酒地黃炮制過程中4種活性成分含量變化

朱逸超 任娟 仇雪 呼木吉勒圖 蔡寶昌 鄭艷萍

摘要：目的? 建立地黃“九蒸九曬”過程中4種活性成分HPLC檢測方法，探索酒地黃炮制過程中活性成分的含量變化。方法? 采用YMC-Pack ODS-A色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相，梯度洗脫，流速1 mL/min，檢測波長203、334 nm，柱溫35 ℃，測定酒地黃炮制過程中梓醇、毛蕊花糖苷、地黃苷D和益母草苷含量。結果? 建立了地黃“九蒸九曬”過程中4種活性成分HPLC檢測方法;梓醇、毛蕊花糖苷、地黃苷D和益母草苷在各自范圍內線性關系良好（r均大于0.999），精密度、穩(wěn)定性、重復性良好（RSD均小于2.5%），平均加樣回收率為97%～101%（RSD<2%）。梓醇、地黃苷D和益母草苷含量隨蒸制次數(shù)增加而不同程度下降。結論? 本研究初步探索了地黃炮制過程中4種活性成分的變化過程，所建立的方法穩(wěn)定可靠。

關鍵詞：熟地黃;梓醇;毛蕊花糖苷;地黃苷D;益母草苷;炮制;高效液相色譜法

中圖分類號：R284.1? ? 文獻標識碼：A? ? 文章編號：1005-5304（2020）02-0048-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201903351 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Changes of Contents of Four Active Components in Processing of

Rehmanniae Radix Roasting with Wine

ZHU Yichao1， REN Juan1， QIU Xue1， Humujiletu2， CAI Baochang3， ZHENG Yanping3

1. Jiangsu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine， Nanjing 210000， China;

2. Inner Mongolia Academy of Forestry， Huhehaote 010010， China;

3. Nanjing Haichang Chinese Medicine Group Co.， Ltd.， Nanjing 210061， China

Abstract： Objective To establish an HPLC method for the content determination of four active components in the processing of “nine steaming and nine drying” for Rehmanniae Radix; To explore the changes of active components in the processing of Rehmanniae Radix roasting with wine. Methods YMC-Pack ODS-A column （4.6 mm × 250 mm， 5 μm） was used; the mobile phase was eluted with a gradient of acetonitrile-0.1% phosphoric acid; the flow rate was 1 mL/min; the detection wavelength was 203 and 334 nm; the column temperature was 35 ℃. The contents of sterol， verbascoside， rehmannioside D and motherwort in the processing of Rehmanniae Radix roasting with wine were analyzed. Results The HPLC method for the determination of four active components in the processing of “nine steaming and nine drying” was built; the linear relationship of sterol， verbascoside， rehmannioside D and motherwort in respective range was good （r was greater than 0.999）; the precision， stability and repeatability were good （RSD was all less than 2.5%）， and the average sample recovery was 97% to 101% （RSD<2%）. The contents of sterol， rehmannioside D and motherwort decreased in different degree with increase of steaming times. Conclusion The method is stable and reliable， and initially explores the changing process of four active components in the processing of Radix Rehmanniae roasting with wine.

Keywords： Rehmanniae Radix Praeparata; sterols; verbascoside; rehmannioside D; motherwort; processing; HPLC

地黃為玄參科植物地黃Rehmannia glutinosa Libosch.的新鮮或干燥塊根[1]，生地黃炮制后藥性由寒轉溫，作用由清轉補，味由苦轉甜。生地黃清熱涼血、養(yǎng)陰生津，熟地黃滋陰補血。漢代有蒸后取汁法，南北朝有蒸焙，隋唐時期有酒拌蒸、蒸爆九遍、酒炒等法，宋代有炒炭、醋炒、生姜同炒等法[2]。酒制是地黃傳統(tǒng)炮制方法之一，依據(jù)古法記載，需“九蒸九曬”才能得到質量上乘的熟地黃[3-4]。由于現(xiàn)代炮制設備的改進，提高蒸制溫度和控制真空度，地黃炮制工藝簡化，產(chǎn)品控制多以“黑如漆，甜如飴”等籠統(tǒng)性狀變化作為達到炮制終點的判斷標準，缺乏客觀檢測指標[5-6]。本課題組在地黃“九蒸九曬”炮制過程中的不同時間點進行取樣，采用HPLC對地黃炮制過程中樣品的4種活性成分梓醇、毛蕊花糖苷、地黃苷D和益母草苷進行含量測定，輔以感官判斷，探索地黃酒制過程中的活性成分變化。

1? 儀器與試藥

Shimadzu LC-20AB高效液相色譜系統(tǒng)，包括在線脫氣機、Prominence SIL-20A自動進樣器、SPD-M20A二極管陣列檢測器和CTO-20A柱溫箱，日本島津公司;ME204E十萬分之一電子分析天平，梅特勒-托利多國際股份有限公司;BSM220.4萬分之一分析天平，上海卓精公司;DSX-18L高壓滅菌鍋，上海申安器材有限公司;GVS型超聲波清洗器，深圳市夠威科技有限公司;DY-20流水式中藥打粉機，溫嶺市奧力中藥器械有限公司;DHG-9140A型立式電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏器材有限公司。

對照品毛蕊花糖苷（批號61276-17-3，純度≥98%）、益母草苷（批號52949-83-4，純度≥98%）、地黃苷D（批號81720-08-3，純度≥98%）、梓醇（批號2415-24-9，純度≥98%），南京森貝伽生物科技有限公司。3批生地黃樣品分別購自河南省永鑫堂中藥飲片科技有限公司、安徽滬譙中藥有限公司和浙江桐君堂中藥飲片有限公司，經(jīng)南京海源中藥飲片有限公司中藥師丁斐鑒定為玄參科植物地黃Rehmannia glutinosa Libosch.的干燥塊根。GB/T 13662黃酒，浙江古越龍山紹興酒股份有限公司。乙腈、甲醇均為色譜純，水為超純水，磷酸為分析純。

2? 方法與結果

2.1? 不同蒸曬次數(shù)樣品制備

第1日：3批樣品各取2 kg，洗凈外表泥沙，曬干備用;稱取0.4 kg黃酒，拌勻，裝罐，密封悶潤24 h。第2日：將3批樣品分別入鍋隔水蒸8 h，設置水溫為100 ℃。第3日：將3批樣品分別置于日光下放晾曬干，以此為“一蒸一曬”。如此反復8次，共16 d，悶潤過程以1 d計，合計17 d。第18日將3批樣品入鍋隔水蒸制8 h，取出放晾曬干，即為地黃“九蒸九曬”炮制全過程。3批樣品炮制期間每“一蒸一曬”分別稱取50 g留樣，編號為S1～S9[7-9]。

2.2? 色譜條件

采用Kromasil 100-5C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸水（B），梯度洗脫（0～5 min，2%A;5～20 min，20%A;20～25 min，30%A;25～40 min，30%A;40～45 min，2%A;45～50 min，2%A），檢測波長203、334 nm，柱溫35 ℃，進樣量20 μL。

2.3? 溶液制備

2.3.1? 對照品溶液

分別取毛蕊花糖苷、梓醇、地黃苷D、益母草苷對照品適量，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，加甲醇配成濃度分別為498、494、486、650 μg/mL的對照品貯備液，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。分別精密吸取上述對照品溶液適量，加甲醇定容至10 mL，制成每1 mL含毛蕊花糖苷、梓醇、地黃苷D、益母草苷分別為49.80、98.80、97.20、130.00 μg的混合對照品溶液。

2.3.2? 供試品溶液

取炮制過程中不同時間點的樣品（S1～S9）各50 g，置于80 ℃烘箱中干燥8 h，放入干燥器內冷卻，打粉，過24目篩，備用。精密稱取粗粉2.0 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，加入精密量取的50%甲醇25 mL，超聲（功率300 W，頻率40 Hz）處理1 h，取出，放至室溫，再次稱定質量，用50%甲醇補足減失的質量，取上清液5 mL，8000 r/min離心10 min，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4? 系統(tǒng)適用性試驗

取混合對照品溶液和供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件分別進樣20 μL，各成分色譜峰分離良好，色譜圖見圖1。

2.5? 線性關系考察

精密吸取含毛蕊花糖苷（49.80 μg/mL）、梓醇（98.80 μg/mL）、地黃苷D（97.20 μg/mL）和益母草苷（130.00 μg/mL）的混合對照品溶液2、5、10、15、20、25 μL，按“2.2”項下色譜條件測定，記錄峰面積，以峰面積對進樣量進行線性回歸，結果顯示各成分在各自范圍內線性關系良好，見表1。

2.6? 精密度試驗

精密吸取上述混合對照品溶液，按“2.2”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，測得毛蕊花糖苷、梓醇、地黃苷D、益母草苷峰面積RSD分別為0.27%、0.55%、1.07%、0.77%，表明儀器精密度良好。

2.7? 重復性試驗

精密稱取同一批熟地黃樣品粉末6份，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，分別測定，記錄色譜圖，結果毛蕊花糖苷、梓醇、地黃苷D、益母草苷RSD分別為1.29%、1.15%、1.88%、2.44%，表明本試驗方法重復性良好。

2.8? 穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、12、24 h進樣，記錄峰面積，結果毛蕊花糖苷、梓醇、地黃苷D、益母草苷RSD分別為2.36%、0.95%、1.78%、2.48%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

2.9? 加樣回收率試驗

分別精密稱取同一批熟地黃樣品粉末6份，各1.0 g，分別置于錐形瓶中，精密加入毛蕊花糖苷0.3 mg、梓醇0.6 mg、地黃苷D 0.9 mg、益母草苷1.0 mg，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件測定，計算各成分的平均回收率及RSD，結果見表2。

2.10? 樣品測定

取不同來源地黃的不同蒸曬次數(shù)炮制樣品（編號S1～S9分別對應“一蒸一曬”至“九蒸九曬”樣品）及生地黃樣品（編號S0）粉末，分別稱取2 g，精密稱定，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，計算各樣品中毛蕊花糖苷、梓醇、地黃苷D、益母草苷含量。3批地黃不同蒸曬次數(shù)炮制樣品中指標成分含量比較見表3。

3? 討論

本試驗在考察毛蕊花糖苷、梓醇、地黃苷D和益母草苷4種被測成分與雜質峰的分離情況時，比較了乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-水為流動相的梯度洗脫效果，結果顯示，以乙腈-0.1%磷酸水為流動相時峰形較好、分離度高、基線平穩(wěn)，因此，最終選擇乙腈-0.1%磷酸水為流動相。前期查閱文獻得知，毛蕊花糖苷、梓醇、地黃苷D和益母草苷的最大吸收波長分別為334、203、203、210 nm，在預試驗中發(fā)現(xiàn)毛蕊花糖苷含量在波長203 nm處偏低，與最大吸收波長334 nm測定結果有明顯差異，且梓醇、地黃苷D和益母草苷在334 nm波長處幾乎無吸收峰，益母草苷含量在最大吸收波長210 nm處與203 nm無明顯差異，因此選擇波長203 nm作為梓醇、地黃苷D和益母草苷3種成分的檢測波長，334 nm作為毛蕊花糖苷的檢測波長[10]。

在樣品前處理中，本試驗分別對提取方式（超聲、加熱回流）、提取溶劑（25%甲醇、50%甲醇、100%甲醇、乙腈）、提取時間（30、60、90 min）、取樣量（0.5、1.0、2.0 g）進行了考察，結果表明，加熱回流制成的供試品溶液重復性較差，初步判斷誤差是由蒸干程度判定不一導致的。超聲操作簡便，重復性好，故本研究采取超聲提取方式。在對不同提取溶劑進行考察時，不同濃度甲醇提取含量差異小，而用乙腈提取時出現(xiàn)較多雜質峰，最終選擇50%甲醇作為提取溶劑。在對提取時間進行考察時，提取30 min時化學成分提取不完全，提取60 min與90 min差異較小，故選擇提取時間為60 min。在對取樣量進行考察時，取樣量為0.5、1.0 g時4種指標成分響應值較低，故選擇取樣量為2.0 g。綜合幾種樣品前處理方法，最終選擇2.0 g樣品粉末中加入50%甲醇25 mL、超聲處理60 min為本試驗供試品溶液制備方法。

本研究結果表明，梓醇、地黃苷D及益母草苷含量隨著蒸制次數(shù)的增加而出現(xiàn)不同程度下降。初步判斷由于梓醇、地黃苷D和益母草苷均屬于環(huán)烯醚萜苷類化合物，環(huán)烯醚萜類化合物普遍極性較大、易溶于水且熱穩(wěn)定性差[11]，其在加熱過程中的降解程度主要與糖的數(shù)目相關，三糖苷幾乎不降解，二糖苷部分降解，而單糖苷幾乎全部降解[12]。梓醇和益母草苷是單糖苷，熱穩(wěn)定性差，故這2種成分隨著蒸制次數(shù)增加，含量明顯下降且幅度較大。地黃苷D含量隨蒸制次數(shù)增加雖有下降，但在“五蒸五曬”后趨于穩(wěn)定[13]。毛蕊花糖苷屬于苯乙醇苷類化合物，其在“六蒸六曬”時含量達到最大值，之后隨蒸制次數(shù)增加，含量有所下降。

本研究對古法炮制不同時間的地黃化學成分進行研究，對“九蒸九曬”炮制過程中毛蕊花糖苷、梓醇、地黃苷D和益母草苷4種活性成分的含量變化進行了較為系統(tǒng)的對比研究，可為地黃炮制工藝研究提供參考依據(jù)。

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（收稿日期：2019-03-27）

（修回日期：2019-05-06;編輯：陳靜）

基金項目：國家中醫(yī)藥管理局公益性行業(yè)專項（201507002-2）;國家中藥標準化項目（ZYY-2017-062）

通訊作者：鄭艷萍，E-mail：zyp611@163.com