豬繁殖與呼吸綜合征病毒、圓環(huán)病毒2型、奇異變形桿菌混合感染病例的病原學(xué)診斷

陳 靜， 楊 鵬， 尹德晶， 謝曉東， 李喬斌， 岳 筠， 程振濤*

(1. 貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025； 2. 貴州省動物疫病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽 550008)

近年來，隨著生豬養(yǎng)殖模式的多樣化及頻繁引種，豬場疫病越來越復(fù)雜，豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、豬偽狂犬病、豬圓環(huán)病毒病等疫病已成為危害養(yǎng)豬業(yè)的重要疫病，并常有混合感染[1]。其中豬繁殖與呼吸綜合征和豬圓環(huán)病毒病是免疫抑制性疫病，感染后可導(dǎo)致機(jī)體免疫力嚴(yán)重下降，極易與其他病原體混合或繼發(fā)感染，從而導(dǎo)致臨床癥狀復(fù)雜化，并造成嚴(yán)重?fù)p失和危害[2～4]。2019年11月，貴州省都勻市某養(yǎng)豬場出現(xiàn)死亡病例，通過臨床癥狀觀察，懷疑存在多種病原感染，特進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)檢查診斷。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料發(fā)病豬場送檢的病死豬2頭，無菌采集肺臟、腎臟、脾臟、肝臟、淋巴結(jié)作為檢測病料。

1.1.2 主要試劑(1)豬繁殖與呼吸綜合征病毒通用型實(shí)時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒、豬瘟病毒通用型實(shí)時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒、豬偽狂犬病病毒通用型實(shí)時熒光定量PCR檢測試劑盒，均購自北京世紀(jì)元亨公司。(2)DNA/RNA提取試劑盒、DL 2 000 DNA Marker試劑，購自大連寶生物工程有限公司。(3)培養(yǎng)基、藥敏紙片，購自杭州微生物試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 組織樣品DNA/RNA提取取病料肺臟、腎臟、脾臟、淋巴結(jié)進(jìn)行勻漿，反復(fù)凍融3次，然后12 000 r/min 離心10 min，取上清液100 μL，用DNA/RNA試劑盒提取總DNA/RNA。

1.2.2 病毒核酸檢測以提取的豬組織樣品核酸為模板，分別應(yīng)用豬繁殖與呼吸綜合征病毒通用型實(shí)時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒、豬瘟病毒通用型實(shí)時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒、豬偽狂犬病病毒通用型實(shí)時熒光定量PCR檢測試劑盒、豬圓環(huán)病毒2型PCR試驗(yàn)對相關(guān)病毒核酸進(jìn)行檢測。

1.2.3 細(xì)菌分離鑒定與藥物敏感試驗(yàn)無菌操作對病料肝臟、肺臟、腎臟、脾臟組織樣品進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)與初步鑒定，并將純化細(xì)菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定和紙片法藥物敏感試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 病毒核酸檢測結(jié)果

2.1.1 豬繁殖與呼吸綜合征病毒核酸檢測由圖1可見：陽性對照Cq值為11，1號樣品Cq值為22，2號樣品 Cq值為23，2份檢測組織均為陽性，提示存在豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染。

2.1.2 豬瘟病毒核酸檢測由圖2可見：陽性對照Cq值為32，2份檢測組織樣品Cq值均為0，提示無豬瘟病毒感染。

2.1.3 豬偽狂犬病病毒核酸檢測由圖3可見：陽性對照Cq值為24，2份檢測組織樣品Cq值均為0，提示無豬偽狂犬病病毒感染。

2.1.4 豬圓環(huán)病毒2型核酸檢測由圖4可見：2份檢測組織樣品PCR均擴(kuò)增出大小為353 bp目的基因片段，與預(yù)期擴(kuò)增片段大小相符，表明存在豬圓環(huán)病毒2型感染。

2.2 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

2.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)病料組織樣品經(jīng)37 ℃ 24 h培養(yǎng)，在2頭豬組織樣品中均分離出細(xì)菌，分離菌在普通瓊脂培養(yǎng)基上菌落呈中等大小、表面光滑、邊緣不整齊、半透明、圓形，在血瓊脂培養(yǎng)基上菌落出現(xiàn)α溶血。

2.2.2 細(xì)菌鑒定

2.2.2.1 革蘭氏染色革蘭氏染色鏡檢可見分離菌為革蘭氏陰性桿菌，大小形態(tài)不一，為單個或成對的桿狀、球桿狀、長桿狀等多種形態(tài)。

2.2.2.2 16S rRNA測序及系統(tǒng)進(jìn)化樹鑒定純化細(xì)菌擴(kuò)增出大小約1 500 bp的16S rRNA基因特異性條帶(見圖5)，與預(yù)期結(jié)果相符。將16S rRNA進(jìn)行測序，采用Megline軟件將分離菌株(命名為：GZ-DY株)序列與參考菌株序列進(jìn)行同源性和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。結(jié)果顯示：分離菌株與14株奇異變形桿菌核苷酸同源性高達(dá)100%，且進(jìn)化關(guān)系近，因此鑒定分離菌為奇異變形桿菌。見圖6、圖7。

2.2.3 藥物敏感試驗(yàn)由表1可見：分離細(xì)菌對硫酸安普霉素、硫酸粘菌素、鹽酸大觀霉素+鹽酸林可霉素、氟苯尼考較敏感；對其他藥物產(chǎn)生耐藥。

表1 分離細(xì)菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

通過病毒核酸檢測和細(xì)菌分離鑒定，確診該豬場病例為豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型、奇異變形桿菌混合感染；分離的奇異變形桿菌對多種藥物產(chǎn)生耐藥。

4 討論

4.1近年來，豬病的流行特點(diǎn)日益復(fù)雜，多病原混合、繼發(fā)、協(xié)同感染越來越普遍。豬繁殖與呼吸綜合征發(fā)病時常并發(fā)或繼發(fā)2型豬圓環(huán)病毒病、豬偽狂犬病等傳染性疾病，其中豬繁殖與呼吸綜合征和2型豬圓環(huán)病毒病混合感染較為典型[5]。2型豬圓環(huán)病毒病和豬繁殖與呼吸綜合征均屬于免疫抑制性疾病，豬群感染后免疫系統(tǒng)遭到攻擊，造成免疫機(jī)能下降，二者的協(xié)同并發(fā)加重豬免疫機(jī)能下降的程度，引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰弱綜合征 (PMWS)，易導(dǎo)致仔豬消瘦、生長緩慢[6，7]。目前，對此混合感染尚無特效治療藥物，只能通過注射疫苗免疫達(dá)到預(yù)防的目的[8]。在防制方面，豬場應(yīng)對發(fā)病豬進(jìn)行隔離飼養(yǎng)，假定健康豬緊急接種此2種疫苗；病死豬及污染物徹底焚燒或深埋無害化處理，對污染的圈舍和周圍環(huán)境進(jìn)行嚴(yán)格消毒，并帶豬消毒；對新購豬進(jìn)行嚴(yán)格的隔離和檢疫，隔離期間進(jìn)行相關(guān)病原的血清學(xué)抗體檢測。

4.2奇異變形桿菌 (Proteusmirabilis，PM) 屬于腸桿菌科，變形桿菌屬，是條件性致病菌，為人獸共患病原菌。該菌廣泛存在于水、土壤等環(huán)境中，易感動物為豬、雞、犬和羊等[9]。豬感染發(fā)病時臨床表現(xiàn)為高熱、腹瀉、嘔吐、氣喘等癥狀，嚴(yán)重時可因敗血癥而死亡[10]。臨床上多采用抗生素治療，但是由于抗生素的大量使用，不斷有新的耐藥菌株出現(xiàn)，加大了奇異變形桿菌治療的難度[11]。奇異變形桿菌的多重耐藥性已成為臨床治療中一個非常棘手的問題?？咕幬锸褂们皯?yīng)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，根據(jù)藥敏試驗(yàn)指導(dǎo)用藥，以達(dá)到控制感染的目的，同時要注意抗菌藥物交替使用，防止產(chǎn)生耐藥性。