高通量測序技術(shù)分析無特定病原體級實驗小鼠腸道的菌群組成

李 惠，馮 潔，韓立中

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院a.檢驗系，b.臨床微生物科，上海 200025；2.上海實驗動物研究中心 上海市實驗動物質(zhì)量監(jiān)督檢驗站，上海 201203）

隨著生命科學(xué)的快速發(fā)展，發(fā)達國家在生命科學(xué)研究、藥品及生物試劑生產(chǎn)、食品檢驗和航天工業(yè)中使用的實驗動物均已達到無特定病原體（specific pathogen free,SPF）級，我國也要求在2010 年普及使用SPF 級實驗動物[1]。歐洲實驗動物聯(lián)合會（Federation of European Laboratory Animal Science Associations,FELASA）定期發(fā)布和更新詳細全面的實驗動物健康監(jiān)控指南和人員培訓(xùn)計劃，詳細闡述了監(jiān)測病原體的種類、采樣要求和檢測方法等[2]。我國最新發(fā)布的實驗動物國家標(biāo)準(zhǔn)《實驗動物微生物學(xué)等級及監(jiān)測（GB 14922.2-2011）》中指出，SPF 級實驗動物是指除清潔動物應(yīng)排除的病原外，不攜帶主要潛在感染或條件致病菌和對科學(xué)實驗干擾大的病原，簡稱SPF 級實驗動物。針對無特定微生物，我國實驗動物國家標(biāo)準(zhǔn)列舉了8 個必須排除的菌屬或菌種，分別為沙門菌屬（Salmonella spp.）、支原體屬（Mycoplasma spp.）、鼠棒狀桿菌（Corynebacterium kutscheri）、泰澤病原體（Tyzzer′s Organism）、嗜肺巴斯德桿菌（Pasteurella pneumotropica）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella peneumoniae）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。即SPF 級實驗動物不帶有對人或動物本身致病的微生物，但非特定的微生物是允許存在的，且不能排除可經(jīng)胎盤屏障垂直傳播的微生物。然而在特定條件下，“非”病原體可以成為病原體，目前對于部分病原體尚缺乏有效的檢查手段。最近有研究表明，動物腸道微生物其實對實驗結(jié)果有較大影響，許多科研結(jié)果不能重復(fù)也歸咎于腸道菌群的影響[3]。

實驗動物是否達到了SPF 級別，其重要的評價手段就是微生物質(zhì)量監(jiān)測，必須建立一套完整且高通量的微生物檢測體系，來確保大批量的實驗動物不攜帶應(yīng)排除的病原體。本研究在比較國內(nèi)外實驗動物細菌監(jiān)測方案后，選取部分細菌指標(biāo)作為調(diào)查項目，旨在建立一個將SPF 級實驗小鼠腸道內(nèi)容物病原菌的篩選與高通量測序技術(shù)相結(jié)合的技術(shù)平臺，探討其腸道菌群結(jié)構(gòu)分析的方法，從微生物質(zhì)量角度評估SPF 級實驗小鼠質(zhì)量，為提升實驗動物的微生物檢測水平提供技術(shù)支撐。

材料與方法

一、材料

選取14 個品系共65 只SPF 級健康成年小鼠（見表1），雌鼠33 只，雄鼠32 只，由上海實驗動物研究中心提供，所有實驗動物飼養(yǎng)于屏障環(huán)境，飼養(yǎng)環(huán)境及條件相同，均隨機取自各飼養(yǎng)籠中。

表1 65 只SPF 級小鼠樣本編號其品系分布

二、材料與方法

1.腸道內(nèi)容物總DNA 抽提：無菌采集處死后SPF 級健康成年小鼠回盲部腸道內(nèi)容物，稱重3～5 g，立即置于無菌采樣盒內(nèi)，于-80 ℃下冷凍保存。取150 mg 冰凍樣品，采用TIANGEN（天根）生化科技有限公司提供的糞便基因組DNA 抽提試劑盒抽提糞便DNA[盡量使DNA 濃度大于100 ng/μL，吸光度值（A）280/260介于1.8～2.0 之間，并確保DNA 無降解]，在完成濃度測定及瓊脂糖凝膠電泳評定后，保存于-20 ℃冰箱中。

2.16S rDNA 基因擴增、純化及測序

（1）PCR 擴增：用338F（5′-ACTCCTACGGGA GGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTW TCTAAT-3′）引物對樣本中細菌16S rRNA 基因的高可變V3～V4 區(qū)進行PCR 擴增。擴增程序為，95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共27 個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min（ABI GeneAmp?9700 型PCR 儀）。擴增體系為20 μL，包括5×FastPfu 緩沖液4 μL，2.5 mmol/L 的dNTPs 2 μL，0.8 μL 引物（5 μmol/L），F(xiàn)astPfu 聚合酶0.4 μL；10 ng DNA 模板。

（2）Illumina MiSeq 測序：使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR 產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA 凝膠提取試劑盒（Axygen Biosciences,Union City,CA,USA）進行純化，Tris-HCl 洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。利用QuantiFluorTM-ST（Promega,USA）進行定量檢測。根據(jù)Illumina MiSeq 平臺（Illumina,San Diego,USA）標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，將純化后的擴增片段構(gòu)建PE 文庫。用Illumina 公司的MiSeq PE300 平臺進行測序（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。

3.數(shù)據(jù)處理：原始測序序列使用Trimmomatic軟件進行質(zhì)控，用FLASH 軟件進行拼接。①設(shè)置50 bp 的窗口，如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20，從窗口開始截去后端堿基，去除質(zhì)控后長度低于50 bp 的序列；②barcode 需精確匹配，引物允許2 個堿基的錯配，去除模糊堿基；③根據(jù)重疊堿基將兩端序列進行拼接，重疊堿基需大于10 bp。去除無法拼接的序列[4]。使用的UPARSE 軟件（版本7.1,網(wǎng)址http：//drive5.com/uparse/），根據(jù)97%的相似度對序列進行運籌分類單位（operational taxonomic units，OTU）聚類；使用UCHIME 軟件剔除嵌合體。利用核糖體數(shù)據(jù)庫項目（ribosomal database project,RDP）分類（http：//rdp.cme.msu.edu/）對每條序列進行物種分類注釋，比對Silva 數(shù)據(jù)庫（SSU123），設(shè)置比對閾值為70%。Alpha 多樣性是對單個樣品中物種多樣性進行分析[5]，包括Chao1 值、Ace 值、Shannon 指數(shù)以及Simpson 指數(shù)等[6]。利用Mothur（版本1.30.1）軟件計算樣品的Alpha 多樣性值。利用測得16S rDNA序列中已知的各種OTU 的相對比例，來計算抽取n 個（n 小于測得標(biāo)簽序列總數(shù)）標(biāo)簽序列時出現(xiàn)OTU 數(shù)量的期望值，然后根據(jù)一組n 值（一般為一組小于總序列數(shù)的等差數(shù)列）與其相對應(yīng)的OTU 數(shù)量的期望值，采用軟件R（版本3.2.2）繪制稀釋曲線。

結(jié) 果

一、高通量序列分析和質(zhì)量控制

65 只SPF 級健康成年小鼠的回盲部腸道內(nèi)容物樣本，經(jīng)數(shù)據(jù)過濾和質(zhì)控后得到144 318 條高質(zhì)量序列用于后續(xù)分析，這些序列長度集中在421～460 bp 之間（見圖1）。經(jīng)開放讀碼框OUT 聚類，65 個樣本高通量測序數(shù)據(jù)的片段可以聚類為972 個OUT。

圖1 樣本高通量測序數(shù)據(jù)平均長度分布

二、Alpha 多樣性分析結(jié)果

C57 品系小鼠（11 只）、BALB/c 品系小鼠（11 只）、ICR 品系小鼠（15 只）、C57BL/6 品系（11 只）Nu/Nu和db 品系（6 只）與其他品系小鼠（8 只）樣品的Alpha 多樣性分析結(jié)果見表2～7。本次實驗Alpha多樣性指數(shù)的結(jié)果顯示，相同品系的小鼠樣本間Alpha 多樣性表現(xiàn)不均一，菌種數(shù)目亦不均勻，覆蓋率顯示本次測序結(jié)果能夠代表樣本中微生物的真實情況。

65 條樣品稀釋曲線如圖2 所示，無限接近于樣本中所包含OTUs 的最大值，但各樣本物種豐度表現(xiàn)出明顯差異。各曲線上升趨勢已趨于平緩，接近平臺期，說明其高通量測序深度能夠滿足本研究的分析要求。等級豐度曲線可用來解釋多樣性的2個方面，即物種豐度和物種均勻度（見圖3）。本實驗的65 份樣本曲線走勢顯示在橫軸上的范圍和平滑程度均有較大差異，亦說明小鼠樣本間表現(xiàn)出不同的豐度和均勻度。

三、腸道內(nèi)容物菌群結(jié)構(gòu)組成

1.在門水平上樣品物種分布情況：基于OTU聚類對V3～V4 區(qū)序列在門水平上的樣品數(shù)據(jù)統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)本實驗所有樣本的序列主要集中在以下8 個門，依次為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、放線菌門（Actinobacteria）、Saccharibacteria、軟壁菌門（Tenericutes）和螺旋菌門（Spirochaetae），以厚壁菌門和擬桿菌門為主，除樣本33～36 外，這二類基本占所有菌群門水平的60%以上。樣本33～36 以變形菌門（Proteobacteria）為優(yōu)勢菌群；樣本39、40、47 和52 則以厚壁菌門為優(yōu)勢菌群（見圖4）。

表2 C57 品系小鼠（11 只）樣品在在97%相似度水平下的Alpha 多樣性

表3 BALB/c 品系小鼠（11 只）樣品在在97%相似度水平下的Alpha 多樣性

表4 ICR 品系（15 只）小鼠樣品在在97%相似度水平下的Alpha 多樣性

表5 C57BL/6 品系（11 只）小鼠樣品在在97%相似度水平下的Alpha 多樣性

表6 Nu/Nu 和db 品系（6 只）小鼠樣品在在97%相似度水平下的Alpha 多樣性

表7 其他品系小鼠（8 只）樣品在在97%相似度水平下的Alpha 豐富程度

圖2 樣品在遺傳距離0.03 下的稀釋曲線

2.在屬水平上樣本物種分布情況：本組各樣本在屬分類水平上菌群結(jié)構(gòu)組成見圖5。

圖3 等級豐度曲線

在ICR 品系小鼠中，樣本33～36 表現(xiàn)為Enterobacteriaceae_unclassified 豐度較高，分別為89.1%、90.3%、89.2%和77.3%，顯著高于其他小鼠的豐度。樣本33～36 中類芽孢桿菌屬（Paenibacillus sp.）豐度分別為9.6%、9.4%、9.6%和21.4%；樣本39 和40 號來自品系C57BL/6，其類芽孢桿菌屬豐度分別為20.8%和33.0%，以上6 個樣本該菌屬豐度顯著高于其他小鼠。同樣，在樣本39 和40 中,狹義梭菌屬（Clostridium_sensu_stricto_1）豐度分別為75.2%和61.0%，亦顯著高于其他小鼠。針對本研究的目的菌屬，樣本39 和40 中葡萄球菌屬（Staphylococcus）的豐度分別為2.3%和2.6%，葡萄球菌屬還存在于其他部分樣本中，其在各樣本中的豐度見表8。

圖4 樣品在門分類水平上菌群結(jié)構(gòu)組成

表8 目的菌屬在各品系小鼠不同樣本的豐度

本研究中其他目的菌屬包括支原體、棒狀桿菌屬和假單胞菌屬在各品系小鼠不同樣本的豐度詳見表8。

討論

在機體腸道中，微生物在與宿主共同進化過程中形成了數(shù)量巨大、對宿主有益且必要的腸道正常菌群。這些微生物菌群在系統(tǒng)發(fā)生上顯著不同，而其多樣性是宿主選擇性和菌群共進化、共同作用的結(jié)果，包括厭氧菌、兼性厭氧菌和需氧菌，其中97%以上為專性厭氧菌，且大多分布在結(jié)腸部位。在正常情況下，這些微生物菌群保持著動態(tài)的平衡和穩(wěn)定。分子微生物生態(tài)學(xué)的方法已經(jīng)揭示了未能培養(yǎng)的細菌群體的多樣性[7]，最近這些技術(shù)又被用來分析隨著時間變化、腸道不同區(qū)域以及不同個體之間的微生物菌群結(jié)構(gòu)差異[8-9]。高通量測序技術(shù)已被應(yīng)用于多種生態(tài)系統(tǒng)的微生物多樣性研究，如土壤[10-11]、海洋[12]、腸道[13-14]等，其使得人們對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進行細致、全面的分析成為可能，故又被稱為深度測序，是深入研究微生物菌群結(jié)構(gòu)的新手段[15-16]。由于目的菌屬在各樣本中的豐度較低，本研究應(yīng)用Megablast 的方法檢測所有樣本中屬內(nèi)OUT 數(shù)量（見表9）。

圖5 樣品在屬分類水平上菌群結(jié)構(gòu)組成

表9 Megablast 方法分析樣本中檢測到目的菌屬的OUT 數(shù)量

目前，我國 《實驗動物微生物學(xué)等級及監(jiān)測（GB 14922.2-2011）》所推薦的小鼠細菌檢測標(biāo)準(zhǔn)為常規(guī)分離培養(yǎng)結(jié)合生化鑒定法。傳統(tǒng)的研究是通過培養(yǎng)結(jié)合生化鑒定的方法來分析其組成，腸道可培養(yǎng)的常見厭氧菌種屬有擬桿菌、梭菌、雙歧桿菌和乳桿菌；兼性厭氧菌有革蘭陰性腸桿菌（如大腸埃希菌、沙門菌）和革蘭陽性球菌（如腸球菌、葡萄球菌、鏈球菌）。然而，直接進行顯微觀察的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)腸道微生物形態(tài)與可培養(yǎng)微生物形態(tài)并不一致，其可能是腸道微生物離開了相應(yīng)的生態(tài)位后死亡而引起。為了避免傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的局限，本研究引入了高通量測序技術(shù)，分析65 份SPF 級實驗小鼠回盲部腸道內(nèi)容物的細菌物種組成和豐度、Alpha 多樣性和菌群結(jié)構(gòu)，基本完成了在屬水平上篩選特定的病原菌，包括葡萄球菌屬、支原體屬、棒狀桿菌屬及假單胞菌屬。

本研究通過預(yù)實驗和完整實驗，完成了對各步驟反應(yīng)條件的探索和優(yōu)化，包括引物的特異性和擴增條件的選擇以及高通量測序數(shù)據(jù)的處理，結(jié)果能夠使研究人員在需用實驗小鼠作為科研對象時，預(yù)先了解SPF 級實驗小鼠腸道的菌群結(jié)構(gòu)和組成，有助于實驗結(jié)果的分析和重復(fù)，尤其是需要大批量的SPF 級實驗小鼠時。本研究為有針對性地設(shè)計篩選實驗動物腸道內(nèi)容物特定病原體實驗提供了一種新方法，并適合大樣本量的篩查（本方法已申請專利,專利號201710924382.0）。在屬水平上，本研究在所有樣本中檢測到了葡萄球菌屬、假單胞菌屬、支原體和棒狀桿菌屬，但豐度均相對較低。經(jīng)高通量測序篩查后，在屬水平上檢測為陽性的樣本，還需要進一步用PCR 檢測來再次確定是否含有特定菌種。目的病原菌中涉及到的鼠棒狀桿菌、牛棒狀桿菌、金黃色葡萄球菌以及銅綠假單胞菌均需在種水平上確定其有或無。本研究還發(fā)現(xiàn)，ICR 品系小鼠中樣本33～36 表現(xiàn)為以變形菌門（Proteobacteria）為優(yōu)勢菌群，與之相一致的是在屬水平上Enterobacteriaceae_unclassified 豐度較高，而同樣來源于ICR 品系的小鼠52 號樣本，其腸道內(nèi)容物則以厚壁菌門（Firmicutes）為優(yōu)勢菌群。以上5 個樣本與本實驗中其他ICR 品系小鼠相比較，OTU 聚類在門水平上的樣本序列有明顯差異。由此提示，即使飼養(yǎng)環(huán)境和條件相同，相同品系的SPF 級實驗小鼠腸道菌群在物種組成、豐度及Alpha 多樣性方面也會表現(xiàn)出顯著差異。越來越多的研究已經(jīng)關(guān)注實驗動物腸道微生態(tài)環(huán)境對其所應(yīng)用研究范圍實驗結(jié)果可重復(fù)性的影響。盡管實驗動物的腸道菌群在飼養(yǎng)和管理過程中受諸多因素的影響，由于很難使其標(biāo)準(zhǔn)化，人們?nèi)灾铝τ谘芯扛鞣N方法使實驗動物的腸道菌群在可控和可監(jiān)測范圍內(nèi)[3]。對于SPF 級實驗小鼠的微生物項目的監(jiān)測，本研究建立的方法可以快速提供實驗小鼠的腸道菌群組成、豐度、Alpha 多樣性指數(shù)及種屬篩查結(jié)果，提高實驗動物用于進一步實驗的準(zhǔn)確率和可重復(fù)性，尤其適合較大樣本微生物項目的篩選、監(jiān)測。按照《實驗動物微生物學(xué)等級及監(jiān)測（GB 14922.2-2011）》的微生物檢測項目的要求[17]，本研究因初次嘗試，存在諸多條件限制，只檢測了上述國家標(biāo)準(zhǔn)中的部分項目，其余項目會在后續(xù)實驗中展開。

總之，本研究首次使用高通量測序技術(shù)分析了SPF 級實驗小鼠回盲部腸道內(nèi)容物的菌群結(jié)構(gòu)及組成，為提升實驗動物微生物檢測水平，進一步補充完善我國實驗動物質(zhì)量控制體系提供更精確的研究手段，并為生產(chǎn)高質(zhì)量的SPF 級實驗小鼠提供實驗依據(jù)。