基于多平臺數(shù)據(jù)識別胰腺導(dǎo)管腺癌預(yù)后相關(guān)腫瘤微環(huán)境基因

蒲垠全 馬雨凡 彭莉 湯小偉 彭燕

西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，瀘州 646000

PDAC是最常見的惡性腫瘤之一，其預(yù)后不良，目前居癌癥死亡原因第7位，預(yù)計將在未來上升到第3位[1]。目前研究認(rèn)為，胰腺周圍復(fù)雜的區(qū)域解剖結(jié)構(gòu)、高侵襲性和獨特的腫瘤微環(huán)境是導(dǎo)致其預(yù)后不良的主要原因。盡管在過去的幾十年里，PDAC在外科手術(shù)、放療和化療方面都取得了長足的進展，但其5年總生存率仍不到5%。免疫治療的臨床試驗也未顯示出對大多數(shù)PDAC患者的臨床益處[2]，同時也缺乏可靠的生物學(xué)標(biāo)志物來選擇有效的分子亞型。腫瘤微環(huán)境通過對T細(xì)胞浸潤形成物理和化學(xué)屏障、阻止藥物釋放等方式降低治療效果[3]，PDAC獨特的腫瘤微環(huán)境被認(rèn)為是免疫治療抵抗的主要原因之一[4]。本研究旨在探索PDAC相關(guān)腫瘤微環(huán)境，以確定影響患者預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物和潛在的免疫治療靶點。

材料與方法

一、數(shù)據(jù)集的選擇

從腫瘤基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas, TCGA)數(shù)據(jù)庫下載142例PDAC患者的基因表達譜和臨床隨訪數(shù)據(jù)，從基因表達綜合(Gene Expression Omnibus，GEO)數(shù)據(jù)庫的兩個微陣列數(shù)據(jù)集(GSE21501和GSE62452)下載168例具有完整臨床隨訪信息的PDAC患者的mRNA數(shù)據(jù)。

二、細(xì)胞類型富集分析及比較

xCell是一個用來對不同平臺的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行腫瘤微環(huán)境數(shù)字剖析的工具[5]。它整合了反卷積基因富集分析的優(yōu)點，能根據(jù)基因表達譜計算64種細(xì)胞類型(包括免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞)富集分?jǐn)?shù)，其富集分?jǐn)?shù)范圍為-1～1。本研究運用xCell網(wǎng)絡(luò)工具對基因表達數(shù)據(jù)進行細(xì)胞類型富集分析。TCGA數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)分析結(jié)果可以從xCell門戶網(wǎng)站上直接下載。對于GEO數(shù)據(jù)則需要使用R/Bioconductor軟件中的sva包來移除數(shù)據(jù)集中的批間差，然后再將規(guī)范化后的數(shù)據(jù)傳輸?shù)絰Cell網(wǎng)站進行分析。以細(xì)胞富集評分中位數(shù)將TCGA的142例患者分為高分、低分2組，使用R/Bioconductor軟件中的survival包進行單因素生存分析確定有預(yù)后價值的細(xì)胞類型，再使用GEO收集的數(shù)據(jù)集進行驗證，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

三、基因表達差異分析及比較

四、差異表達基因的功能富集分析

為了進一步了解與預(yù)后相關(guān)DEGs的功能，使用R/Bioconductor軟件中的clusterprofiler包對預(yù)后相關(guān)DEGs進行功能富集分析，包括基因本體(gene ontology, GO)分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG) 通路富集分析，其中GO包括分子功能(molecular function, MF)、生物學(xué)過程(biological process, BP)和細(xì)胞成分(cellular component, CC)。FDR<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

五、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)交互作用網(wǎng)絡(luò)的建立

運用STRING(Search Tool for the Retrieval of Interacting proteins)數(shù)據(jù)庫建立預(yù)后相關(guān)DEGs的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction, PPI)網(wǎng)絡(luò)，然后通過Cytoscape軟件進行PPI網(wǎng)絡(luò)的重建，并使用Cytoscape MCODE插件查找集群，以定位密集連接的區(qū)域，同時計算網(wǎng)絡(luò)各節(jié)點的連接度。

六、TISIDB數(shù)據(jù)庫分析共同預(yù)后相關(guān)DEGs

TISIDB數(shù)據(jù)庫是一個用于腫瘤和免疫系統(tǒng)相互作用的集成存儲門戶網(wǎng)站。本研究先確定TCGA數(shù)據(jù)集及GEO數(shù)據(jù)集兩個平臺數(shù)據(jù)的共同預(yù)后相關(guān)DEGs，再使用TISIDB數(shù)據(jù)庫來評估共同預(yù)后相關(guān)DEGs在腫瘤與免疫系統(tǒng)的交互作用。

結(jié) 果

一、細(xì)胞類型富集評分及其與PDAC患者生存率的相關(guān)性

通過xCell網(wǎng)絡(luò)工具對細(xì)胞類型富集評分，并根據(jù)富集評分中位數(shù)將PDAC患者分成高分、低分2組，結(jié)果顯示，在64種細(xì)胞類型中只有Th1細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞在TCGA和GEO數(shù)據(jù)集中具有相同的預(yù)后價值(圖1)。Th1細(xì)胞富集評分中位數(shù)在TCGA數(shù)據(jù)集和GEO數(shù)據(jù)集中分別為0.04155(0.00000～0.22100)、0.2183(0.00000～0.64560)，角質(zhì)形成細(xì)胞富集評分中位數(shù)在TCGA數(shù)據(jù)集和GEO數(shù)據(jù)集中分別為0.12850(0.01030～0.39400)、0.2700(0.00000～0.50350)，Th1細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞高分組患者的總生存率中位數(shù)均顯著低于低分組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)。

二、與PDAC患者預(yù)后相關(guān)的DEGs篩選

TCGA數(shù)據(jù)庫的142例患者Th1細(xì)胞富集高分組與低分組比較，高分組有379個基因上調(diào)，294個基因下調(diào)(圖2A)；角質(zhì)形成細(xì)胞富集高分組與低分組比較，高分組有481個基因上調(diào)，298個基因下調(diào)(圖2B)。 通過單變量生存分析并做韋恩圖(圖2C)，共篩選出216個與PDAC患者預(yù)后相關(guān)的DEGs。

三、216個DEGs的功能富集分析

對216個DEGs進行了GO分析和KEGG通路富集分析，結(jié)果顯示，以-log(矯正P值)>3設(shè)為閾值，21個BP、3個CC和5個MF被鑒定為差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)。21個BP中有9個(淋巴細(xì)胞分化、抗原受體介導(dǎo)的信號通路調(diào)控、淋巴細(xì)胞活化的調(diào)控、免疫系統(tǒng)過程的負(fù)調(diào)節(jié)、趨化因子介導(dǎo)的信號通路、B細(xì)胞活化、T細(xì)胞活化、對趨化因子應(yīng)答、細(xì)胞對趨化因子的應(yīng)答)與免疫過程密切相關(guān)(圖3A)。5條KEGG通路中4條通路(病毒蛋白與細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體的相互作用、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、趨化因子信號通路、原發(fā)性免疫缺陷)與免疫過程密切相關(guān)(圖3B)。

圖1 從GEO數(shù)據(jù)集篩選的Th1細(xì)胞(1A)和角質(zhì)形成細(xì)胞(1B )富集評分以及從TCGA數(shù)據(jù)集篩選的Th1細(xì)胞(1C)和角質(zhì)形成細(xì)胞(1D)富集評分的患者生存曲線

圖2 Th1細(xì)胞高低富集評分組(2A)和角質(zhì)形成細(xì)胞高低富集評分組(2B)的DEGs火山圖以及預(yù)后DEGs的韋恩圖(2C)

四、216個DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)和模塊化分析

為了更好地理解216個DEGs之間的相互作用關(guān)系，使用STRING網(wǎng)絡(luò)工具建立了一個包含158個節(jié)點和431個邊的PPI網(wǎng)絡(luò)(圖4A)，并使用Cytoscape MCODE插件鑒定了一個MCODE得分>5分的模塊(圖4B)，結(jié)果顯示，CCR7、CD27、CD5、CXCL13、ZAP70、MS4A1和CCL19基因的連通度顯著高于該模塊中的其他基因。

五、216個DEGs在GEO數(shù)據(jù)集中的驗證

Kaplan-Meier單變量分析結(jié)果顯示，15個基因在GEO和TCGA數(shù)據(jù)集中具有相似的預(yù)后價值，其中6個基因(CNTNAP4、DLGAP1、GIMAP7、LGI1、SFRP1、TPH1)的高表達與生存期延長有關(guān)，9個基因(FAM83A、HMGA2、ITGA3、ITGB6、KRT7、KRT13、PTGES、S100A2、UBE2C)高表達與生存期縮短有關(guān)(圖5)。

圖3 參與免疫相關(guān)的9個生物過程(3A)以及參與5條KEGG通路(3B)的基因

圖4 216個與預(yù)后相關(guān)DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)(4A)及MCODE為11.333分的模塊圖(4B)。從藍色到紅色的梯度代表基因從下調(diào)到上調(diào)的變化過程，節(jié)點大小代表指定蛋白的連通度

圖5 TCGA(5A)和GEO(5B)數(shù)據(jù)集具有相似預(yù)后價值的15個基因的Kaplan-Meier生存曲線圖

七、共同差異表達基因與免疫相關(guān)因素的相關(guān)性

在TISIDB數(shù)據(jù)庫檢索上述15個共同基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GIMAP7與胰腺癌的免疫相關(guān)因素淋巴細(xì)胞、趨化因子受體、趨化因子、免疫抑制因子、免疫刺激因子、主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex, MHC)均呈顯著正相關(guān)(圖6)。

討 論

本研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫中142例PDAC患者和GEO的168例PDAC患者資料篩選出與預(yù)后相關(guān)的Th1細(xì)胞及角質(zhì)形成細(xì)胞，依據(jù)富集評分高低分組比較來確定與PDAC預(yù)后相關(guān)的腫瘤微環(huán)境基因。通過DEGs分析和進一步的生存分析明確與PDAC預(yù)后有關(guān)的216個 DEGs。對這些DEGs的功能分析結(jié)果顯示在生物學(xué)過程GO條目和KEGG通路中有近一半的GO條目和大多數(shù)KEGG通路與免疫反應(yīng)密切相關(guān)。216個DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)顯示CCR7、CD27、CD5、CXCL13、ZAP70、MS4A1和CCL19具有更高的連通度，被鑒定為與PDAC密切相關(guān)的中樞基因。這7個基因參與了上述9個免疫相關(guān)的生物過程和4條免疫相關(guān)的KEGG通路，表明這些基因不僅與PDAC的預(yù)后密切相關(guān)，而且廣泛參與了免疫調(diào)節(jié)。

上述7個基因在腫瘤分化、轉(zhuǎn)移和預(yù)后中的作用均已有相關(guān)研究報道[5-11]。CCR7、CCL19、CD27和CXCL13是參與功能富集最多的4個基因，最有可能成為治療靶點。趨化因子CCL19及其受體CCR7可趨化樹突狀細(xì)胞進入腫瘤組織[12]，誘導(dǎo)T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞[13]及免疫細(xì)胞浸潤腫瘤組織并釋放細(xì)胞因子，還能通過ERK和PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)上調(diào)Twist基因的表達，從而調(diào)控上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)過程，抑制腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。因此，CCR7/CCL19被廣泛推薦為癌癥治療的前瞻性和實用性靶點[6]。CD27基因是腫瘤壞死因子超家族的一員，其與CD28協(xié)同作用，促進T細(xì)胞的初始激活和擴增，還能維持外周效應(yīng)細(xì)胞的擴張和存活，并增強其細(xì)胞溶解和細(xì)胞因子功能[9]。近年來有報道表明，抗人CD27單克隆抗體與PD-1阻滯劑聯(lián)合應(yīng)用可提高腫瘤疫苗和小鼠免疫治療的效果[14-15]。CXCL13基因通過其受體CXCR5發(fā)揮生物學(xué)功能，CXCL13/CXCR5軸通過整合多個信號事件包括PI3K/AKT途徑的激活、基質(zhì)金屬蛋白酶表達的增加等來促進癌細(xì)胞的增殖、存活和遷移。CXCL13/CXCR5軸還可通過下調(diào)T效應(yīng)細(xì)胞直接幫助腫瘤細(xì)胞逃避宿主免疫監(jiān)視，及誘導(dǎo)IL-10途徑間接幫助腫瘤細(xì)胞逃避T效應(yīng)細(xì)胞免疫[16]。最近，針對CXCL13或CXCR5的敲除或抑制基因療法、抑制性抗體和載藥納米粒在其他癌癥中取得了一些進展[16-18]，然而針對上述基因的PDAC的治療還鮮有報道。

本研究從GEO數(shù)據(jù)庫下載的168例PDAC患者的基因表達譜數(shù)據(jù)對上述216個DEGs 進行交叉驗證，最終確定了15個與預(yù)后相關(guān)的腫瘤微環(huán)境相關(guān)基因，包括CNTNAP4、DLGAP1、FAM83A、GIMAP7、HMGA2、ITGA3、ITGB6、KRT7、KRT13、LGI1、PTGES、S100A2、SFRP1、TPH1和UBE2C。這些基因已被多項研究證明與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，或被用作預(yù)測不同腫瘤預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物。

EMT是一個由多種腫瘤微環(huán)境因子觸發(fā)的生理過程，導(dǎo)致癌細(xì)胞從上皮到間充質(zhì)表型發(fā)生形態(tài)學(xué)和遺傳學(xué)改變，它是胰腺癌細(xì)胞高轉(zhuǎn)移潛能和耐藥性的基礎(chǔ)[19]。先前研究表明，HMGA2、ITGA3、KRT13、S100A2和UBE2C可在許多癌癥中誘發(fā)EMT，而SFRP1可抑制EMT[20-23]。本研究結(jié)果顯示，SFRP1高表達與較長的生存期相關(guān)，而HMGA2、ITGA3、KRT13、S100A2和UBE2C基因高表達與較短的生存期相關(guān)，該結(jié)果與它們在EMT中的作用機制是一致的。

本研究運用TISIDB數(shù)據(jù)庫分析上述15個共同DEGs與免疫系統(tǒng)的關(guān)系，顯示GIMAP7與多種免疫相關(guān)因子包括淋巴細(xì)胞、趨化因子、趨化因子受體、免疫抑制因子、免疫刺激因子和MHC分子存在更高的相關(guān)性。進一步觀察發(fā)現(xiàn)，GIMAP7還與鑒定的中樞基因包括CCR7、CCL19、CXCL13和CD27也密切相關(guān)。GIMAP7蛋白是一種GTP酶，屬于免疫相關(guān)蛋白(group of immunity-associated proteins，GIMAP)家族，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體。GIMAP家族蛋白在調(diào)節(jié)T細(xì)胞的發(fā)育、選擇、存活、自身免疫和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面起著關(guān)鍵作用[24-25]。Schwefel等[25]報道，GIMAP7可刺激GIMAP2的GTP水解。Dion等[26]報道，在不同胸腺亞群中，雙陰性(double negative，DN)和雙陽性(double positive，DP)個體之間的大鼠GIMAP7表達顯著增加，并且在從CD4+CD8+DP胸腺細(xì)胞過渡到CD4+或CD8+單陽性胸腺細(xì)胞期間增加。但GIMAP7參與免疫調(diào)節(jié)的機制尚不清楚，需要進一步研究。

總之，本研究鑒定了一組與PDAC預(yù)后相關(guān)的腫瘤微環(huán)境基因及其7個中樞基因，并提供了CCR7、CCL19、CD27、CXCL13和GIMAP7 5個新的PDAC免疫治療潛在靶點。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突