光熱老化對常見彩繪文物蛋白膠料GC-MS鑒定分析影響的研究

馬珍珍 王麗琴 VaclavPitthard

摘要：光、熱是地上文物的重要老化形式，蛋白膠料作為彩繪文物顏料的有機(jī)分散粘接劑，更易受到光熱老化影響出現(xiàn)老化降解，導(dǎo)致氨基酸含量變化。這不僅影響氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）對其種屬的鑒定分析，更直接導(dǎo)致顏料粉化、脫落等病害。該文研究采集已光熱老化十年的動物膠原（豬骨膠）、蛋類（全蛋、蛋清、蛋黃）和酪蛋白3類常見蛋白膠料進(jìn)行GC-MS測試，結(jié)果表明，氨基酸含量、主成分聚類（PCA）位置雖出現(xiàn)改變，但3類膠依舊有極強(qiáng)的可辨識性。其中，豬骨膠具有高甘氨酸（Gly）、特征羥脯氨酸（Hyp）特點(diǎn)，蛋類絲氨酸（Ser）、天冬氨酸（Asp）含量高，酪蛋白谷氨酸（Glu）含量明顯高于其余兩種膠，后兩者具有高含量亮氨酸（Leu）特點(diǎn)。最后，將它們的氨基酸、PCA位置光熱變化規(guī)律應(yīng)用于頤和園油飾彩畫樣品鑒定，發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)材料豬血、動物膠原的混合物。該研究不僅提高了地上文物蛋白膠料GC-MS鑒定的準(zhǔn)確性，所得結(jié)果更可為探討文物劣化機(jī)理、選擇合適修復(fù)材料奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：文物蛋白膠料;GC-MS;光熱老化;氨基酸變化

中圖分類號：O657.63

DOI：10.16152/j.cnki.xdxbzr.2020-04-011開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

The influence of the photothermal aging exerting on the GC-MS

identification of the common proteinaceous binding mediain polychromy artworks

MA Zhenzhen1，2， WANG Liqin2， Vaclav Pitthard3

（1.Shaanxi Academy of Archaeology， Xi′an 710054， China;

2.School of Cultural Heritage， Key Laboratory of Cultural Heritage Research and Conservation，Ministry of Education，

Northwest University， Xi′an 710069， China;

3.Kunsthistorisches Museum Wien， Burgring 5，Vienna 1010， Austria）

Abstract： Photothermal is the major aging form for the ground art works. As the organic dispersion adhesive of polychromy pigments， proteinaceous binding media are more likely to be affected by photothermal aging， resulting in the amino acids′ contents′ changes. This influenced the GC-MS identification of their categories as well as induced a serial of diseases such as the powdering and falling off of the precious pigments. In this research， the three common proteinaceous binders collagen（pig glue）， egg（whole egg， egg white， egg yolk） and casein which had been photothermally aged for 10 years were collected to experience the GC-MS analysis. Results illustrated that the three kinds of proteinaceous binders still possessed obvious distinctions despite of the changes in their amino acids′ contents and PCA positions. To be specific， pig glue owed high amount of Gly and the specific Hyp. Egg possessed great amount of Ser and Asp while the content of Glu in casein was obviously higher. Meanwhile， the latter two both contained more Leu than pig glue. Based on the above changing laws of amino acids′ contents and PCA positions， colored painting samples taken from the Summer Palace were identified to apply tradition material pig blood and collagen as binders in the painting layer. The research not only contributes to the accuracy of GC-MS identification of proteinaceous binders in ground art works， but also provides foundation for discussing the deterioration mechanism and choosing proper restoration materials for polychromy art works.

Key words： proteinaceous binding medium; GC-MS; photothermal aging; amino acids′ changes

蛋白膠料來源廣、易獲得，是全世界古代工匠用于粘接器物、分散固定彩繪文物顏料的一種天然膠結(jié)材料［1-3］。由于其是多種氨基酸以肽鍵形式結(jié)合起來的生物高分子材料，光和熱可導(dǎo)致光氧化、光化學(xué)及熱裂解作用，致使氨基酸含量發(fā)生變化，干擾GC-MS對其種屬的鑒定分析。同時，共存的顏料等無機(jī)質(zhì)材料隨之松散、粉化、脫落，帶來極大損失。本文使用GC-MS測試分析維也納藝術(shù)史博物館（Kunsthistorisches Museum Wien）光熱老化十年的豬骨膠、全蛋、蛋清、蛋黃和酪蛋白這幾種常見文物蛋白膠料的氨基酸含量變化，探討光熱老化后的區(qū)別特征，并深入分析氨基酸含量的變化機(jī)理，以期為準(zhǔn)確分析光熱老化蛋白膠料、探討彩繪文物劣化機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與材料 GC-MS所需試劑材料同文獻(xiàn)［4］所述，豬骨膠（德國Kremer公司，產(chǎn)品號63000），維也納市售全蛋、蛋清和蛋黃（機(jī)械分離全蛋獲得），酪蛋白（德國Kremer公司，產(chǎn)品號63200）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 7890A-5975C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國安捷倫科技公司），測試條件同文獻(xiàn)［5］。KQ-50E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），Anke LXJ-IIB型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），Bond Elut OMIX 100μL SPE C4柱（美國安捷倫科技有限公司），100μL手動移液器（北京卓信偉業(yè)科技有限公司），MDS-8G型微波消解儀（上海新儀微波化學(xué)科技有限公司），TB-215D電子天平（美國丹佛儀器公司），SOL 2氙燈人工老化箱（德國Dr K.Hnle公司），ABJ220-4NM分析天平（德國Kern公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1 樣品制備 新鮮膠料樣品制備：用水作溶劑分別配制3％豬骨膠、3％酪蛋白，全蛋、蛋清和蛋黃原液，將以上5種新鮮蛋白膠液均勻涂刷于玻璃載玻片上，自然風(fēng)干備用，平行樣兩組。光熱老化膠料樣品制備：將上述制備的一組樣品置于SOL 2氙燈人工老化箱（輻射光譜能量分布與日光接近，光波范圍為300～800nm）中進(jìn)行老化。老化條件如下，光照度為120lux，輻照強(qiáng)度為910W.m-2，氙燈溫度為50℃，老化時間為900h。人工加速模擬光熱老化結(jié)束后，將樣品放置在維也納藝術(shù)史博物館的日常工作環(huán)境中，光照度為30～50lux，輻照強(qiáng)度為230～380W·m-2，溫度為16～32℃，老化時間為10a。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)測試方法 取適量1.2.1中新鮮、光熱老化的豬骨膠、全蛋、蛋清、蛋黃、酪蛋白5種膠各4份，按照文獻(xiàn)［5］所述萃取、SPE C4排雜、水解、衍生進(jìn)樣等步驟進(jìn)行GC-MS的前處理和分析，每個樣品連續(xù)進(jìn)樣至少3針（即每個樣品至少測試12次），剔除異值，篩選10組數(shù)據(jù)，計(jì)算所含11種氨基酸平均含量，這11種氨基酸為丙氨酸（Ala），甘氨酸（Gly），纈氨酸（Val），亮氨酸（Leu），異亮氨酸（Ile），絲氨酸（Ser），脯氨酸（Pro），苯丙氨酸（Phe），天冬氨酸（Asp），谷氨酸（Glu），羥脯氨酸（Hyp）。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白膠料光熱老化前后氨基酸含量變化特征

光熱老化前后豬骨膠、全蛋、蛋清、蛋黃和酪蛋白5種蛋白膠的GC-MS譜圖見圖1，可看出5種膠的蛋氨酸（Met）、賴氨酸（Lys）、酪氨酸（Tyr）均消失，這與Colombini［6］、魏書亞［7］等人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合。此外，全蛋、蛋黃和酪蛋白的磷酸（Phosphoric acid）吸收強(qiáng)度明顯降低。

5種膠老化前后氨基酸的平均含量見表1。同時，為排除實(shí)驗(yàn)誤差，在95％置信度下計(jì)算氨基酸的含量范圍，結(jié)果見表2?？煽闯?，5種膠老化后Ala，Gly，Val，Leu，Pro的下限和老化前的上限完全分離，這5種氨基酸在95％置信度含量升高。5種膠的Ile，Ser，Phe，Asp，Glu和豬骨膠的Hyp老化后上限和老化前下限完全分離，這6種氨基酸在95％置信度含量降低，所有氨基酸含量變化均非系統(tǒng)誤差導(dǎo)致。

最后，計(jì)算光熱老化后每種氨基酸含量變化值（表3）?？煽闯觯孩?種膠的Ala，Gly，Val，Leu，Pro含量均呈上升趨勢，平均增量均2％左右，Pro平均增加量相對高（2.65％），其中，GRH達(dá)3.61％。②所有膠Ile，Ser，Phe，Asp，Glu以及豬骨膠的Hyp含量呈下降趨勢，特別是Phe含量的降幅最為明顯，谷值達(dá)5.68％（GRH）。③整體而言，蛋黃氨基酸含量變化區(qū)間最大（-5.68％～3.92％），蛋清（-3.48％～2.92％）、全蛋（-4.22％～3.13％）和酪蛋白（-3.42％～2.47％）次之，豬骨膠最小（-1.35％～1.67％）。推測豬骨膠光熱老化穩(wěn)定性最高，蛋類和酪蛋白偏差，其中，蛋黃最低。

綜上所述，雖然11種氨基酸出現(xiàn)了不同程度變化，但3類膠的氨基酸含量特征迥異。其中，豬骨膠具有高含量Gly（>30％），含有特征Hyp（僅動物膠原含）的典型特點(diǎn)，蛋類Ser和Asp含量高于豬骨膠和酪蛋白，酪蛋白Glu含量明顯高于豬骨膠和蛋類。后兩者老化前后均不含Hyp以及Leu含量高于豬骨膠的特征十分顯著。

2.2 氨基酸含量變化的機(jī)理探討

2.2.1 光老化 蛋白質(zhì)是典型的高分子聚合物，當(dāng)光的能量等于或大于分子間氫鍵、原子間共價鍵的能量時，化學(xué)鍵會斷裂，蛋白質(zhì)分子隨之出現(xiàn)變性、降解等問題。受到大氣層的吸收，能到達(dá)地面的太陽光波長范圍在280～3 000nm，據(jù)愛因斯坦的光化學(xué)當(dāng)量定律：E=L×h×C／λ （L為阿伏伽德羅常數(shù)6.02×1023·mol-1，h為普朗克常數(shù)6.62×10-34J·s，C為光速3×108m·s-1，λ為光波波長），計(jì)算280～3 000nm光波波段對應(yīng)的能量范圍，然后與蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的化學(xué)鍵鍵能作對比（表4）。

由表4可知， 280～438nm波長段的光波能量區(qū)間等于或高于蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)化學(xué)鍵離解能的限值，可破壞主鏈、側(cè)基的C-N，C-S，C-C， C-O， N-H，C-H共價鍵，絲氨酸磷酸酯中的P-O共價鍵，可促使蛋白質(zhì)各種光裂解、光氧化反應(yīng)［9］，也導(dǎo)致磷酸（絲氨酸磷酸酯的水解產(chǎn)物）含量降低。

同時， 光裂解、 光氧化反應(yīng)中能形成H·，O·，C·，N·，OH·，CH3·等具有極高活性和磁距的自由基（游離基）。Davies指出，活性氧自由基幾乎會與所有氨基酸側(cè)鏈反應(yīng)［10］，且自由基的濃度與氨基酸的破壞程度存在正相關(guān)性［11］。由此看出，自由基可加速光裂解和光氧化反應(yīng)。芳香族（Phe，Tyr）氨基酸含有活潑酚羥基、Met含硫元素，與自由基有較高的反應(yīng)活性［12］，特別容易被氧化。且Phe和Tyr含有大π鍵苯環(huán)結(jié)構(gòu)，容易吸收紫外光，作用于肽鍵發(fā)生脫氫反應(yīng)，繼而與分子中的苯環(huán)形成具有顯色性的共軛體系，會發(fā)生明顯的光氧化反應(yīng)［13-14］，詳見圖2和圖3。

因此，5種膠料經(jīng)過光老化后出現(xiàn)Phe含量顯著降低，Tyr基本消失的結(jié)果。研究表明，這兩種氨基酸的劣化是造成蛋白質(zhì)光降解的主要原因［15］，蛋白質(zhì)因此會出現(xiàn)泛黃、脆損等現(xiàn)象。

2.2.2 熱老化

研究表明，氨基酸的熱穩(wěn)定性排序?yàn)椋╒al，Leu）>Ile>Tyr>Lys>Met>Ser>（Asp，Glu）［16］。因此，熱穩(wěn)定性偏差的Asp，Glu，Ser，Met，Lys，Tyr和Ile含量降低，Val和Leu因良好的熱穩(wěn)定性而含量升高。

具體而言：①含有可電離側(cè)鏈的氨基酸（Asp，Glu，Lys）比脂肪族氨基酸老化的速率快［17］，Asp先失去與α碳原子連接的羧基，生成另一氨基酸的中間產(chǎn)物，隨后出現(xiàn)另一端部分亞甲基和羧基的脫落，形成較小的胺分子［18］。隨著酸性、堿性氨基酸殘基（Asp，Glu，Lys）含量的降低，蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性減弱［19］。②Ser，Hyp和Tyr含有-OH和酚羥基活性基團(tuán)，易發(fā)生氧化反應(yīng)，可加劇蛋白膠料的劣化程度［20］。③含S元素的Met與蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定也有一定關(guān)系，Met的巰基在蛋白亞基內(nèi)部和亞基間可構(gòu)成二硫鍵，能維持蛋白的空間構(gòu)象，使其具有良好熱穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)表明，含硫氨基酸越高，熱穩(wěn)定性越好［21］。但隨著熱老化的推移，二硫鍵可出現(xiàn)斷裂，Met含量降低，不利于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。

上述光、熱老化機(jī)理的討論，解釋了2.1中Ile，Ser，Asp，Glu，Lys，Hyp，Met，特別是芳香族氨基酸（Phe，Tyr）含量降低、消失。Ala，Gly，Val，Leu，Pro含量升高的結(jié)果。

2.3 光熱老化對蛋白膠料主成分鑒定分析（PCA）的影響

將新鮮和光熱老化后的豬骨膠、全蛋、蛋清、蛋黃、酪蛋白5種膠料的氨基酸含量導(dǎo)入SPSS軟件中，采用因子分析法進(jìn)行處理（提取因子方式：特征根值>1，前兩個因子累積貢獻(xiàn)率為81％，可有效代表數(shù)據(jù)信息），提取這兩個因子作散點(diǎn)圖4?？汕宄^察到，3類膠料經(jīng)歷光熱老化后PCA位置出現(xiàn)變化，其中，豬骨膠向Factor 1軸負(fù)、Factor 2軸正向（左上方）輕微移動，蛋類和酪蛋白朝左上方明顯偏移，推測豬骨膠的光熱老化穩(wěn)定性整體優(yōu)于蛋類和酪蛋白，與2.1氨基酸含量變化程度的討論相符。

為進(jìn)一步分析該位置變化的原因，得到因子載荷圖5，可以看出：①高含量Leu，Ile和Glu是引起樣品朝Factor 1軸正向移動的關(guān)鍵因素，高Phe，Asp，Val，Ser同樣起到重要作用。高含量Gly，Hyp是引起樣品朝Factor 1軸負(fù)向移動的關(guān)鍵因素，高Ala，Pro作用次之。②Pro含量高可使樣品向Factor 2軸的正向偏移，高含量Glu，Val，Ile和Hyp作用次之。Ser和Asp含量高，可促使樣品向Factor 軸2負(fù)向偏移，高Ala和Phe同樣起到重要作用。

結(jié)合上述以及2.1中對蛋白膠料氨基酸光熱老化含量變化的探討可知，3類蛋白膠料PCA位置向Factor 1軸負(fù)向、Factor 2軸正向（左上方）移動的關(guān)鍵因素為Pro，Gly含量的升高以及Phe，Asp和Ser含量的降低。

2.4 地上文物樣品蛋白膠料的鑒定分析

以上述探討的光熱老化對常見蛋白膠料GC-MS氨基酸、PCA鑒定分析影響的研究結(jié)論為基礎(chǔ)，選取頤和園涵虛堂、邀月門、共一樓、仁壽殿等5處8個油飾彩畫（露天，光熱老化最顯著，表5）文物樣品進(jìn)行GC-MS的氨基酸定性、定量分析，以判定膠料的種類。

YH-2等8個樣品的氨基酸含量結(jié)果見表6，它們均含有動物膠原特征氨基酸Hyp，據(jù)此推測都包含動物膠原。為進(jìn)一步確定膠料種類，將其與新鮮、光熱老化后的豬骨膠、全蛋、蛋清、蛋黃、酪蛋白及新鮮豬血的氨基酸含量數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS中，提取前兩個因子作散點(diǎn)圖6，可以看出。

1）樣品YH-7完全落于豬血區(qū)域，其GC-MS譜圖特征同豬血幾乎完全匹配（圖7），此外，Hyp的存在也證實(shí)該樣品包含有動物膠原。

2）其余樣品均位于動物膠原和豬血之間，推測它們既含有豬血，也含有動物膠原。其中，YH-12-1和YH-12-2距離豬血很近，推測其豬血成分高。YH-19位置偏離其他樣品，結(jié)合其取自柱子處，受環(huán)境污染明顯，因此位置略偏移。

3）按照豬骨膠、 蛋類和酪蛋白3類膠光熱老化后PCA位置向左上方移動的規(guī)律， 推測新鮮豬血在光熱老化后也將朝左上方移動， 這符合所有樣品的聚類位置， 更加證實(shí)了樣品中含有豬血成分。

利用血色原結(jié)晶法發(fā)現(xiàn)頤和園油飾彩畫樣品地仗層中含有豬血［22］，但受到樣品復(fù)雜性、實(shí)驗(yàn)低靈敏度的影響，血色原結(jié)晶法分析豬血的方法受到一定制約。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，GC-MS技術(shù)靈敏度極高、分辨性極優(yōu)，可被用于樣品量更少、成分極復(fù)雜的顏料層豬血分析，相信在地仗層豬血的分析中也將具有十分廣闊的應(yīng)用前景，但需后期進(jìn)一步試驗(yàn)探索。

縱觀歷史，豬血一直是國內(nèi)外重要的古建筑、繪畫材料。如2000年前古希臘、埃及和古羅馬人已將豬血用作建筑材料，墨西哥殖民時期牛血是建筑灰漿的重要組成部分［23］;Schilling等利用GC-MS和免疫法驚奇地發(fā)現(xiàn)印第安人將人血和動物血混合在一起用于繪畫材料，推測這可能與宗教信仰有關(guān)［24］。在我國古代文化遺產(chǎn)中，血料也扮演著重要角色，金沙江邊中石器時代巖畫的繪制已將動物血作為膠黏劑［25］。法王和佛學(xué)大師用自己的鼻血繪唐卡，是唐卡藝術(shù)中獨(dú)一無二的現(xiàn)象，可直接使用或通過與顏料調(diào)和進(jìn)行畫面繪制，該做法的宗教含義高于審美價值［26］。資料表明［23］，豬血具有良好的粘接、防水、抗龜裂性能，因此備受古代工匠青睞。

3 結(jié) 論

受氨基酸自身熱穩(wěn)定性、所含活潑基團(tuán)和光熱產(chǎn)生的斷鍵能量、自由基等因素影響，光熱老化十年的豬骨膠、全蛋、蛋清、蛋黃和酪蛋白所含Ile，Ser，Asp，Glu，Hyp，Met，Lys，尤其是芳香族Phe、Tyr含量降低，Ala，Gly，Val，Leu，Pro含量隨之升高。由此帶來上述膠料PCA位置的移動，但3類蛋白膠仍具有不同的氨基酸含量和PCA位置區(qū)別特征，且動物膠原光熱老化穩(wěn)定性優(yōu)于蛋類和酪蛋白。將上述變化規(guī)律用于頤和園不同建筑油飾彩畫顏料層膠料分析，發(fā)現(xiàn)豬血和動物膠原的混合物，該結(jié)論是基于其他膠料光熱老化規(guī)律推測所得，需要對豬血的光熱老化展開進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)和探討。

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（編 輯 李 波）