下呼吸道流感嗜血桿菌定植對哮喘小鼠氣道炎癥的影響及信號通路的研究

康建強，董楊陽，楊 玲，宋 珍，范嘉盈

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院老年科，上海 200092；2.上海市虹口四川北路街道社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，上海 200080；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗系，上海 200025）

研究者發(fā)現(xiàn)，反復(fù)發(fā)生呼吸道感染的兒童更易患過敏性疾病[1]，因此人們開始注意呼吸道定植菌與哮喘的關(guān)系。哥本哈根的研究人員對321 例兒童進行分析，發(fā)現(xiàn)如果在1 個月大的新生兒的呼吸道中存在流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、卡塔莫拉菌等細菌定植，患兒5 年內(nèi)發(fā)生哮喘的概率會增加，提示細菌等微生物定植是人類發(fā)生慢性呼吸道炎癥的重要環(huán)境易感因素[2]。研究提示，下呼吸道有細菌定植的哮喘患者病情控制差，容易反復(fù)加重[3]。70%的無癥狀和75%的急性喘息型哮喘患者呼吸道中最常見的細菌是流感嗜血桿菌，而僅有33%的正常兒童呼吸道中有此種細菌定植[4]。呼吸道細菌定植和感染在哮喘的發(fā)病和疾病進展中有一定的作用，但其機制目前尚不明確[5]。細胞表面的Toll 樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）對于細菌引起的核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）的活化和炎癥因子的分泌非常關(guān)鍵[6]。腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）是哮喘炎癥中的重要啟動因子，NF-κB 和髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88,MyD88）是主要的炎癥信號通路。因此，本研究采用C57/B6 野生型小鼠作為實驗動物，用卵清蛋白（ovalbumin，OVA）制備哮喘模型，在氣管內(nèi)注入瓊脂包被的流感嗜血桿菌菌珠，制作細菌定植模型，在注菌后的第7、21 天處死小鼠，檢測血清中TNF-α 的含量、肺組織中NF-κB 和MyD88 的表達，并與TLR4-/-小鼠作比較，進一步討論細菌定植與哮喘氣道炎癥間的關(guān)系及其信號通路。

材料與方法

一、材料

64 只C57/B6 小鼠購自上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院實驗動物中心,64 只TLR4-/-小鼠購自南京大學(xué)南京生物醫(yī)藥研究院，6～8 周齡，體質(zhì)量為（20±2）g。

1.實驗分組：C57/B6 小鼠64 只，隨機分為2 組，分別為對照組（N 組）和哮喘組（A 組），每組32 只。N 組小鼠隨機分為4 組，每組8 只，為NC7組（正常對照組第7 天）、NS7組（注流感嗜血桿菌后第7天），NC21組（正常對照組第21 天）、NS21組（注流感嗜血桿菌后第21 天）；A 組隨機分為4 組，每組8 只，為AC7組（哮喘組第7 天）、AS7（哮喘注流感嗜血桿菌后第7 天）、AC21組（哮喘組第21 天），AS21（哮喘注流感嗜血桿菌后第21 天）。64 只TLR4-/-小鼠處理及分組同上。

2.模型制作：①哮喘模型，A 組小鼠用OVA 制作哮喘模型，N 組用0.9%NaCl 溶液代替。②瓊脂包被的細菌懸液的制作，參考文獻[7-8]瓊脂包被流感嗜血桿菌，制作成細菌懸液，用肉湯調(diào)節(jié)濃度至108cfu/mL。③注菌，在哮喘造模的第38 天，往小鼠氣管注入0.02 mL 細菌懸液，對照組注入無菌瓊脂顆粒。注菌后第7、21 天取標(biāo)本。

3.支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）細胞計數(shù)：收集肺泡灌洗液，進行Wright′s（瑞氏）染色后，計細胞數(shù)。

4.炎癥因子檢測：注菌后第7 和21 天，從小鼠心臟取血1 mL 左右，行1 500 r/min 離心15 min，取上清液，進行酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）測定炎癥因子TNF-α。

5.肺組織中MyD88、NF-κB 水平檢測：制作小鼠肺組織石蠟切片，采用免疫組織化學(xué)(免疫組化)二步法測定其中的MyD88、NF-κB水平。

6.統(tǒng)計學(xué)處理：應(yīng)用SPSS 19.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，定量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

本研究中小鼠哮喘模型制模成功率為100%，無死亡小鼠。

一、BALF 細胞總數(shù)

BALF 中細胞總數(shù)計數(shù)結(jié)果顯示，與同時間組、同種小鼠NC 組相比，NS、AC、AS 各組均明顯增高（P<0.05）；與同種小鼠AC7組相比，第7 天的AS 組BALF 細胞總數(shù)顯著增高（P<0.05）；與C57/B6 組相比，同時間（第7 天、第21 天）TLR4-/-的NS 組BALF 中細胞總數(shù)計數(shù)顯著降低（P<0.05）；TLR4-/-的AS7組也較同時間段C57/B6 小鼠BALF 中細胞總數(shù)計數(shù)降低（P<0.05）（見表1）。

二、各組血清TNF-α 含量

與注射0.9%NaCl 組（NC7及NC21）、流感嗜血桿菌呼吸道定植組（NS7和NS21）相比，C57/B6 及TLR4-/-流感定植哮喘小鼠組（AS7和AS21）TNF-α 含量增加（P<0.05）；與C57/B6 AS 組相比，各對應(yīng)時間TLR4-/-的AS 組TNF-α 含量顯著減少（P<0.01）（見表2）。

三、肺組織中MyD88 表達量變化（見圖1～3）

MyD88 所占同一視野的細胞百分比的結(jié)果顯示，注菌后第7 天，與C57/B6 的NC7組相比，C57/B6 組的NS7組、AC7組和AS7組MyD88 表達量均顯著增高（P<0.05）；與TLR4-/-組的NC7組相比，TLR4-/-組的NS7組MyD88 表達量顯著增高（P<0.05）；與同種小鼠的AC7組相比，C57/B6 和TLR4-/-組的AS7組MyD88 表達量顯著增高（P<0.05）；與C57/B6 的AS7相比，TLR4-/-組的AS7組MyD88 表達量相對降低（P<0.05）。注菌后第21 天，與NC21組相比，C57/B6 組NS21組（P<0.05）和AS21組（P<0.01）MyD88 表達量顯著增高；與同種小鼠的AC21組相比，C57/B6 組的AS21組MyD88 表達量顯著增高（P<0.05）；與C57/B6 組的AC21組和AS21組相比，TLR4-/-組的AC21組和AS21組MyD88表達量相對降低（P<0.05）。

四、肺組織中NF-κB 表達量變化（見圖4～6）

NF-κB 所占同一視野的細胞百分比的結(jié)果顯示，注菌后第7 天，與C57/B6 的NC7組相比，C57/B6 組中的NS7組、AS7組NF-κB 表達量顯著增加（P<0.05），與TLR4-/-的NC7組相比，TLR4-/-組的NS7組、AC7組、AS7組NF-κB 表達量顯著增加（P<0.05）；與C57/B6 的AC7組相比，C57/B6 組的AS7組的NF-κB 表達量顯著增加（P<0.05）；TLR4-/-組中AS7組NF-κB 表達量顯著低于C57/B6 組中AS7組（P<0.05）。注菌后第21 天，與C57/B6 的NC21組相比，C57/B6 組的NS21組、AC21組、AS21組NF-κB 表達量顯著增加（P<0.05）,與TLR4-/-組的NC21組相比，NS21組、AC21組、AS21組的NF-κB 表達量顯著增加（P<0.05）；C57/B6 的AS21組的NF-κB 表達量顯著高于AC21組（P<0.05）；TLR4-/-組的NS21組、AS21組NF-κB 表達量顯著低于C57/B6 組的相同時間對應(yīng)組（P<0.05）。

表1 BALF 中細胞總數(shù)計數(shù)（±s）

表1 BALF 中細胞總數(shù)計數(shù)（±s）

a)：與NC 組（同時間段、同種小鼠）比較，P<0.05；b)：與AC 組（同時間段、同種小鼠）比較，P<0.05；c)：表示與同時間段C57/B6 組比較，P<0.05

表2 血清TNF-α 含量（pg/mL，±s）

表2 血清TNF-α 含量（pg/mL，±s）

a)：表示與NC 組（同時間段、同種小鼠）比較，P<0.05；b)：表示與AC 組（同時間段、同種小鼠）比較，P<0.05；c)：表示與同時間段TLR4-/-組比較，P<0.01

圖1 C57/B6 組和TLR4-/-組在菌第7 天肺組織MyD88 免疫組化染色結(jié)果（二步法，×400）

圖2 C57/B6 組和TLR4-/-組在第21 天肺組織MyD88 免疫組化染色結(jié)果（二步法，×400）

圖3 C57/B6 組和TLR4-/-組在第7 天（A）和第21 天（B）肺組織MyD88 表達量的比較

圖4 C57/B6 組和TLR4-/-組在第7 天肺組織NF-κB 免疫組化染色結(jié)果（二步法，×400）

圖5 C57/B6 組和TLR4-/-組在第21 天肺組織NF-κB 免疫組化染色結(jié)果（二步法，×400）

圖6 C57/B6 組和TLR4-/-組在第7 天（A）和第21 天（B）肺組織中NF-κB 表達量的比較

討 論

有研究對662 例哮喘兒童的呼吸道定植菌進行定量分析，發(fā)現(xiàn)流感嗜血桿菌、卡塔莫拉菌的定植引起Th1、Th2、Th17 細胞增多，從而引起白細胞介素1β、TNF-α 的高水平表達[9]?？梢娂毦ㄖ才cTh 細胞的產(chǎn)生及炎癥因子的表達間存在著重要聯(lián)系，可能與哮喘的發(fā)生息息相關(guān)。

TLR 通過識別病原體相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular patterns,PAMPs）來發(fā)揮作用，激活免疫應(yīng)答，引起各種呼吸道炎癥疾病，如哮喘[10]。研究證明，TLR2 和TLR4 在肺組織中的表達均與哮喘相關(guān)[11-13]。經(jīng)典的PAMPs 來自革蘭陰性細菌的脂多糖。脂多糖觸發(fā)TLR4，啟動細胞內(nèi)部信號通路[14]，通過MyD88 發(fā)出反應(yīng)信號[15]，肺組織主要病原體均通過MyD88 介導(dǎo)信號的表達[16]。一項關(guān)于肺損傷的研究中發(fā)現(xiàn)，TLR4 通過激活Myd88/NFκB 途徑引起肺損傷[17]。研究表明，脂多糖可激活TLR4，通過TLR4-MyD88-P65 介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[6,18]。

本研究通過免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，C57/B6 組的NS 組和AS 組在第7、21 天與各自對照組（對應(yīng)時間的NC 和AC 組）相比，MyD88 表達量均顯著增加，提示氣道注入流感嗜血桿菌后，肺組織的MyD88 表達量有所增加；而TLR4-/-組的AS 組與相應(yīng)的時間的AC 組相比，MyD88 表達量的增加沒有統(tǒng)計學(xué)意義，且與C57/B6 組的相同時間的AS 組相比，MyD88 表達量相對降低，提示在哮喘合并流感嗜血桿菌定植的時候，流感嗜血桿菌可能通過菌壁中的脂多糖激活TLR4，從而啟動了MyD88 依賴性途徑。但值得注意的是，TLR4-/-組的NS 組在注菌后第7 天時MyD88 表達量也顯著增加，但第21 天的增加沒有統(tǒng)計學(xué)意義，這可能是流感嗜血桿菌在不需要TLR4 介導(dǎo)的情況下，也能使部分MyD88 的表達增加，啟動信號通路，其具體機制目前尚不清楚，推測是注入的細菌改變了氣道微生物的群體環(huán)境。

本研究通過免疫組化檢測各組的NF-κB 發(fā)現(xiàn)，C57/B6 小鼠的注菌各組與NC 組（包括第7 天和第21天）相比，NF-κB 均高表達，說明流感嗜血桿菌在氣道的感染會增加NF-κB 的表達，此外，小鼠患哮喘之后肺組織也會增加NF-κB 的表達。本研究發(fā)現(xiàn)在第7、21 天的AS 組和第21 天的NS 組，TLR4-/-的NF-κB 的表達量分別與相應(yīng)時間的C57/B6 組的AS、NS 組相比，相對減少，這說明哮喘合并流感嗜血桿菌氣道定植后，可能由于TLR4 的激活導(dǎo)致NF-κB 轉(zhuǎn)錄因子活化，從而介導(dǎo)炎癥的放大。但是研究也顯示，TLR4-/-組的各組注菌以及哮喘造模后肺組織也有NF-κB 的表達增加，這也提示雖然TLR4 參與了哮喘合并流感嗜血桿菌定植后NF-κB表達增加的過程，但NF-κB 表達的增加并不完全依賴于TLR4 的激活。

本研究檢測了小鼠BALF 中的細胞總數(shù)，結(jié)果顯示，注菌第7 天時，C57/B6 組和TLR4-/-組的AS7組BALF 細胞總數(shù)遠高于同種小鼠其他各組，反映了當(dāng)哮喘合并流感嗜血桿菌定植后促進了炎癥的發(fā)生、發(fā)展，而TLR4-/-組在注菌后與C57/B6 注菌對應(yīng)組相比，BALF 細胞總數(shù)減少，說明TLR4 參與了細菌促進炎癥的過程。第21 天時，C57/B6 組和TLR4-/-組的AS 組BALF 細胞總數(shù)依舊高于他同種小鼠其各組，說明細菌定植之后促使炎癥反應(yīng)的效果持續(xù)存在。

TNF-α 是哮喘炎癥中的重要啟動因子，其升高會引起炎癥介質(zhì)的瀑布樣連鎖反應(yīng)，增加炎癥細胞對氣道的浸潤，使氣道上皮細胞脫落，導(dǎo)致氣道高反應(yīng)，誘發(fā)和加重哮喘[19-20]。研究表明，TNF-α 的水平在哮喘急性發(fā)作期患者的痰及BALF 中顯著高于緩解期及健康對照組，其在重度哮喘患者中的水平顯著高于輕度哮喘患者[21]。由上文可知，流感嗜血桿菌的感染和定植可以介導(dǎo)炎癥的發(fā)展，本研究發(fā)現(xiàn)，C57/B6 組和TLR4-/-組其第7、21 天的AS 組BALF 中的TNF-α 均遠高于其他各組，且相較于C57/B6 組，同時間的TLR4-/-各組TNF-α 含量減少，證實哮喘合并流感嗜血桿菌定植促進了炎癥的發(fā)展，且TLR4 參與了這個過程。

總之，哮喘合并流感嗜血桿菌的定植對氣道炎癥和氣道重塑有重要的作用，流感嗜血桿菌不僅通過菌體本身損害氣道黏膜，也可能通過菌壁的脂多糖成分激活TLR4，通過TLR4-MyD88-NF-κB 途徑導(dǎo)致氣道炎癥的加重，進一步影響哮喘的發(fā)生、發(fā)展。