、碳酸鈣1%，乙醇2%（培養(yǎng)基滅菌后再添加），pH6.5，瓊脂粉1.5%～2%（液體培養(yǎng)基不添加）。

1.1.3 試劑與儀器

試劑及耗材：乙酸鈉、酵母膏、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、硫酸銨、瓊脂粉、碳酸鈣等，生工生物工程（上海）股份有限公司；硫酸銅（分析純AR），安徽雨軒科技有限公司；己酸（色譜純）、內(nèi)標(biāo)2-乙基丁酸（色譜純），成都西亞試劑公司；乙醇、乙醚，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；厭氧袋、耗氧劑，日本MGC公司。

儀器設(shè)備：LRH-250F 生化培養(yǎng)箱、DHG-9145A 電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Velocity 18R 臺(tái)式冷凍離心機(jī)，澳大利亞Dynamica 公司；Spectramax 384plus 分光光度計(jì)，美國MD 公司；2010 型氣相色譜儀（配氫火焰離子化檢測器、全自動(dòng)進(jìn)樣器、自動(dòng)進(jìn)樣針），日本島津公司；DB-FFAP 色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25μm），美國安捷倫公司；電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 己酸菌分離篩選及純化

將乙酸鈉液體培養(yǎng)基裝入試管中(裝液量90%)，向試管中加入1 g 老窖泥，80 ℃水浴熱處理10 min，封口膜密封，37 ℃發(fā)酵培養(yǎng)7 d，得到發(fā)酵液。用乙醚萃取發(fā)酵液，并用硫酸銅顯色法[9]初篩，藍(lán)色為陽性；取初篩為陽性的菌液1 mL，添加到裝有乙酸鈉液體培養(yǎng)基的試管中，80 ℃水浴熱處理10 min，密封，37 ℃培養(yǎng)7 d；重復(fù)純化2～3 次，得到純化后發(fā)酵液。將獲得的純化后發(fā)酵液進(jìn)行梯度稀釋，并在乙酸鈉固體培養(yǎng)基中涂平板，37 ℃培養(yǎng)7 d后，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行液體發(fā)酵，并通過氣相色譜對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)得到的菌液中己酸含量進(jìn)行檢測。

1.2.2 菌體密度檢測

在乙酸鈉液體培養(yǎng)基中接入5%的己酸菌JZZ種子液，以37 ℃恒溫培養(yǎng)3～18 d，每天取培養(yǎng)液液面10 cm 左右菌液樣品，采用分光光度計(jì)對(duì)發(fā)酵液菌體密度OD600值進(jìn)行檢測。

1.2.3 己酸的氣相檢測

將獲得的發(fā)酵液經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾，得到過濾液；取過濾液500 μL 于5 mL 容量瓶中，加乙醚定容至5 mL，充分振蕩2 min，靜置1 min，吸取上層乙醚萃取液，即為己酸，備測。實(shí)驗(yàn)設(shè)置多次重復(fù)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)樣品分別編號(hào)為1、2、3、4、5、6。通過氣相色譜對(duì)乙醚萃取液中的己酸含量進(jìn)行檢測。色譜條件為：進(jìn)樣口溫度240 ℃；柱箱起始溫度：100 ℃(1 min)；升溫速率：10 ℃/min；柱溫終溫度：220 ℃(2 min)；檢測器溫度250 ℃；氣體流量：氫氣40 mL/min，空氣400 mL/min，尾吹氣30 mL/min；進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣，分流比20∶1；進(jìn)樣體積：1 μL。內(nèi)標(biāo)液的配制：準(zhǔn)確稱取內(nèi)標(biāo)物2-乙基丁酸原液0.185 g 于100 mL 容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇水溶液定容至100 mL，配制1.85 mg/mL 2-乙基丁酸內(nèi)標(biāo)液待用。

1.2.4 己酸菌JZZ的溫度、乙醇耐受性

將獲得的種子液按照5%的接種量接種到裝有乙酸鈉液體培養(yǎng)基的三角瓶(裝樣量90%)中，制備兩組，一組分別在36 ℃、37 ℃、38 ℃、39 ℃和40 ℃的條件下厭氧培養(yǎng)7 d，另一組向三角瓶中添加乙醇，使乙醇在培養(yǎng)基中的體積分?jǐn)?shù)分別為2%、4%、6%、8%和10%，37 ℃厭氧培養(yǎng)7 d 后，兩組分別得到發(fā)酵液。通過乙醚提取己酸并運(yùn)用氣相色譜法檢測各個(gè)發(fā)酵液中的己酸產(chǎn)量，每個(gè)樣品3 個(gè)重復(fù)，觀察溫度及乙醇含量對(duì)產(chǎn)己酸量的影響變化。

1.2.5 培養(yǎng)液配方組分單因素含量影響

以己酸菌JZZ和窖泥混合菌的比例為1∶1配制己酸菌JZZ 和窖泥混合菌復(fù)配物，培養(yǎng)溫度37 ℃，每3 d 進(jìn)行取樣檢測培養(yǎng)液的己酸含量并觀察菌體生長情況，取樣時(shí)每次取3 支2 mL 離心管作為平行，以1 mL 移液器槍頭長度為標(biāo)準(zhǔn)每次進(jìn)行取樣。在不改變培養(yǎng)基其他組分的條件下，測定0.005%、0.01%、0.02%、0.04%硫酸鎂添加量對(duì)己酸含量的影響；在不改變培養(yǎng)基其他組分的條件下，測定0%、0.05%、0.1%、0.15%硫酸銨添加對(duì)己酸含量的影響；在不改變培養(yǎng)基其他組分的條件下，測定0%、0.05%、0.1%、0.15%磷酸氫二銨添加量對(duì)己酸含量的影響；在不改變培養(yǎng)基其他組分的條件下，測定0%、4%、8%、12%、16%乙醇終濃度添加量對(duì)己酸含量的影響。

1.2.6 己酸菌JZZ的形態(tài)觀察及其16S rDNA鑒定

形態(tài)鑒定：單菌落形態(tài)觀察，經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢[9]。分子鑒定：委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司對(duì)菌株進(jìn)行測序，提取菌株基因組，PCR 擴(kuò)增16S rDNA 片段，擴(kuò)增程序：95 ℃、5 min，95 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、90 s，24個(gè)循環(huán)，72 ℃、10 min。提交美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for BiotechnologyInformation，NCBI），通過基本本地隊(duì)列搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進(jìn)行同源性比較分析，用MEGA6 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)己酸菌的分離篩選

2.1.1 己酸菌的硫酸銅顯色法初篩

己酸菌屬于能生成芽孢的梭狀芽孢桿菌，其孢子具有耐熱性，其營養(yǎng)細(xì)胞是不耐熱的，可以采用熱處理法淘汰較弱的芽孢，同時(shí)殺滅營養(yǎng)細(xì)胞和其他雜菌，使己酸菌株純化；因此，將分離培養(yǎng)7 d 后的己酸菌液在85 ℃恒溫處理10 min，冷卻后再接入新的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，以達(dá)到純化己酸菌的目的。分別取JKY1-JKY13第二次己酸菌富集菌液2 mL，加2 mL 2%硫酸銅、1 mL 乙醚，搖勻，靜置封層，觀察乙醚層顯色反應(yīng)，己酸含量定性檢測結(jié)果見表1。檢測結(jié)果初步表明，JKY8、JKY9、JKY10、JKY11、JKY12、JKY13等的產(chǎn)己酸能力較強(qiáng)。

表1 JKY1-JKY13硫酸銅顯色定性檢測

2.1.2 己酸菌的單菌挑取及高產(chǎn)菌株篩選

挑 取JKY8、JKY9、JKY10、JKY11、JKY12、JKY13 稀釋涂平板培養(yǎng)皿上，將形態(tài)不同的單菌落進(jìn)行四區(qū)劃線分離，37 ℃厭氧培養(yǎng)7 d，有菌落出現(xiàn)，通過反復(fù)純化，獲取了大量單菌落（圖1）。

對(duì)分離純化后的菌種要進(jìn)行顯微鏡觀察及發(fā)酵產(chǎn)物的定量檢測，以鑒別己酸菌。通過多次分離、純化、檢測，再選取菌體健壯、活躍、芽孢桿菌占優(yōu)勢、產(chǎn)己酸高的優(yōu)質(zhì)菌株。從稀釋涂平板培養(yǎng)后的平板中挑取單菌落至液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，37 ℃厭氧培養(yǎng)7 d 后測己酸產(chǎn)量。由表2 可看出，JKY11-E1 的平均己酸產(chǎn)量為3.94 mg/mL，是己酸高產(chǎn)菌株，并將該菌株命名為己酸菌JZZ。

表2 不同編號(hào)樣品己酸菌產(chǎn)己酸量的檢測結(jié)果

2.1.3 己酸菌JZZ的己酸產(chǎn)量復(fù)測（表3）

如表3 所示，對(duì)己酸菌JZZ 的產(chǎn)己酸能力進(jìn)行了6 次檢測，己酸產(chǎn)量測定值分別為：4.33 mg/mL、4.25 mg/mL、4.28 mg/mL、4.55 mg/mL、4.42 mg/mL、4.34 mg/mL，平均值為4.36 mg/mL。這表明己酸菌JZZ菌株不僅產(chǎn)己酸能力較強(qiáng)，而且產(chǎn)量較穩(wěn)定。

表3 高產(chǎn)己酸菌JZZ的產(chǎn)量穩(wěn)定性檢測結(jié)果

2.2 己酸菌JZZ的培養(yǎng)條件分析

2.2.1 己酸菌JZZ與窖泥混合菌的復(fù)配培養(yǎng)

己酸檢測結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)比表明[4-5]，己酸菌JZZ 是高產(chǎn)己酸的菌株。將乙酸鈉液體培養(yǎng)基于0.1 MPa 高壓滅菌20 min，冷卻后加入碳酸鈣和乙醇，按照5%的接種量加入己酸菌種子液。對(duì)培養(yǎng)的己酸菌液每天觀察產(chǎn)氣變化，并采用分光光度計(jì)對(duì)發(fā)酵菌液進(jìn)行檢測，通過菌體密度OD600值對(duì)己酸菌JZZ 的菌體生長情況分析。結(jié)果表明，己酸菌JZZ的生長有明顯的規(guī)律。

己酸菌培養(yǎng)液可廣泛應(yīng)用于濃香型大曲酒的灌窖、窖池保養(yǎng)、人工窖泥培養(yǎng)、酯化液的制作等，以改善和提高濃香型大曲酒的質(zhì)量。如圖2 所示，己酸菌JZZ 的菌體密度在第9 天時(shí)達(dá)到峰值，然后呈下降趨勢，表明該菌制備窖泥營養(yǎng)液時(shí)，較適宜的接種或培養(yǎng)時(shí)間在7～9 d。己酸菌是重要的釀酒功能微生物，但單一菌種發(fā)揮作用有限，混合菌能提供多種釀酒微生物，協(xié)同提高窖泥的釀酒效果?；旌暇鶭KY8 是第二次己酸菌富集菌液，硫酸銅顯色定性檢測表明，JKY8 具有較高的己酸產(chǎn)量。采用混合菌JKY8 與己酸菌JZZ 復(fù)配培養(yǎng)，不同培養(yǎng)時(shí)間取樣進(jìn)行GC 檢測。如圖2 所示，復(fù)配混合發(fā)酵10 d 后己酸產(chǎn)量增速減慢，當(dāng)混合菌∶己酸菌為1∶1 時(shí)，己酸產(chǎn)量優(yōu)于其他復(fù)配比例組合，且具有產(chǎn)酸協(xié)同性，表明在人工窖泥制備時(shí)應(yīng)該采用復(fù)合菌接種，有利于保證窖泥質(zhì)量。

2.2.2 己酸菌JZZ的溫度、乙醇耐受性

將己酸菌JZZ 按照5%的接種量接種到裝有乙酸鈉液體培養(yǎng)基的三角瓶（裝樣量90%）分別在36 ℃、37 ℃、38 ℃、39 ℃和40 ℃厭氧培養(yǎng)7 d 后，運(yùn)用氣相色譜法進(jìn)行己酸菌己酸產(chǎn)量的測定，每個(gè)樣品做3 個(gè)重復(fù)。如圖3 所示，37 ℃己酸產(chǎn)量為4.36 mg/mL±0.09 mg/mL，39 ℃、40 ℃時(shí)的己酸產(chǎn)量分別是37 ℃的94%、88%，仍然表現(xiàn)出高產(chǎn)特性。在白酒釀造過程中，伴隨著糧醅的發(fā)酵進(jìn)程發(fā)酵體系內(nèi)部溫度會(huì)發(fā)生顯著變化。投料時(shí)初始溫度一般為20 ℃左右，隨著淀粉降解放熱，溫度逐步上升至35～40 ℃，之后會(huì)維持在這個(gè)水平或略有下降；當(dāng)然，在窖池的不同位置，局部溫度也會(huì)不同，有的甚至達(dá)到40 ℃以上；另外，由于窖池開放式生產(chǎn)，受季節(jié)、早晚、陰晴等天氣變化，發(fā)酵體系溫度也將產(chǎn)生變化。這對(duì)菌株的溫度適應(yīng)性有較高要求，己酸菌JZZ 在40 ℃時(shí)表現(xiàn)出高產(chǎn)特性，能適應(yīng)釀酒過程中的溫度變化。

將己酸菌JZZ 按照5%的接種量接種到裝有乙酸鈉液體培養(yǎng)基的三角瓶（裝樣量90%），添加乙醇，使乙醇終濃度分別在2%vol、4%vol、6%vol、8%vol、10%vol，厭氧培養(yǎng)7 d 后，運(yùn)用氣相色譜法進(jìn)行己酸菌己酸產(chǎn)量的測定。如圖3 所示，在乙醇濃度2%～6%的范圍內(nèi)表現(xiàn)出高產(chǎn)，可耐受6%vol乙醇濃度，當(dāng)乙醇濃度為8%vol 時(shí)，產(chǎn)量急劇下降。在白酒釀造過程中，伴隨著糧醅發(fā)酵進(jìn)程發(fā)酵體系內(nèi)部的乙醇濃度會(huì)發(fā)生顯著變化。發(fā)酵初期，隨著發(fā)酵進(jìn)行，乙醇濃度逐漸積累，發(fā)酵后期達(dá)到3%vol～4%vol，局部可能更高。發(fā)酵體系乙醇濃度變化，要求窖泥功能菌具有一定程度的乙醇耐受性。目前，尚未有乙醇耐受性的高產(chǎn)己酸菌報(bào)道。己酸菌的高己酸產(chǎn)量是濃香型白酒釀造的追求目標(biāo)，有的己酸菌菌株雖然高產(chǎn)，但對(duì)溫度變化和乙醇濃度變化適應(yīng)性不強(qiáng)，導(dǎo)致生產(chǎn)效果不穩(wěn)定等。己酸菌JZZ 菌株具有適宜溫度和乙醇的耐受性，對(duì)己酸菌菌株工業(yè)生產(chǎn)中的穩(wěn)定性以及適應(yīng)傳統(tǒng)釀造工藝具有重大意義。

2.2.3 己酸菌液配方組分單因素考察

2.2.3.1 不同硫酸鎂、硫酸銨添加量的影響

由圖4 可知，在不同硫酸鎂濃度添加中，在起始時(shí)間內(nèi)己酸含量幾乎相同，之后隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，己酸含量隨著不同硫酸鎂濃度的添加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，其中0.01%硫酸鎂濃度的添加量均有著較高濃度的己酸含量，表明硫酸鎂較適添加量為0.01%。在不同的硫酸銨濃度的添加下，初始時(shí)間內(nèi)不同硫酸銨添加量己酸含量基本相同，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長0%硫酸銨添加始終有較高的己酸含量，而其余組分濃度下的己酸含量相對(duì)較低且十分接近，因此可以說明硫酸銨添加量多少對(duì)最終己酸含量并無太大影響，而其他組分內(nèi)pH 值較低而影響己酸的生成。然而考慮最終己酸菌培養(yǎng)液加入到人工窖泥中進(jìn)行培養(yǎng)，因此考慮最終的硫酸銨添加量為0.05%。

2.2.3.2 不同磷酸氫二鉀、乙醇添加量的影響

由圖5 可知，磷酸氫二鉀濃度越高，己酸含量越大，但在磷酸氫二鉀濃度達(dá)到0.3%和0.45%時(shí)己酸含量已經(jīng)趨于平穩(wěn)，因此0.3%磷酸氫二鉀添加量為較適添加量。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，培養(yǎng)菌液內(nèi)己酸含量逐漸增大，比較不同乙醇添加量條件下的己酸含量，可以發(fā)現(xiàn)，2%vol 乙醇終濃度添加量條件下的己酸含量較大，表明在此培養(yǎng)條件下2%vol的乙醇添加為較適添加量。

根據(jù)上述硫酸鎂、硫酸銨、磷酸氫二鉀、乙醇等因素在己酸菌液配方中的較適添加比例，結(jié)合己酸菌培養(yǎng)基組分分析，確定己酸菌JZZ 菌液配方：酵母膏0.1%，醋酸鈉0.25%，底鍋水10%，硫酸鎂0.01%，硫酸銨0.05%，磷酸氫二鉀0.3%，乙醇2%vol。

2.3 己酸菌JZZ的形態(tài)觀察及其16S rDNA鑒定

2.3.1 己酸菌JZZ個(gè)體及菌落形態(tài)觀察

對(duì)己酸菌JZZ 進(jìn)行革蘭氏染色觀察個(gè)體形態(tài)。如圖6所示，己酸菌JZZ為革蘭氏陽性芽孢菌，單細(xì)胞為梭形、直桿狀，芽孢端生或近端生。在固體培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d 后，形成圓形菌落，表面平滑、乳白色，有光澤，邊緣整齊，不透明。

2.3.2 己酸菌JZZ的16S rDNA鑒定

提取菌株JZZ 的總DNA 作為模板，采用通用引物27f 和1492r 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到含有己酸菌JZZ 菌株16S rDNA 保守區(qū)的片段并對(duì)其進(jìn)行測序。JZZ 菌株的16S rDNA 序列測定由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。將菌株JZZ 的16S rDNA 序列提交美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI），通過基本本地隊(duì)列搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進(jìn)行同源性比較，用MEGA6軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

引物序列如下：27f（上游引物）：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492r（下游引物）：5′-TAC-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。

表4 JZZ菌株16S rDNA的序列比對(duì)結(jié)果

研究表明，在細(xì)菌分類學(xué)16S rDNA的同源性大于97%的為屬內(nèi)同種[11-12]。將菌株JZZ 的16S rDNA 序列在NCBI 中進(jìn)行同源性比較，同源性較高的為克氏梭狀桿菌(Clostridium kluyveri)，同源性大于99%。如表4 與圖7 所示，結(jié)合菌株JZZ的形態(tài)與分子生物學(xué)特征，可知己酸菌JZZ 鑒定為克氏梭狀桿菌(Clostridium kluyveri)[13]。

3 結(jié)論與討論

在濃香型白酒傳統(tǒng)釀造生產(chǎn)中，老窖出好酒，發(fā)酵池越老酒質(zhì)越好，老窖的重要特征在于老熟窖泥。窖泥老熟過程相當(dāng)緩漫，長達(dá)數(shù)年甚至更長時(shí)間，人工制備窖泥養(yǎng)護(hù)液或己酸菌液對(duì)窖泥的養(yǎng)護(hù)具有重要作用[14]。本研究從優(yōu)質(zhì)窖泥中分離篩選高產(chǎn)己酸菌，考察培養(yǎng)溫度、乙醇濃度、pH 值等發(fā)酵條件對(duì)己酸產(chǎn)量的影響，分析己酸菌液配方組分單因素含量的影響等。結(jié)果表明，分離篩選得到的高產(chǎn)己酸菌JZZ 為革蘭氏陽性桿菌，屬克氏梭狀桿菌（Clostridium kluyveri），其液態(tài)發(fā)酵己酸平均產(chǎn)量為4.36 mg/mL，該菌株的溫度耐受區(qū)間為36～39 ℃，乙醇耐受濃度為2%vol～6%vol，表明該菌株能夠較好的適應(yīng)發(fā)酵過程中的溫度變化，并具有一定程度的乙醇耐受性。己酸菌JZZ 較適宜的菌液配方組分添加量為硫酸鎂0.01%，硫酸銨0.05%，磷酸氫二鉀0.3%，食用酒精2%vol，16S rDNA 比對(duì)結(jié)果表明，JZZ 菌株為克氏梭狀桿菌（Clostridium kluyveri）。高產(chǎn)己酸菌的篩選及其生產(chǎn)應(yīng)用對(duì)濃香型白酒的釀造及發(fā)酵生香過程具有重要價(jià)值，本研究分離篩選的高產(chǎn)己酸菌JZZ 具有優(yōu)良的生產(chǎn)性能，其優(yōu)化培養(yǎng)的己酸菌液在人工窖泥培養(yǎng)及窖池養(yǎng)護(hù)過程中的實(shí)際應(yīng)用效果，包括對(duì)原酒產(chǎn)量和質(zhì)量的影響、窖泥老化和板結(jié)的進(jìn)程、窖泥功能微生物及其菌群變化等，還有待于進(jìn)一步的跟蹤考察。