利用UV和ARTP誘變篩選優(yōu)良性狀的球等鞭金藻

陳建楠 陳由強(qiáng) 薛婷

摘?要：為獲取優(yōu)良性狀的球等鞭金藻突變藻株，通過紫外和等離子體誘變育種技術(shù)對球等鞭金藻進(jìn)行誘變和高通量篩選。結(jié)果表明：共篩選出了7株優(yōu)良性狀的突變藻株，分別為YB1Z2、ZA2、ZA5、Q2B5ZWYB、Z3YB4、Z3YB11、JN31，其藻液尼羅紅染色測定油脂含量的熒光比值都大于原始藻株，突變藻株YB1Z2、ZA2、ZA5、Z3YB4、JN31比生長速率相比于原始藻株提高了1.38、1.22、1.33、1.10、1.37倍，突變藻株YB1Z2的生長速率最快，其次是突變藻株JN31。突變藻株YB1Z2、Q2B5ZWYB、Z3YB4、Z3YB11、JN31的巖藻黃素單位含量均高于原始藻株，其中突變藻株YB1Z2、Z3YB11提高了1.07、1.08倍。突變藻株YB1Z2、ZA2、ZA5、Q2B5ZWYB、Z3YB4、Z3YB11的不飽和脂肪酸含量比原始藻株提高了1.22、1.09、1.08、1.18、1.13、1.18倍，突變藻株YB1Z2、ZA5、Z3YB4、Z3YB11、Q2B5ZWYB的多不飽和脂肪酸（C22∶6）DHA含量比原始藻株提高了1.28、1.27、1.26、1.21、1.21倍。利用紫外和等離子體誘變育種技術(shù)對球等鞭金藻進(jìn)行誘變篩選，獲得了7株優(yōu)良性狀的突變藻株，為后續(xù)的研究和基礎(chǔ)餌料藻提供了很好的種質(zhì)資源。

關(guān)鍵詞：球等鞭金藻;生長速率;巖藻黃素;不飽和脂肪酸;誘變篩選

中圖分類號(hào)：Q938?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?文章編號(hào)：0253-2301（2020）02-0009-08

DOI：10.13651/j.cnki.fjnykj.2020.02.002

Abstract：In order to obtain the mutants of Isochrysis galbana with excellent characters， the mutation and high throughput screening of Isochrysis galbana was carried out by using the ultraviolet and plasma mutation breeding technologies. The results showed that a total of seven mutants with excellent characters were screened out， which were YB1Z2， ZA2， ZA5， Q2B5ZWYB， Z3YB4， Z3YB11， JN31， respectively. The fluorescence ratio of oil content determined by Nile red staining in the algal solution was higher than that of the original strain. The growth rate of the mutant YB1Z2， ZA2， ZA5， Z3YB4 and JN31 was 1.38， 1.22， 1.33， 1.10 and 1.37 times higher than that of the original strain， and the growth rate of YB1Z2 was the fastest， followed by JN31. The contents of fucoxanthin per unit in the mutant YB1Z2， Q2B5ZWYB， Z3YB4， Z3YB11 and JN31 were all higher than that of the original strain， among which the mutant YB1Z2 and Z3YB11 increased by 1.07 and 1.08 times. The content of unsaturated fatty acids in the mutant YB1Z2， ZA2， ZA5， Q2B5ZWYB， Z3YB4 and Z3YB11 was 1.22， 1.09， 1.08， 1.18， 1.13 and 1.18 times higher than that of the original strain. The DHA content of polyunsaturated fatty acids （C22∶6）in the mutant YB1Z2， ZA5， Z3YB4， Z3YB11 and Q2B5ZWYB was 1.28， 1.27， 1.26， 1.21 and 1.21 times higher than that of the original strain. In conclusion， the mutation screening of Isochrysis galbana was carried out by using the ultraviolet and plasma mutation breeding technologies， and then seven mutants with excellent characters were obtained， which provided good germplasm resources for the subsequent research and basic bait algae.

Key words：Isochrysis galbana;Growth rate;Fucoxanthin;Unsaturated fatty acid;Mutation screening

球等鞭金藻Isochrysis galbana是一種富含巖藻黃素和油酸、亞油酸、二十二碳六烯酸（DHA）等多種不飽和脂肪酸的海洋單細(xì)胞微藻[1-3]，是我國養(yǎng)殖海產(chǎn)魚類幼苗和雙殼類幼蟲的基礎(chǔ)餌料藻[4]。藻體大小為3～7 μm，沒有細(xì)胞壁，藻體一般為橢圓形或球形，有兩根等長的鞭毛從細(xì)胞前端伸出，依靠兩根鞭毛運(yùn)動(dòng)的單細(xì)胞藻體[5]。主要分布在我國近海岸水體的中下層，其對生長環(huán)境溫度變化敏感，在早春和晚秋生長旺盛，繁殖速度快，生長在海洋水體中，營浮游生活。球等鞭金藻在不斷的傳代培養(yǎng)過程中會(huì)出現(xiàn)藻種的退化，表現(xiàn)為生長速率緩慢、油脂含量和巖藻黃素含量下降、生物活性不高等癥狀，極大影響了餌料藻的品質(zhì)，為了獲取優(yōu)良性狀的種質(zhì)，科研人員一般會(huì)通過誘變育種技術(shù)對球等鞭金藻進(jìn)行誘變篩選[6]。

紫外誘變是一種傳統(tǒng)的物理誘變育種技術(shù)，其原理是紫外線照射到細(xì)胞里的DNA形成嘧啶二聚體，從而導(dǎo)致DNA雙鏈雙螺旋結(jié)構(gòu)變異，堿基錯(cuò)配，從而形成突變體[7]。紫外誘變對其設(shè)備要求簡單、操作簡便，突變效率較高、安全性較高等特點(diǎn)，在微藻生物誘變育種過程中得到了廣泛的應(yīng)用[8-9]。Sivaramakrishnan等[10]通過紫外誘變技術(shù)對柵藻Scenedesmus sp.進(jìn)行誘變育種，篩選出了1株突變藻株M22，總油脂產(chǎn)量較野生株提高了3倍，達(dá)到了1.625 g·L-1。劉曉娟[11]通過對擬微綠球藻進(jìn)行紫外誘變篩選，篩選出了2株突變藻株N63和N27，生長速率提高了26.1%和41.9%，海藻多糖提高了19.68%和38.57%。Liu等[12]通過紫外誘變技術(shù)對小球藻進(jìn)行誘變，篩選出的突變藻株較野生株的生長速率更快，生物量提高了7.6%，油脂含量也有相應(yīng)提高。葉麗等[13]通過紫外對擬微綠球藻進(jìn)行誘變篩選，獲得了2株生長速率較快的 MN1和MN2突變藻株，MN1突變藻株比出發(fā)藻株的生物量增加14.55%，粗蛋白含量增加2.54%，總油脂含量增加9.81%，MN2突變藻株比出發(fā)藻株的生長率增加6.25%，生物量增加5.62%，多糖增加13.26%，總油脂增加7.93%。翟興文[14]通過對雨生紅球藻進(jìn)行紫外誘變篩選，篩選出了幾株高產(chǎn)蝦青素藻株。Lim等[15]通過紫外誘變育種多次誘變篩選，獲得了2株中性油脂含量分別提高了114%和123%的突變藻株。陳書秀[16]對鹽藻和雨生紅球藻進(jìn)行紫外誘變篩選，獲得2株生長速率高的鹽藻和3株蝦青素含量高的雨生紅球藻突變藻株。楊生輝等[17]通過對極大螺旋藻的紫外誘變篩選等脅迫手段，篩選出了1株生長速率快、光合作用高、藻絲體長、蛋白質(zhì)葉綠素含量高的突變藻株。

常壓室溫等離子體（ARTP）誘變[18]是一種新興的物理誘變育種技術(shù)，它是以氦氣為工作載體，在室溫常壓下通過激發(fā)氦離子產(chǎn)生射頻輝光放電高能量的等離子體射流，穿過細(xì)胞壁和細(xì)胞膜使得基因發(fā)生巨大損傷，堿基修復(fù)機(jī)制發(fā)生改變，從而形成穩(wěn)定遺傳突變株。常壓室溫等離子體（ARTP）誘變育種技術(shù)近年來在微生物育種和微藻育種中得到了較為廣泛使用[19]。Fang等[20]通過常壓室溫等離子體（ARTP）誘變育種技術(shù)對螺旋藻進(jìn)行誘變育種，獲得了3株生長速率較快和多糖含量相對較高的突變藻株。Liu等[21]通過ARTP誘變育種技術(shù)對寇氏隱甲藻Crypthecodinium cohnii進(jìn)行誘變育種，篩選出了高產(chǎn)突變藻株M7，細(xì)胞外多糖（EPS）含量和生物量分別提高了33.85%、85.35%。艾江寧等[22]通過對湛江等鞭金藻進(jìn)行ARTP誘變育種，篩選出1株生長速率快，細(xì)胞密度大，油脂含量高的突變藻株。曹旭鵬等[23]通過常壓室溫等離子體（ARTP）誘變育種技術(shù)對湛江等鞭金藻進(jìn)行等離子體的一次和二次誘變，得到了一次誘變篩出率為0.6%、二次誘變篩出率為1.2%的高生長速率和油脂含量高的突變藻株。Zhu等[24]通過常壓室溫等離子體對猴頭菌進(jìn)行誘變育種，獲得1株猴頭菌的突變株與原菌株相比，子實(shí)體產(chǎn)量提高了22%，猴頭菌多糖含量提高了16%。Yu等[25]通過常壓室溫等離子體對吸水鏈霉菌進(jìn)行誘變處理，獲得1株SFK36突變菌株，抗壞血素的產(chǎn)量能夠達(dá)到495.3 mg·L-1，比出發(fā)菌株ATCC 14891增加了32.5%。

本研究主要通過突變效率高的紫外誘變育種技術(shù)和近年新興的常壓室溫等離子體（ARTP）誘變育種技術(shù)對球等鞭金藻進(jìn)行誘變篩選，結(jié)合尼羅紅染色法高通量篩選，快速篩選出具有優(yōu)良性狀的突變藻株，為后續(xù)的研究和基礎(chǔ)餌料藻提供了很好的種質(zhì)資源，解決了球等鞭金藻在不斷的傳代培養(yǎng)過程中出現(xiàn)生長速率緩慢、油脂含量和巖藻黃素含量下降、生物活性不高等藻種退化問題。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

1.1.1?試驗(yàn)藻株?原始藻株：球等鞭金藻藻種購自于上海光語生物科技有限公司。

1.1.2?試驗(yàn)試劑?二甲基亞砜、乙酰氯、氯化鈉、甲醇、丙酮、正己烷等均為國藥集團(tuán)的分析純試劑，色譜級(jí)甲醇購自于德國默克公司，色譜級(jí)正己烷購自于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，尼羅紅染色液和魯哥氏碘液購自于生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.3?試驗(yàn)儀器?紫外誘變箱UVVⅢ、常壓室溫等離子體誘變箱ARTPIIS、蔡司倒置熒光顯微鏡Axio Vert A1、安捷倫氣相色譜儀7890B、超高效液相色譜儀Waters ACQUITY VPIC、FLUOstar Omega全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀等。

1.1.4?試驗(yàn)培養(yǎng)基?f/2培養(yǎng)基[f/2（Guillard.1962）改良配方（海水）]：硝酸鈉75 mg·L-1、一水磷酸氫二鈉5 mg·L-1、乙二胺四乙酸二鈉4.36 mg·L-1、六水合三氯化鐵3.16 mg·L-1、五水合硫酸銅0.01 mg·L-1、七水合硫酸鋅0.023 mg·L-1、六水合二氯化鐵0.012 mg·L-1、Na2MoO4·2H2O 0.07 mg·L-1、維生素B 10.1 mg·L-1、維生素B12 0.5 ug·L-1、生物素0.5 ug·L-1。pH自然，121℃滅菌20 min。

Erdschreiber′s 培養(yǎng)基：滅菌的海水3 L、PIV金屬溶液 12 mL·L-1 （Na2EDTA·2H2O 0.75 g·L-1、FeCl3·6H2O 0.097 g·L-1、MnCl2·4H2O 0.041 g·L-1、ZnCl2 0.005 g·L-1、CoCl2·6H2O 0.002 g·L-1、Na2MoO4·2H2O 0.004 g·L-1），NaNO3 2.3 mmol·L-1、Na2HPO4·7H2O 0.067 mmol·L-1、土壤提取液50 mL·L-1、維生素 B12 1 mL·L-1。pH自然，121℃滅菌20 min。

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?球等鞭金藻的紫外誘變?（1）將球等鞭金藻接種至f/2培養(yǎng)基中無菌化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25℃，放置在LED燈架下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為120 μmol photons m-2s-1，光照周期為光暗比14 h∶10 h，每天定時(shí)對球等鞭金藻搖瓶3次，培養(yǎng)至對數(shù)生長期。在超凈臺(tái)中取100 uL對數(shù)生長期的無菌藻液涂布在預(yù)先倒好的Erdschreiber's 固體培養(yǎng)基平板上（瓊脂含量在0.8%左右），藻液在固體培養(yǎng)基平板上涂布均勻，涂布完后將平板靜止一會(huì)兒。（2）將UVVⅢ紫外誘變箱打開預(yù)熱5 min，選定紫外線波長為254 nm。然后將平板放入紫外誘變箱中間，再打開254 nm波長進(jìn)行紫外照射誘變。（3）紫外誘變時(shí)間預(yù)先分別設(shè)定：1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 min，對照組為涂布完沒有經(jīng)紫外照射的平板。經(jīng)紫外照射完后平板立即蓋上蓋子和封口膜封口，再用報(bào)紙將紫外照射過的平板包起來和對照組一起放置黑暗處避光處理3 h以上，以防止光修復(fù)。（4）避光處理后將平板倒扣放置在LED燈架下，光照強(qiáng)度為120 μmol photons m-2s-1白光培養(yǎng)，光照周期為光暗比14 h∶10 h，培養(yǎng)溫度為25℃，連續(xù)培養(yǎng)15 d左右，觀察平板上的球等鞭金藻生長情況。（5）待培養(yǎng)至15 d左右，球等鞭金藻的單藻落基本上已經(jīng)長出，通過計(jì)算平板上長出的單藻落數(shù)來計(jì)算紫外誘變照射的致死率。致死率=[對照組平板上的單藻落數(shù)（平均數(shù)）-紫外照射組平板上的單藻落數(shù)（平均數(shù)）]/對照組數(shù)×100%。找到致死率在80%～90%的紫外照射時(shí)間，再接著以這個(gè)照射時(shí)間做多次的紫外誘變試驗(yàn)。據(jù)參考文獻(xiàn)描述微藻致死率在80%～90%正向突變概率比較大。

1.2.2?球等鞭金藻等離子體誘變?（1）將球等鞭金藻接種至f/2培養(yǎng)基中無菌化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25℃，放置在LED燈架下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為120 μmol photons m-2 s-1，光照周期為光暗比14 h∶10 h，每天定時(shí)對球等鞭金藻搖瓶3次，培養(yǎng)至對數(shù)生長期。在超凈臺(tái)中取100 uL對數(shù)生長期的無菌藻液涂布在預(yù)先倒好的Erdschreiber′s 固體培養(yǎng)基平板上（瓊脂含量在0.8%左右），藻液在固體培養(yǎng)基平板上涂布均勻，涂布完后將平板靜置一會(huì)兒。（2）將ARTP誘變箱打開預(yù)熱30 min，選定好誘變照射的功率。然后將涂布好的球等鞭金藻平板放入誘變箱中，再設(shè)置好誘變照射時(shí)間進(jìn)行誘變。（3）等離子體誘變照射時(shí)間預(yù)先分別設(shè)定：36、72、108、144、180、216、252、288、324、360 s，對照組為涂布完沒有經(jīng)等離子體照射的平板。照射完后的平板立即蓋上蓋子和封口膜封口。（4）將等離子體照射誘變后的平板和對照組，先正面放置5 h以上，再將平板倒扣過來放置在LED燈架下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為120 μmol photons m-2 s-1，光照周期為光暗比14 h∶10 h，培養(yǎng)溫度為25℃，連續(xù)培養(yǎng)15 d左右，觀察平板的球等鞭金藻生長情況。（5）待培養(yǎng)至15 d左右，球等鞭金藻的單藻落基本上已經(jīng)長出，通過計(jì)算平板上長出的單藻落數(shù)來計(jì)算等離子體誘變照射的致死率。致死率=[對照組平板上的單藻落數(shù)（平均數(shù)）-紫外照射組平板上的單藻落數(shù)（平均數(shù)）]/對照組數(shù)×100%。找到致死率在80%～90%的等離子體照射時(shí)間，再接著以這個(gè)照射時(shí)間做多次的等離子誘變實(shí)驗(yàn)。據(jù)參考文獻(xiàn)描述微藻致死率在80%～90%正向突變概率比較大。

1.2.3?球等鞭金藻突變藻株的初篩與培養(yǎng)?（1）挑選誘變照射平板上單藻落比對照組平板上大的單藻落于96孔板f/2培養(yǎng)基中培養(yǎng)，做好標(biāo)記，培養(yǎng)溫度為25℃，放置在LED燈架下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為120 μmol photons m-2 s-1，光照周期為光暗比14 h∶10 h，培養(yǎng)至10 d左右，轉(zhuǎn)移到24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。待突變藻株基本上在24孔板上長起來，再轉(zhuǎn)移至50 mL三角瓶中培養(yǎng)10 d左右，每天定時(shí)搖瓶3次。再轉(zhuǎn)移到250 mL三角瓶培養(yǎng)，按1∶10接種，每天定時(shí)搖瓶3次。待球等鞭金藻生長到生長指數(shù)期時(shí)，取樣，通過血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，計(jì)算培養(yǎng)的突變藻株細(xì)胞密度。（2）尼羅紅染色法[26-27]高通量篩選富油球等鞭金藻突變藻株。通過細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果來按接種量一樣重新接種培養(yǎng)突變株，培養(yǎng)在250 mL的三角瓶中，培養(yǎng)條件與1.2.3（1）相同。然后每天取樣測定藻液的OD值，制作生長曲線，比較生長速率。連續(xù)培養(yǎng)8 d后，再分別取樣，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，稀釋到細(xì)胞數(shù)一樣的濃度，取200 uL藻液分裝于96孔酶標(biāo)板中，加入尼羅紅染色液，避光染色10 min，再通過FLUOstar Omega全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀測定尼羅紅染色液與球等鞭金藻油脂激發(fā)出來的熒光值，跟原始藻株進(jìn)行比較;同時(shí)通過倒置熒光顯微鏡觀察激發(fā)出來的熒光亮度（橘紅色）進(jìn)行比較。篩選出生長速率快的和熒光值高（油脂含量高）的突變藻株留下進(jìn)行下一階段的復(fù)篩。（3）通過UPLC快速檢測突變藻株中巖藻黃素的含量，直接篩選出巖藻黃素含量高的球等鞭金藻突變藻株。將培養(yǎng)至8 d的藻液取100 mL進(jìn)行離心收集藻泥，預(yù)冷凍干，稱干重，有機(jī)溶劑甲醇浸提巖藻黃素，UPLC快速檢測計(jì)算突變藻株中巖藻黃素的含量。將生長速率快的和巖藻黃素含量高的突變藻株留下進(jìn)行下一階段的復(fù)篩。

1.2.4?球等鞭金藻突變藻株的復(fù)篩與培養(yǎng)?經(jīng)過初篩后，實(shí)驗(yàn)室接種傳代培養(yǎng)至第5代，再進(jìn)行突變藻株的復(fù)篩，篩選出穩(wěn)定性好生物活性高的，生長速率快和巖藻黃素含量高或者油脂含量高的突變藻株。其篩選方法如下：（1）通過日常的培養(yǎng)觀察，篩選顯微鏡鏡鑒球等鞭金藻突變藻株里有鞭毛，游動(dòng)懸浮生長不沉底的，培養(yǎng)生長過程藻液中會(huì)出現(xiàn)“云朵條帶”，液面會(huì)出現(xiàn)近似油光發(fā)亮的“油面層”，說明球等鞭金藻的生長旺盛，生物活性很好。（2）再通過尼羅紅染色法高通量篩選富油突變藻株，UPLC快速檢測突變藻株中巖藻黃素的含量。尼羅紅染色法高通量篩選富油突變藻株同1.2.3（2）方法一樣，篩選出生長速率快和熒光值高（油脂含量高）的突變藻株。再將突變藻株的藻液取樣100 mL進(jìn)行離心收集藻泥，預(yù)冷凍干，稱干重，有機(jī)溶劑甲醇浸提巖藻黃素，UPLC快速檢測計(jì)算巖藻黃素含量，篩選出巖藻黃素含量高的突變藻株。

1.2.5?突變藻株與原始藻株的比生長速率和巖藻黃素含量比較?通過復(fù)篩將篩選出的突變藻株和原始藻株培養(yǎng)于250 mL的三角瓶中，培養(yǎng)基為f/2培養(yǎng)基，接種量一樣，每天測定藻液的OD值，制作生長曲線，連續(xù)培養(yǎng)8 d左右，比較生長速率，計(jì)算比生長速率。比生長速率計(jì)算公式μ=（lnNt2 - lnNt1） /（ t2 - t1） （Nt2為t2 d時(shí)藻液的OD值，Nt1為t1 d時(shí)藻液的OD值）。再將突變藻株和原始藻株的藻液各取樣100 mL進(jìn)行離心收集藻泥，預(yù)冷凍干，稱干重，有機(jī)溶劑甲醇浸提巖藻黃素，UPLC快速檢測計(jì)算巖藻黃素含量。

1.2.6?突變藻株與原始藻株的脂肪酸含量分析?將球等鞭金藻的突變藻株和原始藻株分別培養(yǎng)于1 L三角瓶中，培養(yǎng)基為f/2培養(yǎng)基，放置在LED燈架下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為120 μmol photons m-2 s-1，培養(yǎng)溫度為25℃，光照周期為光暗比14 h∶10 h，連續(xù)培養(yǎng)10 d，離心收集藻泥，預(yù)冷凍干，稱重，碾成粉末，分別稱取40 mg，采用有機(jī)溶劑氯仿甲醇（1∶2）法提取總油脂，經(jīng)甲酯化，氣相色譜檢測分析球等鞭金藻的脂肪酸含量。氣相色譜儀：Agilent 7890B 氣相色譜儀，色譜柱：SP2560 100 m×0.25 mm×0.2 μm，色譜條件：前檢測器溫度為250℃，色譜柱加熱溫度：初始溫度為140℃，維持5 min，再以4℃·min-1的加熱溫度加熱到250℃，再維持12.5 min。進(jìn)樣量為1 μL。脂肪酸標(biāo)品為SIGMA公司的Fatty Acid Methyl Ester，C8～C22，外加入EPA、DHA，內(nèi)標(biāo)為十九酸甲酯。各主要脂肪酸含量計(jì)算，采用面積歸一化法。

2?結(jié)果與分析

2.1?紫外照射誘變和等離子體照射誘變時(shí)間選定

球等鞭金藻在固體培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)15 d以后，根據(jù)對照組平板和試驗(yàn)組誘變平板中的單藻落數(shù)，計(jì)算致死率在80%～90%的平板照射時(shí)間，得出紫外照射誘變時(shí)間為2 min，等離子體照射誘變時(shí)間為252～288 s。

2.2?紫外誘變和等離子體誘變突變菌株篩選

通過多次大量的紫外誘變篩選和等離子體誘變篩選，最終篩選出了7株具有優(yōu)良性狀的突變藻株YB1Z2、ZA2、ZA5、Q2B5ZWYB、Z3YB4、Z3YB11、JN31。其中YB1Z2、Q2B5ZWYB、Z3YB4、Z3YB11這4株突變藻株通過紫外誘變篩選，ZA2、ZA5、JN31這3株突變藻株通過等離子體誘變篩選。尼羅紅染色藻液倒置熒光顯微鏡直接觀察法比較突變藻株的熒光亮度如圖1所示，突變藻株的尼羅紅染色法橘紅色都會(huì)比對照原始藻株亮，ZA5突變藻株的橘紅色最亮，其次是Z3YB4 、JN31、YB1Z2突變藻株。FLUOstar Omega全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀測定突變藻株YB1Z2、ZA2、ZA5、Q2B5ZWYB、Z3YB4、Z3YB11、JN31的熒光比值分別是1.39、1.10、1.54、1.09、1.45、1.09 、1.41，熒光比值最大的是ZA5突變藻株，是原始藻株的1.54倍，其次是Z3YB4突變藻株，是原始藻株的1.45倍。尼羅紅染色高通量篩選法可以快速地檢測微藻細(xì)胞中中性油脂的含量。說明這7株突變藻株的油脂含量比原始藻株高。

2.3?突變藻株與原始藻株的比生長速率和巖藻黃素含量比較

如圖2所示，在突變藻株培養(yǎng)至第4 d時(shí)，通過比生長速率公式計(jì)算可知，YB1Z2、ZA2、ZA5、Z3YB4、JN31的比生長速率分別是對照原始藻株的1.38、1.22、1.33、1.10、1.37倍， 其中突變藻株YB1Z2的生長速率是最快的，其次是突變藻株JN31。由圖3可見，突變藻株YB1Z2、Q2B5ZWYB、Z3YB4、Z3YB11的巖藻黃素單位含量與對照原始藻株相比都高，提高最多的是突變藻株YB1Z2和Z3YB11，分別提高了1.07、1.08倍。

2.4?突變藻株與原始藻株的脂肪酸含量分析

通過對突變藻株和原始藻株的脂肪酸含量分析，其脂肪酸含量見表1，突變藻株YB1Z2、ZA2、ZA5、Q2B5ZWYB、Z3YB4、Z3YB11的不飽和脂肪酸含量都會(huì)比原始藻株提高了1.22、1.09、1.08、1.18、1.13、1.18倍，其主要是單不飽和脂肪酸油酸（C18∶1）提高較多;突變藻株YB1Z2、ZA5、Z3YB4、Z3YB11、Q2B5ZWYB的多不飽和脂肪酸（C22∶6）DHA含量相較于對照原始藻株提高了1.28、1.27、1.26、1.21、1.21倍。

3?結(jié)論與討論

通過紫外誘變和等離子體誘變育種技術(shù)對球等鞭金藻進(jìn)行誘變篩選，共獲得了7株優(yōu)良性狀的突變藻株YB1Z2、ZA2、ZA5、Q2B5ZWYB、Z3YB4、Z3YB11、JN31，其中YB1Z2、Q2B5ZWYB、Z3YB4、Z3YB11突變藻株是通過紫外誘變篩選，ZA2、ZA5、JN31突變藻株是通過等離子體誘變篩選。最后對這7株突變藻株油脂含量進(jìn)行尼羅紅染色法檢測、比生長速率的測定、巖藻黃素含量的測定、脂肪酸含量的分析，結(jié)果顯示：通過對突變藻株尼羅紅染色測定的熒光比值最大的是ZA5突變藻株，是原始藻株的1.54倍，其次是Z3YB4突變藻株，是原始藻株的1.45倍，JN31突變藻株熒光值是原始藻株的1.41倍，YB1Z2突變藻株的熒光值是原始藻株的1.39倍，這7株突變藻株的油脂含量都比原始藻株高。通過對突變藻株比生長速率的測定，突變藻株YB1Z2、ZA2、ZA5、Z3YB4、JN31的比生長速率分別是原始藻株的1.38、1.22、1.33、1.10、1.37倍，突變藻株YB1Z2的生長速率最快，其次是突變藻株JN31。通過對突變藻株巖藻黃素含量的測定，突變藻株YB1Z2、Q2B5ZWYB、Z3YB4、Z3YB11的巖藻黃素單位含量均比原始藻株高，提高最多的是突變藻株YB1Z2和Z3YB11，分別是原始藻株的1.07、1.08倍。通過對突變藻株脂肪酸含量的分析，突變藻株YB1Z2、ZA2、ZA5、Q2B5ZWYB、Z3YB4、Z3YB11的不飽和脂肪酸含量都會(huì)比原始藻株提高了1.22、1.09、1.08、1.18、1.13、1.18倍，突變藻株YB1Z2、ZA5、Z3YB4、Z3YB11、Q2B5ZWYB的多不飽和脂肪酸（C22：6）DHA含量相較于原始藻株提高了1.28、1.27、1.26、1.21、1.21倍，主要提高了不飽和脂肪酸含量，這個(gè)對于基礎(chǔ)餌料藻來說是非常好的突變方向。紫外誘變和等離子體誘變育種技術(shù)不僅在微生物育種得到廣泛應(yīng)用，也在微藻生物育種得到了廣泛應(yīng)用，在解決微藻種質(zhì)退化和獲取優(yōu)良性狀的種質(zhì)資源起著重要的角色。De Jaeger等[28]通過紫外誘變篩選出了5 株缺乏淀粉斜生柵藻的突變藻株，提高了產(chǎn)三酰甘油（TAG）的能力，其中1株突變株產(chǎn)三酰甘油（TAG）的能力可以達(dá)到藻體干重的49.4%。吳曉英等[29]通過等離子體誘變育種技術(shù)對雨生紅球藻進(jìn)行誘變篩選，獲得了1株高產(chǎn)蝦青素的雨生紅球藻突變藻株M45，生物量和生長速率比出發(fā)藻株分別提高了6.45%和8.57%，蝦青素含量提高了51.96%。本研究主要通過紫外誘變和常壓室溫等離子體（ARTP）誘變育種技術(shù)對球等鞭金藻進(jìn)行誘變篩選，結(jié)合尼羅紅染色法高通量篩選，快速篩選出了具有優(yōu)良性狀的7株突變藻株，為后續(xù)的研究和基礎(chǔ)餌料藻提供了很好的種質(zhì)資源，同時(shí)也為廣大的微藻誘變育種科研人員提供了參考。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）