春油菜區(qū)抗跳甲油菜資源的篩選

柳海東 余青蘭 王瑞生 杜德志

（青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院/青海省春油菜遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家油菜改良中心青海分中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部春油菜科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站/青海省春油菜工程技術(shù)研究中心，810016，青海西寧）

油菜是世界四大油料作物之一，是我國(guó)最主要的油料作物，年種植面積730萬(wàn)hm2[1]。根據(jù)我國(guó)油菜對(duì)溫度需求的不同可以分為冬性、半冬性和春性油菜三大生態(tài)類型，春油菜主要分布在甘肅、內(nèi)蒙古、新疆、青海等高海拔、高緯度、無(wú)霜期較短的冷涼地區(qū)，年種植面積在66萬(wàn)hm2左右。我國(guó)春油菜區(qū)3種類型[甘藍(lán)型B. napusL.，AACC，2n=38；芥菜型油菜B. junceaL.，2n=36；白菜型B.rapa(campestris) L.，2n=20]的油菜都有種植，其中，以甘藍(lán)型油菜為主[2-3]。

在作物生產(chǎn)中，有各種生物壓力阻抑著其生長(zhǎng)潛力的發(fā)揮，在這些生物壓力中，害蟲(chóng)嚴(yán)重威脅作物生長(zhǎng)[4]。油菜整個(gè)生育期都有害蟲(chóng)為害，苗期主要受跳甲（油菜蚤跳甲Psylliodes punctifronsBaly）、油菜黃曲條跳甲[Phyllotreta striolata(F.)]等為害[5]。近年來(lái)，隨著油菜種植面積不斷擴(kuò)大，以及多年來(lái)單一使用化學(xué)農(nóng)藥防治油菜跳甲，使油菜跳甲對(duì)多種殺蟲(chóng)劑的抗性普遍提高，其發(fā)生與為害越來(lái)越嚴(yán)重。在南方，跳甲已取代小菜蛾（Plutella xylostellaL.）而上升為蔬菜生產(chǎn)上的頭號(hào)害蟲(chóng)[6]；在春油菜區(qū)，跳甲是油菜苗期常發(fā)性害蟲(chóng)，主要以油菜蚤跳甲和油菜黃曲條跳甲為主，常造成春油菜大面積減產(chǎn)或毀種重播[7]。鑒于跳甲給油菜、蔬菜生產(chǎn)造成的極大危害，許多學(xué)者從生物學(xué)、種群動(dòng)態(tài)及影響因子、空間分布型、植物提取物、天敵和生態(tài)控制等方面對(duì)其進(jìn)行了大量的研究工作。張茂新等[8]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，黃曲條跳甲在十字花科一季菜生長(zhǎng)期內(nèi)與寄主植物生長(zhǎng)發(fā)育期密切相關(guān)；在油菜黃曲條跳甲防治方面，目前比較有效的方法是采用生物防治和物理防治，如引入跳甲天敵、輪作、覆地膜、燈光誘殺，根據(jù)黃曲條跳甲趨黃性還可采取黃板誘殺等方法[9-10]。此外，3種植物提取物香茅草精油、香茅草提取液和白千層精油對(duì)油菜黃曲條跳甲成蟲(chóng)具有一定的防效[11]。在黃曲條跳甲種群控制方面，斯氏線蟲(chóng)可有效控制其幼蟲(chóng)種群數(shù)量，通過(guò)植物次生代謝產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)利用也可有效控制黃曲條跳甲種群數(shù)量[12-13]。

在作物抗蟲(chóng)育種中，研究昆蟲(chóng)的寄主選擇是評(píng)價(jià)和研究作物抗蟲(chóng)性的一個(gè)重要方法，通過(guò)對(duì)昆蟲(chóng)寄主選擇的研究，篩選有效的抗性品種作為抗蟲(chóng)種質(zhì)資源，可運(yùn)用于作物抗蟲(chóng)育種之中；抗蟲(chóng)因子是指導(dǎo)作物抗蟲(chóng)育種的重要依據(jù)，在抗蟲(chóng)因子中，植物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量和防御酶起著非常重要的保護(hù)作用[14-15]，植物在昆蟲(chóng)的取食迫害下，激發(fā)了體內(nèi)的苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、過(guò)氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）等防御蛋白的產(chǎn)生，它們能夠使昆蟲(chóng)中毒或者營(yíng)養(yǎng)失調(diào)，這些防御蛋白含有能夠?qū)ν庠瓷矬w造成傷害的自由基，通過(guò)防御蛋白間的相互反饋調(diào)節(jié)使自身自由基保持在正常水平，以此提高自身抗蟲(chóng)性，減少害蟲(chóng)的進(jìn)一步為害[16]。對(duì)抗病和易感小麥品種進(jìn)行蚜蟲(chóng)侵染誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)PAL、PPO、POD 3種防御性酶活性在不同小麥品種不同發(fā)育階段都出現(xiàn)不同程度的升高，說(shuō)明這3種酶在小麥抗蚜蟲(chóng)上具有一定的潛力[17]；PPO與植物抗蟲(chóng)性有著密切的關(guān)系，其主要作用機(jī)制是：催化酚類物質(zhì)氧化為醌，并將一些必需氨基酸烷基化，醌類物質(zhì)能抑制害蟲(chóng)的消化系統(tǒng)，使其營(yíng)養(yǎng)失衡。茉莉酸甲酯模擬蟲(chóng)害取食甘蔗試驗(yàn)證明，甘蔗在經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)處理后，產(chǎn)生了大量的PPO[18]。POD是參與植物應(yīng)對(duì)逆境反應(yīng)過(guò)程的關(guān)鍵酶之一，POD通過(guò)與部分酚類物質(zhì)結(jié)合，產(chǎn)生苯氧基和氧自由基，進(jìn)而直接影響植食性昆蟲(chóng)的取食，或者產(chǎn)生毒素，降低葉片的營(yíng)養(yǎng)水平及其可食性[18]。SOD主要功能是將植物中過(guò)量的氧原子轉(zhuǎn)化為水，有效控制活性氧的損害，避免或減輕蟲(chóng)害帶來(lái)的損傷，從而提高寄主植物的抗蟲(chóng)性[19]。PAL在苯丙烷類代謝途徑中起著限速的關(guān)鍵作用，其代謝過(guò)程可產(chǎn)生酚類物質(zhì)、木質(zhì)素、植保素和阿魏酸等有毒次生物質(zhì)，這些物質(zhì)對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和防御病蟲(chóng)害的攻擊有著重要作用[20]，在大麥中，PAL活性對(duì)抗蚜蟲(chóng)起關(guān)鍵作用[21]。

本試驗(yàn)通過(guò)分析油菜苗期田間跳甲為害指數(shù)及4種防御性酶活性，研究不同油菜品種（系）對(duì)跳甲的抗性，從中篩選抗跳甲油菜資源，初步探討油菜抗跳甲機(jī)制，為油菜抗跳甲育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

參試的生態(tài)型油菜品種（系）共42個(gè)，其中春性品種（系）38個(gè)，半冬性品種4個(gè)。供試品種（系）全部由青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院春油菜研究所提供，詳見(jiàn)表1。

表1 不同油菜品種（系）及來(lái)源Table 1 Ecotypes and sources of different rapeseed varieties (lines)

1.2 田間調(diào)查跳甲為害指數(shù)

采用單因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3次重復(fù)。每小區(qū)5行，行長(zhǎng)2.5m，行距0.3m，每小區(qū)調(diào)查株數(shù)不少于70株。試驗(yàn)材料于2017年3月28日、2018年3月30日播種于青海省農(nóng)林科學(xué)院試驗(yàn)地，油菜2葉期調(diào)查跳甲為害情況。苗期不施任何農(nóng)藥，土肥水管理按常規(guī)進(jìn)行。

參照賀春貴等[22]油菜蚤跳甲的為害分級(jí)方法，在油菜2葉期，調(diào)查每小區(qū)中間3行跳甲為害情況。為害情況分4級(jí)，分別為0級(jí)（未受任何損害）、1級(jí)（有損害但未形成穿孔）、2級(jí)（有洞或葉片缺失介于1/2～1）和3級(jí)（1片以上葉片缺失或心葉缺失）。計(jì)算為害指數(shù)，為害指數(shù)=（各級(jí)值×相應(yīng)級(jí)的株數(shù)的累計(jì)值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級(jí)數(shù)）×100%。利用DPS（7.05）軟件進(jìn)行方差分析、卡方聚類及相關(guān)性分析。

1.3 防御性酶活性檢測(cè)

PAL、PPO、POD和SOD活性測(cè)試盒均由南京建成科技有限公司生產(chǎn)。4種酶吸光值測(cè)定及計(jì)算方法按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。在2018年油菜出苗生長(zhǎng)至2葉期，在田間調(diào)查為害率的同時(shí)取樣。

1.3.1 PAL活性測(cè)定 取幼嫩子葉5g，將葉片研磨后按子葉重量（g）∶提取液體積（mL）=1∶9加入45mL提取液，冰水浴勻漿，10 000轉(zhuǎn)/min，4℃離心10min，取上清液待測(cè)。

1.3.2 PPO活性測(cè)定 取幼嫩子葉5g，將葉片研磨后按子葉重量∶提取液體積（mL）=1∶5加入25mL提取液，冰水浴勻漿，8 000轉(zhuǎn)/min，常溫離心10min，取上清液待測(cè)。

1.3.3 POD活性測(cè)定 取幼嫩子葉5g，按子葉重量（g）∶勻漿介質(zhì)體積（mL）=1∶9加入45mL勻漿介質(zhì)（磷酸鹽緩沖液：0.1mol/L，pH 7.0～7.4），冰水浴條件下制備成10%的組織勻漿，3 500轉(zhuǎn)/min，4℃離心10min，取上清液待測(cè)。

1.3.4 SOD活性測(cè)定 取幼嫩子葉5g，按子葉重量（g）∶生理鹽水體積（mL）=1∶9加入45mL生理鹽水，再剪碎組織，冰水浴制備勻漿，2 500～3 000轉(zhuǎn)/min，4℃離心10min，取上清液待測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同油菜品種（系）跳甲為害指數(shù)分析

不同油菜品種（系）跳甲為害指數(shù)的分析結(jié)果（表2）顯示：2017年跳甲為害指數(shù)最低的是青雜2號(hào)、青雜12號(hào)、嚴(yán)小村芥、白芥和大辣芥，為害指數(shù)分別為32.51%、31.65%、35.64%、31.15%和31.00%，與目前春油菜區(qū)主栽品種青雜5號(hào)（45.49%）差異極顯著；抗性相對(duì)較差的是大黃和青雜7號(hào)，為害指數(shù)分別為52.42%和59.29%。2018年對(duì)42個(gè)油菜品種（系）跳甲為害進(jìn)行了鑒定，抗性相對(duì)較好的有大辣芥、青雜12號(hào)、白芥、ZG2017Y和青雜2號(hào)，為害指數(shù)分別為25.05%、33.65%、34.00%、35.45%和35.76%，與其余品種（系）為害指數(shù)差異極顯著。抗性較差的是144A和39，為害指數(shù)分別為61.06%和54.02%，與其余品種（系）差異極顯著。上述分析結(jié)果表明，青雜2號(hào)、青雜12號(hào)、白芥和大辣芥在田間苗期具有較強(qiáng)的抗跳甲能力。

表2 不同油菜品種（系）間跳甲為害指數(shù)分析Table 2 Analysis of the hazard index of jumping armor among different rapeseed varieties (lines) %

2.2 不同油菜品種（系）跳甲為害指數(shù)卡方聚類

圖1 2018年不同油菜品種（系）為害指數(shù)卡方距離聚類Fig.1 Chi-square distance clustering for the hazard index of different rapeseed varieties (lines) in 2018

為了進(jìn)一步分析不同油菜品種（系）抗跳甲差異性，對(duì)2018年42個(gè)油菜品種（系）的跳甲為害指數(shù)進(jìn)行卡方聚類分析，結(jié)果（圖1）顯示：在卡方距離為0.41時(shí)，42個(gè)品種（系）被分為4類；第Ⅰ類包括跳甲為害指數(shù)最高的大黃、青雜7號(hào)和青油14號(hào)等7個(gè)品種（系）；第Ⅱ類包括對(duì)照青雜5號(hào)，白菜型油菜浩油11號(hào)、中雙7號(hào)、中雙9號(hào)、中雙11號(hào)，芥菜型油菜嚴(yán)小村芥等28個(gè)品種（系）；第Ⅲ類包括144A；第Ⅳ類包括青雜2號(hào)、青雜12號(hào)、2017ZZY、403R、白芥和大辣芥6個(gè)品種（系），這些品種（系）抗跳甲能力強(qiáng)。上述結(jié)果表明，通過(guò)跳甲為害指數(shù)卡方距離聚類，可以有效地將不同油菜品種（系）抗跳甲能力區(qū)分開(kāi)來(lái)，其中青雜2號(hào)、青雜12號(hào)、2017ZZY、403R、白芥、大辣芥6個(gè)品種（系）抗跳甲能力最強(qiáng)。

2.3 2018年4種主要防御酶活性

42個(gè)油菜品種（系）苗期的PAL活性見(jiàn)圖2，甘藍(lán)型油菜青雜2號(hào)、青雜12號(hào)和芥菜型油菜白芥、大辣芥PAL活性介于20.00～23.00U/g，在所有品種（系）中最高，其中PAL活性最高的為青雜12號(hào)（22.75U/g）。甘藍(lán)型油菜杜4695和白菜型青油21號(hào)PAL活性高于春油菜區(qū)主栽品種青雜5號(hào)（圖 2a）。

PPO活性測(cè)定結(jié)果（圖2b）顯示，青雜12號(hào)、嚴(yán)小村芥、白芥和大辣芥PPO活性達(dá)到120.00～128.00U/g，顯著高于其他品種（系），其中白芥和大辣芥PPO活性分別達(dá)到125.41和127.61U/g。此外，還有10個(gè)品種（系）PPO活性介于70.00～110.00U/g，高于春油菜區(qū)主栽品種青雜5號(hào)，在這些品種（系）中，只有2017ZZY為白菜型油菜，其余9個(gè)全為甘藍(lán)型油菜（圖2b）。

由POD活性測(cè)定結(jié)果（圖2c）可知，42個(gè)品種（系）中有27個(gè)高于青雜5號(hào)，其中青雜2號(hào)、青雜12號(hào)、白芥和大辣芥POD活性達(dá)120.00～130.00U/g，顯著高于春油菜區(qū)主栽品種青雜5號(hào)POD活性（95.00U/g），青雜12號(hào)最高（128.86U/g），比青雜5號(hào)高35.6%。

SOD活性測(cè)定結(jié)果（圖2d）顯示，青雜12號(hào)、白芥和大辣芥活性較高，分別為2 163.99、2 024.24和2 098.23U/g，顯著高于其他品種（系）；此外，還有25個(gè)品種（系）SOD活性介于1 800.00～2 000.00 U/g，與春油菜區(qū)主栽品種青雜5號(hào)達(dá)到顯著水平。

從以上結(jié)果可以看出，甘藍(lán)型油菜青雜12號(hào)、芥菜型油菜白芥和大辣芥苗期4種防御性酶活性在所有供試材料中最高，在抗跳甲育種中，可以重點(diǎn)考慮用這3個(gè)材料作為選育親本。

2.4 4種主要防御酶活性與跳甲為害指數(shù)相關(guān)性分析

圖2 2018年不同油菜品種（系）苗期4種防御性酶活性檢測(cè)結(jié)果Fig.2 The results of four defense enzyme activities in different rapeseed varieties (lines) at seedling stage in 2018

從42份不同甘藍(lán)型油菜品種（系）2018年跳甲為害指數(shù)與4種主要防御酶活性相關(guān)性分析（表3）可知，2018年跳甲為害指數(shù)與4種主要防御酶活性呈極顯著負(fù)相關(guān)，4種主要防御酶活性之間呈極顯著正相關(guān)。以上相關(guān)性結(jié)果表明，油菜苗期防御性酶活性與跳甲為害程度是相互抑制的，而主要防御酶活性之間是互相促進(jìn)的作用。

3 討論

目前，跳甲對(duì)油菜苗期的為害程度衡量指標(biāo)最常用的是田間為害指數(shù)。本研究通過(guò)對(duì)42個(gè)油菜品種（系）田間跳甲為害指數(shù)和4種主要防御酶活性檢測(cè)，從跳甲為害指數(shù)田間調(diào)查結(jié)果可以看出，青雜2號(hào)、青雜12號(hào)、嚴(yán)小村芥、白芥和大辣芥在2年中跳甲為害指數(shù)都在30.00%左右，與其他品種（系）相比都較低；甘藍(lán)型油菜跳甲為害指數(shù)顯著高于白菜型油菜和芥菜型油菜，而芥菜型油菜為害指數(shù)最低，主要原因可能有以下幾個(gè)方面：一是本研究選用的甘藍(lán)型油菜均為雙低品種（系），而白菜型和芥菜型均為雙高品種（系），甘藍(lán)型品種芥酸、硫甙含量較低，口感好，跳甲喜食；二是甘藍(lán)型油菜品種（系）與其他兩種類型相比，防御性酶活性較高的品種（系）為害指數(shù)較低；此外，油菜葉片刺毛對(duì)跳甲可能具有一定的防御作用，本研究所選用的幾個(gè)白菜型油菜和芥菜型油菜品種（系）葉表面刺毛多于甘藍(lán)型油菜品種（系）。

表3 2018年供試材料4種防御酶活性與為害指數(shù)相關(guān)系數(shù)Table 3 Correlation coefficient between hazard index and the activities of four defense enzymes in 2018

植食性昆蟲(chóng)首先是通過(guò)視覺(jué)和嗅覺(jué)尋找合適的植物，并成功定位植物，再開(kāi)始取食植物組織獲得營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)滿足自身發(fā)育[23]。昆蟲(chóng)對(duì)植物的侵害是一種依附生存，昆蟲(chóng)需要從植物體內(nèi)汲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，比如一些糖類和蛋白質(zhì)，來(lái)維持自身的生長(zhǎng)發(fā)育，而植物為防御受到侵害通過(guò)調(diào)節(jié)自身營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量來(lái)改變昆蟲(chóng)對(duì)寄主植物的選擇，植物體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量往往與抗蟲(chóng)性有很大關(guān)系，尤其是一些可溶性糖和可溶性蛋白含量與抗蟲(chóng)性有很大關(guān)系[14，24]?；瘜W(xué)殺蟲(chóng)劑的使用在保護(hù)作物生長(zhǎng)的同時(shí)也帶來(lái)一系列副作用，因此，從植物與昆蟲(chóng)的關(guān)系著手，研究植物的抗蟲(chóng)機(jī)制，對(duì)防治害蟲(chóng)有一定的幫助。同時(shí)，鑒定和篩選一些抗蟲(chóng)基因型，利用植物固有能力來(lái)抵御害蟲(chóng)侵害，減少實(shí)際生產(chǎn)中化學(xué)農(nóng)藥的使用。

防御酶PAL、PPO、POD和SOD是寄主植物防御害蟲(chóng)的主要生化指標(biāo)，在植物抗病和抗蟲(chóng)中起著重要的作用。PAL是目前研究最多的防御性酶之一，主要原因是當(dāng)植物受到外界刺激時(shí)，其在特定組織中的PAL含量會(huì)在短時(shí)間內(nèi)發(fā)生顯著波動(dòng)。在高等植物中，PAL是苯丙基代謝的第一酶，對(duì)調(diào)節(jié)植物酚類物質(zhì)的積累發(fā)揮著重要的作用，而酚類物質(zhì)在植物抗病中的作用已經(jīng)被證實(shí)[25]。POD和SOD是植物體內(nèi)活性氧清除系統(tǒng)的主要酶，逆境條件下植物體內(nèi)自由基會(huì)增多，導(dǎo)致植物體膜的結(jié)構(gòu)和透性發(fā)生改變，POD和SOD能通過(guò)彼此調(diào)節(jié)作用維持植物體內(nèi)自由基的平衡，從而減輕逆境對(duì)植物的傷害[19]。PPO是植物形成抗菌物質(zhì)的主要酶，可以促進(jìn)植物形成木質(zhì)素，有利于修復(fù)損傷的細(xì)胞壁形成防御壁[26]。

也有研究表明，油菜中防御性酶PPO和SOD的活性與油菜對(duì)黃寬條跳甲抗性關(guān)系不明顯[14]，但通過(guò)對(duì)水稻抗蟲(chóng)性研究表明，植物在受到害蟲(chóng)迫害時(shí)，這4種防御酶活性升高[26-27]。本研究結(jié)果也顯示不同抗性油菜品種（系）間PAL、PPO、POD和SOD活性差異明顯，并且不同油菜品種（系）跳甲為害指數(shù)與4種防御酶活性呈極顯著負(fù)相關(guān)，說(shuō)明抗跳甲能力越強(qiáng)的品種（系）這4種酶活性越強(qiáng)。從本研究結(jié)果可以看出，甘藍(lán)型油菜青雜12號(hào)、芥菜型油菜大辣芥和白芥2年大田鑒定中跳甲為害指數(shù)最低，苗期4種防御性酶活性最高，是抗跳甲育種的理想材料。前期研究結(jié)果表明，芥菜型油菜跳甲抗性顯著高于甘藍(lán)型和白菜型[28]，本研究中共有6個(gè)芥菜型參試材料，其中有4個(gè)材料的跳甲為害指數(shù)顯著低于大多數(shù)甘藍(lán)型和白菜型品種（系），4種防御酶活性也高于其他供試品種（系），進(jìn)一步說(shuō)明芥菜型油菜具有較強(qiáng)的抗跳甲能力。此外，目前研究中4種防御酶活性之間也呈極顯著正相關(guān)，這4種酶之間如何相互影響和互作機(jī)制目前尚不清楚，還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)42個(gè)油菜品種（系）田間跳甲為害指數(shù)分析及4種防御性酶活性檢測(cè)，篩選出春油菜區(qū)抗跳甲能力最強(qiáng)的品種為甘藍(lán)型油菜品種青雜12號(hào)、芥菜型油菜品種大辣芥和白芥，這3個(gè)品種可以作為后期抗跳甲新品種選育的親本。同時(shí)得出，芥菜型油菜抗跳甲能力較強(qiáng)。