ERLIN2蛋白高表達(dá)與結(jié)腸腺癌患者不良預(yù)后的相關(guān)性

李 冰，陳 靖，于素香，閆江鶴，朱鳳池

（1.保定市第四中心醫(yī)院 肛腸外科，河北 保定 072350；2.天津市腫瘤醫(yī)院 胰腺腫瘤科，天津 300060；3.保定市第四中心醫(yī)院病理科，河北 保定 072350；4.保定市第二醫(yī)院肛腸外科，河北 保定 071000）

結(jié)腸癌是常見的發(fā)生于結(jié)腸部位的消化道惡性腫瘤， 對人類的健康和生命構(gòu)成了嚴(yán)重威脅.早期結(jié)腸癌患者通常能夠通過手術(shù)治愈，而晚期患者通常需要手術(shù)、放療等多種方式聯(lián)合治療[1-2].原發(fā)性局部晚期腸癌經(jīng)過根治性切除后，仍有11%的病人會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[3-5].因此，尋找新型的預(yù)后因子對于提高臨床醫(yī)生的診斷及預(yù)測預(yù)后水平十分重要[6].

ERLIN2 屬于擁有共同的進(jìn)化保守結(jié)構(gòu)域SPFH（stomatin/prohibitin/flotillin/HflK/C）的家族蛋白成員之一.雖然包含的SPFH 蛋白位于不同的膜結(jié)構(gòu)上，但是擁有共同特點(diǎn)，如這些蛋白的氮端序列為亞細(xì)胞定位和膜附著過程所必需，碳端序列上的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域可介導(dǎo)高分子量復(fù)合體的裝配[7].Zhang 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，ERLIN2 在人乳腺癌組織中異常高表達(dá)， 參與調(diào)節(jié)人乳腺癌相關(guān)的細(xì)胞周期進(jìn)程.Cubillos-Ruiz 等[9]通過敲低和過表達(dá)ERLIN2 研究其在乳腺癌發(fā)生過程中的生物學(xué)行為，結(jié)果顯示，ERLIN2 通過促進(jìn)腫瘤發(fā)生相關(guān)的細(xì)胞壓力下的保護(hù)作用，給予乳腺癌細(xì)胞選擇性生長優(yōu)勢.Giulietti 等[10]認(rèn)為，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的ERLIN2可能會(huì)成為新型的區(qū)分胰腺導(dǎo)管腺癌高危和低危患者的生物標(biāo)記物.

本研究通過免疫組化染色分析ERLIN2 在結(jié)腸腺癌樣本中的表達(dá)水平， 結(jié)合臨床數(shù)據(jù)分析ERLIN2 在結(jié)腸腺癌患者中的臨床意義.在體外水平利用shRNA穩(wěn)定敲低ERLIN2 在結(jié)腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平，通過MTT、克隆形成以及Western Blot 實(shí)驗(yàn)檢測ERLIN2與結(jié)腸癌細(xì)胞系增殖的關(guān)系，以期為探究ERLIN2 與結(jié)腸腺癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要儀器與試劑

RM2235 通用型石蠟切片機(jī)，日本Leica 公司；光學(xué)顯微鏡，日本Olympus 公司.

ERLIN2（ab233440）、 Ki67（ab16667） 和 PCNA（ab92552），美國 Abcam 公司；β-Actin（BM0627），武漢博士德生物工程有限公司；通用型二抗PV6000，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；DAB（DA1010）、蘇木精（G1120）和 MTT（M1025），北京索萊寶科技有限公司.

結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116 和HT29，購自中國科學(xué)院細(xì)胞培養(yǎng)庫， 使用體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清混合RPMI-1640 培養(yǎng)基在37 ℃下進(jìn)行培養(yǎng).

1.1.2 臨床資料

收集河北省保定市第四中心醫(yī)院和保定市第二醫(yī)院肛腸外科2012 年1 月至2018 年12 月接受結(jié)腸癌根治性切除術(shù)治療的患者82 例，所有患者均無術(shù)前放射治療和化療史，所有標(biāo)本經(jīng)H&E 染色后，經(jīng)過病理科證實(shí)為結(jié)腸腺癌.患者臨床數(shù)據(jù)（年齡、性別、腫瘤T 分期、分化水平、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）通過查閱病案科病歷資料獲得.以上過程均遵照本院倫理委員會(huì)發(fā)布的倫理學(xué)規(guī)范，患者本人及家屬均簽署了知情同意書.

1.2 方法

1.2.1 免疫組化染色及評分方法

利用免疫組化染色法評估ERLIN2 在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)情況.將石蠟包埋標(biāo)本切成5 μm 切片，室溫晾干，75 ℃下充分脫蠟1 h， 二甲苯浸泡20 min.脫蠟完全后，梯度濃度酒精（體積分?jǐn)?shù)依次為100%、95%、85%、75%）進(jìn)行水化.將切片浸泡在枸櫞酸鹽溶液中，高火煮沸進(jìn)行抗原修復(fù).滴加過氧化物酶阻斷劑充分阻斷過氧化物酶的作用， 繼續(xù)滴加抗ERLIN2 抗體（稀釋比例 1 ∶500），4 ℃下孵育過夜.次日， 滴加二抗常溫孵育1 h，滴加DAB 顯色，之后用蘇木素染色.脫水透明處理后， 中性樹膠封片.顯微鏡下觀察組織著色部位以及著色強(qiáng)度.

根據(jù)陽性細(xì)胞所占比例與染色強(qiáng)度評分之和對ERLIN2 的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行半定量評估.根據(jù)陽性細(xì)胞比例評分：＜5%為 0 分；5%～50%為 1 分；＞50%為2 分.染色強(qiáng)度評分：無著色或者輕微著色為0 分；中等著色為1 分； 強(qiáng)著色為2 分.兩者評分之和代表ERLIN2 表達(dá)水平：0～2 分為低表達(dá)組；3～4 分為高表達(dá)組.

1.2.2 shRNA 敲低 ERLIN2 表達(dá)

結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116 和HT29 分別被shRNA感染.以 Lipofectamine 2000（Invitrogen， 11668069， 美國）為轉(zhuǎn)染試劑，利用Western Blot 驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率.具體操作：通過SDS-PAGE 電泳分離蛋白質(zhì)樣品并轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，用脫脂牛奶與Tris 緩沖液加Tween-20在室溫下封閉膜1 h，然后與一抗和辣根過氧化物酶絡(luò)合的二抗一起溫育，使用成像儀觀察結(jié)果.一抗稀釋比例：ERLIN2（1 ∶2 000），Ki67（1 ∶800），PCNA（1 ∶800），β-Actin（1 ∶3 000）.

1.2.3 MTT 實(shí)驗(yàn)

將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞以2.0×104/孔的密度接種在96 孔培養(yǎng)板， 培養(yǎng)4 d 后評估細(xì)胞活力.向結(jié)腸癌細(xì)胞中加入10 μL 的MTT，孵育4 h，吸出液體培養(yǎng)物并加入200 μL 的二甲基亞砜，在570 nm 處記錄吸光度.每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次.

1.2.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞以6×102/孔的密度接種在六孔培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)7 d 后， 用PBS 洗滌細(xì)胞， 室溫下用體積分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛固定10 min.再次用PBS 洗滌細(xì)胞后，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的結(jié)晶紫染色， 對菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算對照組和實(shí)驗(yàn)組中的平均菌落數(shù).所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次.

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析.利用卡方檢驗(yàn)比較ERLIN2 高、 低表達(dá)組的患者對應(yīng)的相關(guān)臨床數(shù)據(jù)的差異，利用Kaplan-Meier 方法比較2 組的總生存期（overall survival time）和疾病無病生存期（diseasefree survival time）， 雙尾 P ＜ 0.05 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.利用GraphPad Prism 6 軟件作圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 ERLIN2在結(jié)腸腺癌和癌旁組織中的表達(dá)水平

利用免疫組化染色評估結(jié)腸腺癌組織以及癌旁組織的ERLIN2 表達(dá)水平，結(jié)果如圖1 所示.

圖1 ERLIN2 在結(jié)腸腺癌和癌旁正常組織中的表達(dá)Fig.1 Expression of ERLIN2 in colon adenocarcinoma and normal paracancer tissues

由圖1 可以看出，ERLIN2 主要定位于細(xì)胞胞漿.通過評分分析可知， 結(jié)腸腺癌組織中共有40 例樣本為ERLIN2 高表達(dá)， 癌旁組織樣本中沒有ERLIN2 的高表達(dá)，均為陰性或者低表達(dá).這些結(jié)果表明，與癌旁組織相比，ERLIN2 蛋白在結(jié)腸腺癌中的表達(dá)水平明顯升高.

2.2 ERLIN2的表達(dá)水平和患者臨床指標(biāo)的關(guān)系

ERLIN2 的表達(dá)水平與結(jié)腸腺癌圍手術(shù)期臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析結(jié)果如表1 所示.由表1 可以看出，82 例接受結(jié)腸腺癌根治性切除術(shù)的患者中，ERLIN2高表達(dá)與較高的結(jié)腸腺癌T 分期以及較高的臨床分期相關(guān)，相關(guān)性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）.ERLIN2 的表達(dá)水平與患者年齡、性別、腫瘤分化水平以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯相關(guān)性（P ＞0.05）.

表1 ERLIN2 的表達(dá)水平與結(jié)腸腺癌圍手術(shù)期臨床指標(biāo)的相關(guān)性Tab.1 Correlation between ERLIN2 expression level and perioperative clinical indicators of colon adenocarcinoma

2.3 ERLIN2表達(dá)水平與患者疾病總生存率和無進(jìn)展生存率的關(guān)系

疾病無進(jìn)展生存率是接受結(jié)腸癌根治性切除術(shù)后的患者評價(jià)預(yù)后最重要的臨床指標(biāo)之一.因此，本研究利用Kaplan-Meier 方法分析了ERLIN2 的高表達(dá)與不良預(yù)后的相關(guān)性， 結(jié)果如圖2 所示.由圖2 可以看出， 與ERLIN2 低表達(dá)組相比，ERLIN2 高表達(dá)組患者疾病的總生存期和無進(jìn)展生存期更短，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.869，P=0.021；χ2=6.021，P=0.017）.

圖2 結(jié)腸腺癌患者高、低ERLIN2 表達(dá)組的生存分析Fig.2 Survival analysis of high and low ERLIN2 expression in the patients of colon adenocarcinoma

2.4 敲低ERLIN2表達(dá)對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖能力的影響

利用shRNA 分別穩(wěn)定敲低結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116和HT29 中 ERLIN2 的表達(dá)，Western Blot 檢驗(yàn)結(jié)果證實(shí)， 本研究成功建立了2 株穩(wěn)定敲低ERLIN2 的結(jié)腸癌細(xì)胞系.MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3（a）和圖3（b）所示，與對照組相比， 敲低ERLIN2 后2 株細(xì)胞系的增殖能力均顯著下降（P ＜ 0.05）.克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3（c）和圖3（d）所示，敲低ERLIN2 后2 株細(xì)胞系的集落形成數(shù)目明顯減少（P ＜ 0.05）.Western Blot 檢測增殖相關(guān)蛋白 Ki67 和 PCNA 表達(dá)水平的變化，結(jié)果如圖3（e）～圖3（h）所示，與對照組相比，2 種蛋白在 2 株細(xì)胞系中的表達(dá)均顯著下降（P ＜ 0.05）.

圖3 結(jié)腸癌細(xì)胞系中敲低ERLIN2 表達(dá)對細(xì)胞增殖和相關(guān)蛋白表達(dá)的抑制Fig.3 Inhibition on cell proliferation and associated protein expression by the knockdown of ERLIN2 expression in colon cancer cell lines

3 討論與結(jié)論

結(jié)腸癌是全世界主要的公共衛(wèi)生問題之一，有許多風(fēng)險(xiǎn)因素與結(jié)腸癌的發(fā)生相關(guān)， 如炎癥綜合征、遺傳因素、環(huán)境因素等[11].盡管目前可以通過一些腫瘤標(biāo)記物如CEA、CA199 和CA125 等檢測到部分結(jié)腸癌患者[12]，但復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍然會(huì)威脅到術(shù)后結(jié)腸癌患者的生命健康.為了更好地理解結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移過程中的機(jī)制，開發(fā)針對結(jié)腸癌的分子靶向藥物和準(zhǔn)確評估患者預(yù)后，對于與結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲相關(guān)的基因和蛋白的研究至關(guān)重要.

ERLIN2 是SPFH 家族蛋白成員之一，基因位于染色體8p11.2 上，該區(qū)域除經(jīng)常在乳腺癌中發(fā)生改變以外，與常染色體隱性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病和中晚期尿路上皮腫瘤的發(fā)生也相關(guān)[13].本研究通過免疫組化染色方法評估82 例結(jié)腸腺癌樣本及癌旁組織中ERLIN2 蛋白的表達(dá)水平， 發(fā)現(xiàn)對比癌旁組織， 結(jié)腸腺癌標(biāo)本中ERLIN2 的表達(dá)明顯升高.ERLIN2 高表達(dá)組患者的腫瘤T 分期和臨床分期更高，而疾病無進(jìn)展生存期更短.這些結(jié)果均表明ERLIN2 在結(jié)腸腺癌發(fā)生發(fā)展過程中可能起到重要作用，可作為一個(gè)潛在的新型預(yù)測結(jié)腸腺癌患者預(yù)后的因子.

Cheng 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細(xì)胞系中，過表達(dá)ERLIN2 能夠通過支持細(xì)胞生長和保護(hù)細(xì)胞免受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡來增強(qiáng)乳腺上皮細(xì)胞的適應(yīng)能力.ERLIN2 在腫瘤形成過程中，針對多種細(xì)胞間壓力為乳腺癌細(xì)胞提供保護(hù)作用，并給予其選擇性生長優(yōu)勢[13].乳腺癌細(xì)胞中ERLIN2 的過表達(dá)會(huì)對胰島素或者不飽和脂肪酸做出反饋，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)脂滴的累積，同時(shí)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞中脂肪生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子SPEBP 的活化，從而說明ERLIN2 以通過調(diào)控細(xì)胞溶質(zhì)成分的方式來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長.本研究在體外水平利用shRNA敲低結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116 和HT29 中ERLIN2 的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲低ERLIN2 后2 個(gè)結(jié)腸癌細(xì)胞系的增殖水平、 集落形成數(shù)以及細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白Ki67 和PCNA 的表達(dá)水平均明顯下調(diào).由此推測，ERLIN2 可能是通過調(diào)控細(xì)胞增殖來促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)展，有潛力成為治療結(jié)腸癌的分子靶點(diǎn)，具體調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)行深入探究.