原發(fā)性骨髓纖維化ASXLl基因突變的臨床意義

王彥麗 王正 閆世彬 夏景清

（臨沂市中心醫(yī)院 山東 臨沂 276000）

骨髓增殖性腫瘤（myeloproliferative neoplasms,MPN）是一組起源于骨髓多能造血干細(xì)胞克隆惡性血液系統(tǒng)疾病。原發(fā)性骨髓纖維化（PMF）是MPN的一個(gè)亞型，是MPN中最具侵襲性的一種克隆性疾病，其臨床特征是進(jìn)行性貧血、脾大、髓外造血，伴全身癥狀，易進(jìn)展為急性白血病。自2005年MPN患者高頻獲得JAK2V617F基因突變［1-3］，從此人們對(duì)MPN的發(fā)病機(jī)制有了新的認(rèn)識(shí)。2013年，在JAK2V617F及 MPLW515陰性的ET及PMF患者中發(fā)現(xiàn)CALRexon9突變的檢出率高達(dá) 50%以上[4-5]。JAK2、MPL、CALR基因的發(fā)現(xiàn)使得約80%的MPN患者的發(fā)病機(jī)制有了新的生物學(xué)標(biāo)志及預(yù)后指標(biāo)，但不能解釋不同 MPN的顯著差異。研究顯示，幾乎所有髓系腫瘤中都有ASXLl突變檢出，并與其他基因事件共同作用參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但ASXL1在PMF中的突變情況及臨床意義尚不明確[6-7]。本文分析了41例PMF患者中ASXL1基因突變情況，并與JAK2V617F、CALR及MPL等單基因突變進(jìn)行比較分析，初步探討其臨床意義。

1.資料和方法

1.1 病歷資料

選取2014年1月－2019年6月我院血液科診斷的骨髓纖維化患者41例。男23例，女18例；年齡52～75歲，中位年齡65歲。均符合2008年WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]。41例均有不同程度脾大，其中13例為巨脾。

1.2 JAK2、CALR、MPL和ASXL1基因突變檢測(cè)

用血液基因組DNA提取試劑盒（QIAamp DNA Mini Kit，生產(chǎn)商：QIAGEN）提取骨髓樣本中基因組DNA。CALRexon9突變檢測(cè)采用PCR法。其上游引物序列為：FAM-CTGGTCCTGGTCCTGATGT；下游引物序列為：TCTCACAGAGACATTATTTGGC。PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物經(jīng)純化后，使用3500XL測(cè)序儀進(jìn)行高分辨率毛細(xì)管凝膠電泳，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用片段分析軟件GENEMAPPERID V4.1進(jìn)行分析。MPLexon10突變檢測(cè)采用Sanger測(cè)序法。其上游引物序列為：TGACCTTGCGGGCCGAC；下游引物序列為：GATCTGGGGTCACAGAGCGA。PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物經(jīng)純化、測(cè)序反應(yīng)后使用3730XL測(cè)序儀進(jìn)行高分辨率毛細(xì)管凝膠電泳，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DNA序列分析軟件Sequencher V4.5進(jìn)行突變分析。JAK2基因V617F突變采用等位基因特異性聚合酶鏈反應(yīng)(ASPCR)+熒光探針法進(jìn)行定量檢測(cè)，試劑盒由上海源奇生物醫(yī)藥科技有限公司提供。ASXL1基因突變檢測(cè)采用二代測(cè)序法。ASXL1exon12經(jīng)探針捕獲和建庫后，使用Illumina公司的Nextseq500測(cè)序儀進(jìn)行雙端測(cè)序，測(cè)序長(zhǎng)度為2×150bp。測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)生物信息學(xué)分析后，最后人工篩選和確認(rèn)變異位點(diǎn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用率（%）表示，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用（±s）表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 ASXL1、CALR、JAK2V617F、MPL基因突變分析

ASXLl結(jié)果：41例患者中，共有7例檢出ASXLl突變，突變率為17.1%(7/41)，ASXL1突變主要類型為：Gly646Trpfs(n=4)、Pro808Leufs(n=1)、Thr823X(n=1)、Glu768X(n=1)。ASXLl突變患者的平均年齡為56歲(52～60歲)，見表1。

Table 1.Clinical characteristics of 7 patients with ASXLl mutation

CALR基因分析結(jié)果：CALR基因突變率為19.5%(8/41)，主要突變類型包括：I型(p.L367fs*46 del52bp)5例(62.5%)、Ⅱ型(p.K385fs*47 ins5bpTTGTC)3例(37.5%)。CALR突變患者的平均年齡為57歲(53～71歲)。JAK2V617F突變的發(fā)生率為56.1%(23/41)，JAK2V617F突變患者的平均年齡為57歲(53～72歲)。MPL基因突變發(fā)生率為2.4%(1/41)，突變類型為MPLW515K。

2.2 ASXLl突變患者部分臨床特點(diǎn)及其與單突變、突變陰性患者的比較

41例患者中，有36（87.8%）例患者至少攜帶1個(gè)基因突變，3例(7.3%)患者同時(shí)伴有2個(gè)基因突變，為ASXLl/CALR基因突變共存(n=2)，ASXLl/JAK2V617F基因突變共存(n=1)。ASXLl突變患者外周血：白細(xì)胞(3.7±1.5)×109/L，血紅蛋白(56±7.8)g/L，血小板(89±38)×109/L。與CALR基因單突變相比，ASXLl基因突變組PMF患者有更低的血紅蛋白水平及較低的血小板計(jì)數(shù)，但在白細(xì)胞計(jì)數(shù)方面無差異。與JAK2V617F基因單突變患者相比，ASXLl突變組患者血紅蛋白水平低于JAK2V617F突變組，血小板數(shù)也低于JAK2V617F突變組。與突變均陰性組相比，ASXL1突變組血小板與血紅蛋白水平低于陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

Table 2.Clinical and laboratorial features of patients subdivided by different mutation type（±s）

Table 2.Clinical and laboratorial features of patients subdivided by different mutation type（±s）

parameter ASXL1+ CALR+ JAK2 + MPL+ Negative mutated Number of patients 7 8 23 1 5 Median age(years)56±1.9 48±2.5 54±2.7 57 55±2.9 Male/Female 4：3 5：3 12：11 1 2：3 WBC(×109/L)3.7±1.5 7.6±2.1 5.8±0.6 6.2 5.5±1.7 Hb(g/L)56±7.8 81±7.2 65±10.5 74 76±2.7 Plt(×109/L)89±38 161±31 128±29 202 159±18

3.討論

表觀遺傳調(diào)節(jié)是細(xì)胞維持其基因表達(dá)模式的重要機(jī)制，其中維持基因表達(dá)穩(wěn)態(tài)的兩類重要表觀遺傳調(diào)節(jié)蛋白為polycomb家族(polycomb group，PcG)和Trithorax家族(Trithorax group，TrxG)。PcG蛋白的主要功能是保持發(fā)育過程中同源異形基因的沉默，而TrxG蛋白則負(fù)責(zé)維持基因的活化狀態(tài)。人類ASXLl基因定位于染色體20ql l，編碼由1541個(gè)氨基酸組成的核蛋白，是trxG(trithorax-group)和PRC(Polycomb-group repressor complex)的增強(qiáng)子，具有抑制／激活雙重特性，在包括血液細(xì)胞等多種組織中廣泛表達(dá)。ASXLl編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)于所有造血細(xì)胞，具有對(duì)轉(zhuǎn)錄的雙向激活與抑制作用。Fisher等[9]人建立了ASXL1敲除的小鼠模型。敲除后的小鼠淋系和髓系分化中都發(fā)生異常，表明ASXL1對(duì)于維持正常的造血功能是必須的。

作為表觀遺傳調(diào)節(jié)子基因，ASXLI在MPN可與JAK2V617F、TET2、RUNXl、CEBPA等基因突變共存。高通量DNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)，90%以上的MPN 患者至少攜帶1個(gè)突變基因，具有多個(gè)基因突變共存者其轉(zhuǎn)化白血病的風(fēng)險(xiǎn)增加[10]。國(guó)內(nèi)研究顯示，ASXLl突變?cè)贛PN發(fā)生率達(dá)36%。ASXLl突變的頻率在PMF為12%～13%，Pv/ET-MF為23%[11]，這一結(jié)果表明，PMF是具有多基因改變的疾病，多基因檢測(cè)可以為PMF生物標(biāo)志的篩選及預(yù)后分層提供更多依據(jù)[12]。單變量分析中發(fā)現(xiàn)了ASXL1突變對(duì)PMF生存的不利影響[13]。有研究報(bào)道，ASXLl+CALR+PMF患者OS下降，但ASXLl+CALR-患者的預(yù)后最差[14]。CALR+ASXL1-中位生存期最長(zhǎng)(平均10.4年)，CALR-ASXL1+患者最短(平均2.3年)。CALR+ASXLl+和CALR-ASXL1-患者具有相似的生存率，并被歸為中等風(fēng)險(xiǎn)類別(平均5.8年)[13]。

本組研究對(duì)41例PMF患者進(jìn)行了多基因檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，93.5%的患者存在單基因突變，ASXLl基因總的突變發(fā)生率為17.1%，均為移碼突變、點(diǎn)突變或無義突變，大部分ASXLl突變與其它基因突變共存，7.3%的患者存在雙基因突變，其中雙基因突變患者中均攜帶ASXLl突變，且這一結(jié)果與既往研究基本一致[15]。在3例基因雙突變患者中，2例為ASXLl/CALR突變共存，未檢測(cè)到CALR/JAK2V617F突變共存。目前，關(guān)于ASXLl突變?cè)赑MF中的研究鮮見報(bào)道。與單CALR基因突變患者相比，本研究中ASXLl突變患者的血紅蛋白、血小板計(jì)數(shù)水平明顯降低，這提示ASXLl突變患者的紅系、巨核系受抑更為明顯，但尚需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本并長(zhǎng)期隨訪尚能明確。綜上，ASXL1基因突變是繼MPN患者中JAK2、CALR、MPL基因突變之后的又一重要生物學(xué)標(biāo)志。PMF的發(fā)生可能由于一個(gè)或多個(gè)基因的共同作用結(jié)果,如JAK/STAT通路相關(guān)基因、表觀遺傳調(diào)控相關(guān)基因及剪接因子相關(guān)基因等[16]。針對(duì)PMF發(fā)病過程中起決定作用的基因，研制更多的靶向藥物，是根本改變PMF預(yù)后的關(guān)鍵。

未來隨著基因測(cè)序技術(shù)的提高發(fā)現(xiàn)更多的協(xié)同致病基因并進(jìn)行深入的功能研究，可能會(huì)為詮釋PMF復(fù)雜的致病機(jī)制提供更多有力的理論依據(jù)，將對(duì)我們認(rèn)識(shí)PMF的發(fā)病機(jī)制，預(yù)后和治療發(fā)揮重要的作用。