循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測用于卵巢癌診治的臨床價值*

楊 璨，王 輝

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，重慶 400016）

卵巢癌作為女性生殖道腫瘤病死率最高的惡性腫瘤［1］，臨床早期診斷困難，發(fā)現(xiàn)時多為晚期，預(yù)后差，治療方案以切除既有癌組織輔以鉑類、紫杉醇為基礎(chǔ)的化學(xué)治療（化療）為主，以此延長患者的總生存期（OS）及無進(jìn)展生存期（PFS）［2］?，F(xiàn)今多樣化的治療方案輔以抗腫瘤血管生成藥物（如貝伐單抗）、聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶（PARP）抑制劑（如奧拉帕尼）［3 -4］等的臨床使用，雖不同程度延長了患者的PFS，但術(shù)后殘留的病灶或肉眼無法識別的微小病灶依舊是影響預(yù)后的重要因素［5］。目前的手段主要是通過腫瘤標(biāo)志物或影像學(xué)的檢測對卵巢癌患者進(jìn)行隨訪，而對某些腫瘤標(biāo)志物陰性的患者，僅可通過影像學(xué)的評估變化其狀態(tài)，缺乏早期診斷、療效評估及預(yù)后評估的有效手段。循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）檢測因具有采用血樣標(biāo)本的可操作性、可重復(fù)性及前瞻性的優(yōu)勢，成為卵巢癌臨床監(jiān)測必備手段。

1 CTCs

1.1 定義

CTCs 是由自發(fā)或診療操作，源于實(shí)體腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶，且只有少數(shù)具有高活性的CTCs 可逃離機(jī)體的免疫損傷而存活，并通過血液運(yùn)行轉(zhuǎn)移到其他組織器官中形成轉(zhuǎn)移灶的稀有細(xì)胞［6］。自1869 年首次報道在1 例轉(zhuǎn)移性癌癥患者的血液中觀察到CTCs 開始［7］，再到1889 年的“種子土壤學(xué)說”—— 腫瘤微環(huán)境提供腫瘤增殖及侵襲的相關(guān)分子，如細(xì)胞因子、生長因子等可促進(jìn)細(xì)胞遷移，經(jīng)過數(shù)百年時間，CTCs 的臨床價值和研究潛力正被逐漸顯現(xiàn)。近20 年P(guān)ubMed 上相關(guān)發(fā)文情況見圖1。

圖1 PubMed 近20 年發(fā)表關(guān)于CTCs 的文章量

1.2 轉(zhuǎn)移

腫瘤患者生存期短的原因主要是腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，但轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的機(jī)制還遠(yuǎn)未闡明。最近有研究表明，腫瘤轉(zhuǎn)移存在以下2 種模式。

1）傳統(tǒng)的模型是單個腫瘤細(xì)胞依賴上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），即原發(fā)腫瘤的上皮細(xì)胞獲得脫離原發(fā)灶浸潤周圍組織進(jìn)入血液的能力，進(jìn)入血液形成CTCs，逃逸機(jī)體免疫，適應(yīng)新的腫瘤微環(huán)境，在患者其他組織器官間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化（MET）形成新的轉(zhuǎn)移灶［8］。原發(fā)腫瘤以EMT 形式進(jìn)行轉(zhuǎn)移，CTCs 在血液中以上皮型、混合型、間質(zhì)型3 種形式存在。且相關(guān)研究表明，若在血液中發(fā)現(xiàn)較多混合型或間質(zhì)性CTCs，表明患者轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的風(fēng)險增大［9］。

2）原發(fā)腫瘤以鏈、團(tuán)或聚集成循環(huán)腫瘤細(xì)胞簇的形式浸入周圍組織，并向受損血管內(nèi)灌注，CTCs 簇吸引血細(xì)胞形成微血栓，與單個CTCs 相比存活率更高、外滲速度更快、侵襲性更強(qiáng)［10］。LEE 等［11］在一項(xiàng)納入24 例原發(fā)性卵巢癌和30 例復(fù)發(fā)患者的前瞻性研究中發(fā)現(xiàn)，在復(fù)發(fā)患者和耐藥患者血液中能找到更多的CTCs 簇，提示其與總體生存率呈負(fù)相關(guān)。無論腫瘤細(xì)胞通過何種方式進(jìn)行轉(zhuǎn)移，患者血液中的CTCs 被視為最主要的潛在轉(zhuǎn)移因素之一，監(jiān)測不同類型的CTCs 更利于準(zhǔn)確判斷預(yù)后、有效診斷及制訂更實(shí)用的治療方案。

1.3 檢測

1 mL 血液中含有數(shù)十億個細(xì)胞，而CTCs 非常罕見，僅占白細(xì)胞總數(shù)的1/（106～107），如何克服其數(shù)量少帶來的技術(shù)限制是目前集中研究的問題。CTCs 的檢測一般通過富集和鑒定2 個步驟進(jìn)行檢測。

富集：由于CTCs 的稀缺性，必須在被發(fā)現(xiàn)前進(jìn)行富集，目前所有技術(shù)主要依賴細(xì)胞的生物學(xué)特性及其固有物理特性。

1）依賴細(xì)胞生物學(xué)特性的富集技術(shù)，利用特定標(biāo)志物，這些標(biāo)志物由腫瘤細(xì)胞表達(dá)但血細(xì)胞不表達(dá)［如上皮細(xì)胞黏附分子（EpCAM）］及由血細(xì)胞表達(dá)但CTCs 不表達(dá)（如CD45），再以磁珠與相應(yīng)抗體結(jié)合，利用其復(fù)合物的磁性進(jìn)行富集［12］。目前臨床最常用的是被美國食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)的依賴EpCAM 抗體的Cellsearch 檢測系統(tǒng)，利用免疫磁珠對7.5 mL 外周血中的CTCs 進(jìn)行富集［13-14］，多用于評估晚期轉(zhuǎn)移性乳腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌等的預(yù)后，但VAN BERCKELAER 等［15］指出，在卵巢上皮癌中依賴EpCAM 的富集方式得到的結(jié)果欠佳，其原因可能為卵巢上皮癌中EpCAM 陽性的CTCs 較少及EpCAM 在EMT 過程中減少。故在此基礎(chǔ)上，為了彌補(bǔ)Cellsearch 只能識別表達(dá)EpCAM 腫瘤的缺陷，新技術(shù)利用的抗體不僅能識別上皮腫瘤標(biāo)志物EpCAM 和細(xì)胞角蛋白（CK）7/8/18/19、白細(xì)胞標(biāo)志物CD45，還能篩選間質(zhì)腫瘤標(biāo)記物波形蛋白（Vimentin）和Twist 蛋 白［16］，從 而 有 效 富 集 各 類CTCs。

2）依賴細(xì)胞固有物理特性的富集技術(shù)，可幫助CTCs 與血液中的正常細(xì)胞（如白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、造血干細(xì)胞）區(qū)分開而無須生物標(biāo)記。在這些物理特性主要集中在CTCs 和血細(xì)胞特性的差異上，主要是細(xì)胞大小、細(xì)胞可變性及電學(xué)性上，如利用上皮腫瘤細(xì)胞比外周血細(xì)胞大的膜過濾法（ISET），能迅速在不破壞細(xì)胞形態(tài)的前提下分離CTCs［16］；還有利用細(xì)胞密度梯度進(jìn)行分離的方法，但試驗(yàn)溫度及操作時間控制不當(dāng)會使細(xì)胞受到破壞而降低其純度。

鑒定：CTCs 被富集后需再次鑒定，依賴其本身抗原及腫瘤遺傳特異性，主要采用免疫細(xì)胞化學(xué)（ICC）及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）2 種檢測方法［17］。ICC 是利用熒光抗體與腫瘤標(biāo)記物特異性結(jié)合的技術(shù)，具有較高敏感性，再聯(lián)合流式分析技術(shù)，即利用ICC 標(biāo)記的熒光信號，對CTCs 實(shí)現(xiàn)快速高效分選及定量分析；RTPCR 主要是發(fā)現(xiàn)血液中腫瘤表達(dá)的相關(guān)mRNA，然后將mRNA 鏈逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過PCR 擴(kuò)增多個相關(guān)腫瘤標(biāo)志物，分析其表達(dá)模式［18］。

2 卵巢癌的臨床診斷

卵巢癌由于發(fā)現(xiàn)晚、診斷困難影響了患者的有效治療時機(jī)，故目前臨床急需發(fā)現(xiàn)早期診斷卵巢癌的有效方法。

ZHANG 等［19］采用免疫磁珠法對109 例卵巢癌患者測定CTCs，并對其中51 例患者同時檢測CTCs 及糖蛋白125（CA125），發(fā)現(xiàn)90.00%的初診患者檢測出CTCs，且CTCs 的數(shù)量與分期相關(guān)（P＝0.034），ⅠA ～ⅠB 期患者CTCs 的陽性率為92.16% ，遠(yuǎn)高于同一患者CA125 的陽性率（64.47%），提示CTCs 檢測較CA125可早期診斷卵巢癌。

PEARL 等［20］利用功能性富集法收集術(shù)前疑似卵巢上皮癌的129 例患者CTCs，將其中58 例良性、Ⅰ、Ⅱ期疾病患者進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)CTCs 檢測在Ⅰ、Ⅱ期敏感性為40.85% ，特 異 性 為95.10% ，陽 性 預(yù) 測 值（PPV）為77.80%，然而CA125 特異性僅為76.20%，再次提示CTCs 可作為卵巢癌早期診斷指標(biāo)之一。

SUH 等［21］前瞻性收集術(shù)前未明確附件包塊性質(zhì)的87 例患者血清腫瘤標(biāo)志物CA125、ROMA 值、CT 或MRI 及CTCs，發(fā)現(xiàn)在早期癌癥中CTCs 檢測較其他檢測方式敏感性更高，提示CTCs 對術(shù)前附件包塊的良惡性鑒別具有重要意義。

RIED 等［22］以ISET 法收集癌癥患者及有高危因素的但無癥狀患者的CTCs，發(fā)現(xiàn)所有癌癥患者和半數(shù)篩查無癥狀患者均檢測到CTCs，在CTCs 呈陽性的10 個月內(nèi)，20%的篩查患者中發(fā)現(xiàn)了早期癌癥病變，提示利用CTCs 進(jìn)行篩查可升高附件惡性腫瘤早期發(fā)現(xiàn)率。

3 卵巢癌的療效評估及指導(dǎo)個體化用藥

丁凌雁等［23］利用流式細(xì)胞儀收集60 例晚期卵巢癌（Ⅲ～Ⅳ期）患者化療2 周期前后CTCs，研究結(jié)果顯示，化療后患者CTCs 減少，且提示CTCs 減少的患者較外周血CTCs 計數(shù)≥5 的患者平均PFS 延長約6 個月（13.2 個月比6.4 個月），提示CTCs 與患者化療療效及預(yù)后有關(guān)。

目前，卵巢癌一線化療方案以鉑類為主，鉑類藥物主要作用于腫瘤細(xì)胞DNA，引起腫瘤細(xì)胞DNA 復(fù)制障礙，從而抑制其分裂，機(jī)體由此開始反應(yīng)，細(xì)胞內(nèi)核酸切除修復(fù)系統(tǒng)開始修復(fù)鉑類藥物對細(xì)胞造成的損傷，其中最主要的基因?yàn)榍谐迯?fù)交叉互補(bǔ)組1（ERCC1）基因［24］。

CHEBOUTI 等［25］采用單鏈RT-PCR 對ERCC1 進(jìn)行分離，發(fā)現(xiàn)以鉑類為基礎(chǔ)化療的卵巢癌可能導(dǎo)致ERCC1 基因陽性的CTCs 增加，修復(fù)鉑類藥物對癌癥細(xì)胞造成的損害，從而削弱鉑類化療療效，提示ERCC1 基因可作為診斷卵巢癌耐藥基因之一。

OBERMAYR 等［26］還在對比卵巢癌患者外周血樣本時發(fā)現(xiàn)，化療后鉑耐藥的患者比鉑敏感的患者更能檢測到親環(huán)素C（PPIC）陽性的CTCs，提示PPIC 可能與卵巢癌患者鉑耐藥有關(guān)。

CHEBOUTI 等［27］檢測91 例卵巢癌患者術(shù)前及化療后CTCs，發(fā)現(xiàn)以鉑類為基礎(chǔ)化療的卵巢癌患者出現(xiàn)EMT-CTC 聚集，并引起CTCs 的分子表型向間質(zhì)表型（如Twist，PI3Kα，Akt-2）轉(zhuǎn)化，提示腫瘤可能向鉑耐藥方向發(fā)展。

CTCs 不僅能作為評估卵巢癌患者化療的參考指標(biāo)，還提供對化療可能產(chǎn)生反應(yīng)的相應(yīng)特殊基因，為及時更換化療方案提供可監(jiān)測的手段。

4 卵巢癌預(yù)后

POVEDA 等［28］通過Cellsearch 系統(tǒng)納入216 例復(fù)發(fā)的晚期卵巢癌患者CTCs，并囊括CA125、鉑敏感性、腫瘤最大直徑等多因素分析，發(fā)現(xiàn)CTCs 多患者較CTCs陰性患者的病情進(jìn)展及死亡風(fēng)險高（分別為1.58 及1.54 倍），提示CTCs 數(shù)量與預(yù)后呈反相關(guān)。

董小麗等［29］收集31 例術(shù)后將行周期化療的卵巢上皮癌患者，在術(shù)后化療開始前、3 次化療后1 周內(nèi)、6 次化療后1 周內(nèi)收集CTCs，發(fā)現(xiàn)隨著化療的逐步進(jìn)行，CTCs 整體呈下降趨勢，12 例完成6 個月隨訪的患者中4 例復(fù)發(fā)，CTCs 陽性且以間質(zhì)型和混合型CTCs 為主，表明化療后仍能檢測出CTCs 的卵巢癌患者，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移概率越高，預(yù)后越差。

ZHOU 等［30］在Meta 分析中匯集11 篇文獻(xiàn)，囊括1 129 例卵巢癌患者，指出與CTCs 陰性組相比，CTCs陽性組患者的OS、PFS 及無病生存期（DFS）更短，且指出CTCs 的存在與血清腫瘤標(biāo)志物CA125 的增加有關(guān)，再次提示CTCs 可作為監(jiān)測卵巢癌預(yù)后的指標(biāo)之一。

5 結(jié)語

CTCs 的優(yōu)勢主要基于其獨(dú)特的潛力提供了“液體活檢”樣本，易得到疾病在多個時間點(diǎn)的樣本信息，可用于評估早期療效，幫助建立個性化的治療方法，提高療效減少成本。CTCs 在DNA 和RNA 及所表達(dá)的特征蛋白質(zhì)水平均可作為“液體活檢”方法。有研究分析ctDNA與腫瘤活檢中發(fā)現(xiàn)的突變和表觀遺傳變化具有一致性，且可能較CTCs 對治療期間的微小殘留灶有更高的敏感性［31-32］。在美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）官方網(wǎng) 站（https：/ /clinicaltrials.gov/ct2/home）分 別 以“Circulating Tumor Cells”“Circulating Tumor DNA”為關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索（2020 年1 月15 日），顯示有860 篇及405 篇臨床研究正在進(jìn)行。在尋找各個類型癌癥時，發(fā)現(xiàn)了系列評估CTCs 和ctDNA 作為“液體活檢”作用的臨床研究（見圖2），雖然這些研究采取不同方式、不同人群、不同標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，但仍可能成為推進(jìn)“液體活檢”作為新一代腫瘤標(biāo)志物檢查的證據(jù)。

圖2 NIH 官方網(wǎng)站基于CTCs 和ctDNA 所獲得的各類腫瘤臨床研究

目前，CTCs 的臨床意義已在多種類型實(shí)體腫瘤中得到有效評價，盡管其檢測正逐步應(yīng)用于臨床，但還存在以下不足：1）目前找尋外周血CTCs 的方式有限，尚無統(tǒng)一檢測標(biāo)準(zhǔn)；2）檢查費(fèi)用高昂，經(jīng)濟(jì)實(shí)用性欠佳；3）多數(shù)研究無法證明CTCs 在外周血釋放規(guī)律，且無大數(shù)據(jù)隨訪患者相關(guān)生存期及療效。上述原因可能會影響CTCs 檢測在臨床的廣泛應(yīng)用。但通過CTCs 檢測的不斷探索、更新及大樣本數(shù)據(jù)臨床試驗(yàn)的逐步開展，若能統(tǒng)一CTCs 相關(guān)抗原標(biāo)記物，增加其敏感性及特異性，逐步降低檢測費(fèi)用，CTCs 檢測在卵巢惡性腫瘤中的臨床使用前景及實(shí)用價值將得到進(jìn)一步提升。