雞蛋貯藏過程中脂質氧化與內源酶活性的相關性

劉 鈺，趙孟斌，于浩坤，楊 莉，呂 兵，王慶玲*

（石河子大學食品學院，新疆 石河子 832003）

雞蛋是一種優(yōu)質膳食來源，在我國日常餐飲消費中占據(jù)重要地位。雞蛋蛋黃中含有功能性磷脂組分，蛋清蛋白質的氨基酸比例均衡，利于胃腸道吸收，因而具有較高的營養(yǎng)價值[1-2]。在長期貯藏過程中，雞蛋品質迅速劣變，并伴隨著蛋黃脂質的水解及氧化[3]，同時，其加工性能迅速降低。研究表明，雞蛋貯藏過程中發(fā)生的諸如蛋黃pH值升高、水分含量增加、蛋黃指數(shù)下降等變化與蛋黃的功能性質密切相關，并受貯藏時間、溫度、濕度等因素的影響[4]。

脂肪酶對雞蛋貯藏過程中的脂質水解起關鍵作用，團隊前期研究結果表明雞蛋貯藏過程中中性脂肪酶、酸性脂肪酶、磷脂酶活性均顯著下降[3]，而最新的蛋黃蛋白質組學研究顯示，新鮮雞蛋黃中存在22 種蛋白酶/蛋白酶抑制劑及628 種多肽，表明蛋黃內部存在抵御和調控氧化的分子基礎[5-6]。

為了深入了解內源酶在雞蛋貯藏過程中對脂質氧化的調控作用，本研究以不同貯藏時期的雞蛋為對象，明確雞蛋貯藏過程中蛋黃脂質的氧化規(guī)律，重點考察雞蛋在不同貯藏時間下的蛋黃內源酶活力動態(tài)變化，以期明確雞蛋貯藏過程中內源抗氧化酶對脂質氧化的調控作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗原料為產(chǎn)蛋24 h內的海蘭褐殼蛋，購于石河子市宏鑫養(yǎng)殖場。

蛋白質定量試劑盒、脂肪酶試劑盒、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒、總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒 南京建成生物研究所。

1.2 儀器與設備

X7酶標儀 美國基因有限公司；Neofuge-15R冷凍離心機 力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；RE-2000A旋轉蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；YXQ-SG46-280S滅菌鍋 上海博迅實業(yè)有限公司；DK-8D恒溫水浴鍋金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

雞蛋于22 ℃、45%相對濕度條件下貯藏60 d，每10 d取樣一次分別測定表征脂質氧化的過氧化值（peroxide value，POV）、MDA含量和脂肪酶、GSH-Px及T-SOD等內源酶活力變化規(guī)律。

雞蛋破殼后去除蛋清，將蛋黃置于濾紙上，用蒸餾水緩慢沖洗殘余蛋清，換至另一濾紙上緩慢滾動至蛋清和蒸餾水被濾紙吸收完全，使用滴管刺破蛋黃膜后吸取蛋黃液，收集蛋黃液于無菌干燥燒杯混勻備用。取一定量蛋黃液，加入4 倍體積生理鹽水，漩渦振蕩器充分混勻，3 500 r/min離心10 min，上清液作為樣品處理液，用于內源酶活力測定。用無水乙醇代替生理鹽水制得樣品處理液，用于MDA含量的測定。

1.3.2 指標測定

1.3.2.1 總蛋白質量濃度的測定

蛋黃中總蛋白質量濃度的測定基于考馬斯亮藍法用試劑盒完成。

1.3.2.2 POV的測定

以氯仿-甲醇溶液為溶劑，進行蛋黃脂質的提取[7]，POV根據(jù)GB 5009.227—2016《食品安全國家標準 食品中過氧化值的測定》，用硫代硫酸鈉溶液滴定法測定。

1.3.2.3 MDA含量的測定

MDA含量的測定基于硫代巴比妥酸法用試劑盒完成。

1.3.2.4 內源酶活力、T-AOC的測定

利用試劑盒進行樣品處理液的內源酶活力和T-AOC的測定。脂肪酶活力采用比色法測定，T-AOC采用2,2’-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)快速法測定；GSH-Px活力采用比色法測定；T-SOD活力采用羥胺法測定；CAT活力的測定采用可見光分光光度法。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每個指標測定至少3 組平行，結果用平均值±標準差表示，SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)單因素方差分析，繪圖利用Origin 8.5軟件完成。

2 結果與分析

2.1 雞蛋貯藏過程中蛋黃總蛋白質量濃度的變化

圖1 雞蛋貯藏過程中蛋黃總蛋白質量濃度的變化Fig. 1 Changes in total protein concentration in egg yolk during storage

由圖1可知，雞蛋貯藏過程中蛋黃總蛋白質量濃度總體呈顯著下降趨勢（P＜0.05），新鮮蛋黃總蛋白質量濃度為22.08 g/L，貯藏50 d后降低至11.17 g/L，降低了49.41%。其主要原因在于雞蛋在貯藏過程中蛋白質在蛋白酶的作用下會發(fā)生分解[8]，貯藏過程中蛋黃水分含量的增加也與蛋白質量濃度減少有關。在貯藏60 d時，蛋黃中蛋白質量濃度反而表現(xiàn)出略微上升，可能與貯藏后期蛋白酶抑制劑的作用有關。此外，貯藏后期雞蛋發(fā)生腐敗變質現(xiàn)象，可能出現(xiàn)散黃蛋[9-11]，蛋清和蛋黃混合使總蛋白質量濃度在50～60 d升高了0.69 g/L。差異蛋白質組學研究表明，蛋黃蛋白質在貯藏過程中發(fā)生顯著變化。Gao Dan等對不同貯藏時間的蛋黃漿質進行二維電泳差異比對，發(fā)現(xiàn)33 個蛋白點12 種蛋白質豐度發(fā)生顯著變化，進一步研究分析表明蛋白酶抑制劑（如卵抑制劑、類α2-巨球蛋白）的降解對雞蛋貯藏過程中的品質劣變發(fā)揮了重要作用[12]。該結果進一步解釋了本研究貯藏后期蛋黃總蛋白質量濃度上升的原因。楊小龍等[13]研究了貯藏溫度對雞蛋營養(yǎng)成分的影響，發(fā)現(xiàn)4 ℃和16 ℃貯藏條件下，蛋黃蛋白質量濃度隨貯藏時間延長均呈波動性下降趨勢，與本研究結果類似。

2.2 雞蛋貯藏過程中POV的變化

圖2 雞蛋貯藏過程中POV的變化Fig. 2 Changes in POV in eggs during storage

POV是衡量油脂氧化初期氧化程度的重要指標。由圖2可知，雞蛋貯藏初期POV呈大幅上升趨勢，至貯藏第30天時POV達到最大值0.173 mg/g。究其原因，貯藏過程中雞蛋與外界進行水分和氣體交換，蛋黃脂質氧化程度不斷加劇。王慶玲等[14]同樣發(fā)現(xiàn)雞蛋在貯藏前15 d POV變化呈顯著上升趨勢。本研究中，貯藏30 d后蛋黃脂質的POV基本趨于平穩(wěn)，貯藏后期未表現(xiàn)出POV繼續(xù)上升，這與初級氧化產(chǎn)物向次級氧化產(chǎn)物的轉變有關。當油脂深度氧化時，氫過氧化物的氧化速率超過了生成速率，導致POV降低[15]，然而本研究中貯藏后期的POV呈現(xiàn)平穩(wěn)狀態(tài)可能是蛋黃內源抗氧化物質的作用結果。

2.3 雞蛋貯藏過程中MDA含量的變化

圖3 雞蛋貯藏過程中MDA含量的變化Fig. 3 Changes in MDA content in eggs during storage

脂質氧化過程中的主要次級產(chǎn)物是一些醛、酮、酸類[16]，MDA含量是衡量脂質氧化程度的重要指標。由圖3可知，隨著貯藏時間的延長，MDA含量呈上升趨勢。雞蛋貯藏過程中MDA含量初始為0.22 nmol/mg，在40 d前大致平穩(wěn)但略有上升，貯藏40～60 d呈大幅上升，60 d時達2.70 nmol/mg。說明在貯藏過程中蛋黃脂質發(fā)生了顯著的氧化反應，次級氧化產(chǎn)物積累隨時間延長而增多。Galobart等則發(fā)現(xiàn)雞蛋在貯藏前60 d硫代巴比妥酸值先上升后下降[17]，說明脂質氧化后期MDA含量減少，與本研究結果的差異主要在于其與本研究貯藏溫度不同，且飼料中添加了亞麻油等物質，這些物質能夠抑制貯藏后期的蛋黃脂質氧化反應。

2.4 雞蛋貯藏過程中脂肪酶活力的變化

脂肪酶主要是指一類能夠催化甘油三酯水解生成脂肪酸、甘油和甘油單酯或二酯的酶[18]，其活力與雞蛋貯藏過程中的脂質水解密切相關。由圖4可知，雞蛋貯藏過程中脂肪酶活力呈現(xiàn)顯著下降趨勢（P＜0.05）。經(jīng)過60 d的貯藏，脂肪酶活力由1.78 U/g降至0.29 U/g，較新鮮雞蛋下降了83.71%。研究結果表明脂肪酶活力與貯藏時間呈負相關，脂肪酶在貯藏前期不斷發(fā)揮促進脂質水解的功能，而隨著貯藏時間延長，酶活力下降，導致其促進脂質水解的能力逐漸降低。王慶玲[3]對雞蛋貯藏過程中脂質變化規(guī)律研究表明：蛋黃脂質尤其是磷脂含量隨貯藏時間延長不斷降低歸功于內源酶誘導的磷脂水解，且貯藏前期脂質水解強度更大，此結論與本研究中脂肪酶活力測定的結果相互印證。

2.5 雞蛋貯藏過程中GSH-Px活力的變化

圖5 雞蛋貯藏過程中GSH-Px活力的變化Fig. 5 Changes in GSH-Px activity in eggs during storage

GSH-Px是一類具有抗氧化活性的蛋白酶類，其對保護蛋黃中諸如不飽和脂肪酸等成分具有重要的作用[19]。由圖5可知，在貯藏的前40 d，雞蛋GSH-Px活力顯著下降（P＜0.05），并在第40天達到最低值0.067 U/mg，而后呈波動下降趨勢，這說明GSH-Px抗氧化能力隨著貯藏時間延長不斷降低。在貯藏40～50 d過程中，GSH-Px活力略升高，主要原因可能是貯藏后期蛋黃脂質氧化產(chǎn)物累積，蛋黃游離卵磷脂中的卵黃高磷蛋白磷酸肽對脂質過氧化發(fā)揮抑制作用[20]，從而促使GSH-Px活力從0.067 U/mg上調至0.245 U/mg。

2.6 雞蛋貯藏過程中T-SOD活力的變化

圖6 雞蛋貯藏過程中T-SOD活力的變化Fig. 6 Changes in T-SOD activity in eggs during storage

自由基是生物氧化過程中的副產(chǎn)物，主要包括超氧陰離子自由基及羥自由基。SOD能夠催化超氧陰離子自由基歧化為H2O2和O2[21]。由圖6可知，雞蛋貯藏過程中T-SOD活力表現(xiàn)出前期下降、貯藏中期顯著上升（P＜0.05）、而后又略下降的趨勢。0～20 d貯藏過程中T-SOD活力下降，20 d以后則表現(xiàn)出顯著上升，從0.20 U/mg升至2.87 U/mg（50 d），在第60天活力降至2.42 U/mg。前期T-SOD活力的下降歸因于蛋黃內氧化體系的共同作用；貯藏中期T-SOD活力的上升可能是雞蛋在貯藏過程中被病毒或細菌等侵害，SOD參與了由病毒感染和細菌引起的免疫反應，從而引起酶活力上升[22]，表明雞蛋內部的抗氧化酶在貯藏過程中能夠發(fā)揮一定的抗氧化功能；而后期的T-SOD活力下降可能是由于貯藏后期蛋黃的pH值顯著上升[8]，導致T-SOD活力下降。

已有研究發(fā)現(xiàn)了與本實驗類似的結果，何青芬等[23]在對蛋黃抗氧化能力的研究中發(fā)現(xiàn)的SOD活力變化規(guī)律與本研究相同。Wawrzykowski等證明了蛋黃來源的SOD具有較高活力，并發(fā)現(xiàn)4 ℃貯藏6 d SOD活力顯著下降[24]；3 年后，該作者證實了蛋黃SOD可保護脂肪酸免受過氧化損傷[25]。趙啟龍等[26]在殼聚糖對蛋黃抗氧化功能的研究中，發(fā)現(xiàn)蛋黃在貯藏前期T-SOD活力緩慢下降，貯藏8 周出現(xiàn)顯著上升。

2.7 雞蛋貯藏過程中CAT活力的變化

CAT能將有害的活性氧H2O2分解為H2O和O2[27]。因此，雞蛋內源CAT能夠抑制H2O2引起的雞蛋機體過氧化損傷。由圖7可知，雞蛋貯藏過程中CAT活力整體呈下降的趨勢，而在貯藏第20天略微上升，30 d時出現(xiàn)明顯的拐點。CAT活力在20～30 d時升高的原因在于這一階段SOD催化產(chǎn)生了過多的H2O2，導致機體產(chǎn)生應激反應，從而使CAT活力升高。30 d后的活力下降則表明雞蛋內源CAT的抗氧化作用減弱。孫寶麗等[28]在測定蛋黃中CAT活力的研究中發(fā)現(xiàn)在貯藏的第28天時CAT活力達最大值，與本研究結果類似。

圖7 雞蛋貯藏過程中CAT活力的變化Fig. 7 Changes in CAT activity in eggs during storage

2.8 雞蛋貯藏過程中T-AOC的變化

圖8 雞蛋貯藏過程中T-AOC的變化Fig. 8 Changes in T-AOC in eggs during storage

T-AOC反映機體抵御系統(tǒng)的抗氧化能力，代表了機體內的酶和非酶抗氧化物的總體水平[29]。由圖8可知，雞蛋貯藏過程中T-AOC在貯藏的第20天達最大值1.60 mmol/L，20～30 d急劇下降，30～60 d下降平緩。這種變化歸結于貯藏前期在CAT、GSH-Px等抗氧化酶作用下雞蛋體現(xiàn)出較高的抗氧化能力，而后由于內源酶活性的動態(tài)波動，導致T-AOC下降。總體上，雞蛋貯藏前期能夠維持較高的抗氧化能力，而貯藏后期抗氧化能力不斷下降。

2.9 相關性分析結果

圖9 蛋黃氧化指標及酶活力相關性分析Fig. 9 Correlation analysis between lipid oxidation indices and endogenous enzyme activity in egg yolk

采用偏最小二乘回歸（partial least squares regression，PLSR）對不同的貯藏時間下的蛋黃氧化指標及酶活力進行相關性分析，建立PLS2模型，所得模型如圖9所示。氧化程度與抗氧化酶活力擬合率分別達到97%、59%?？偟鞍踪|量濃度、脂肪酶活力、GSH-Px活力在圖中分布聚集度較高，說明總蛋白質量濃度與脂肪酶誘導的脂質水解密切相關，而T-AOC的下降歸因于GSH-Px、CAT活力隨貯藏時間延長的不斷降低。脂質氧化指標與脂肪酶活力具有顯著負相關性，脂肪酶誘導的脂質水解對脂質氧化具有重要貢獻，而隨著脂質氧化程度的不斷加深，蛋黃總蛋白質量濃度顯著降低。由分析結果可知，T-SOD與脂質氧化程度表現(xiàn)出顯著正相關，說明貯藏過程中的蛋黃T-SOD活性被激活從而發(fā)揮一定的抗氧化能力。

在雞蛋貯藏后期，雖然GSH-Px、T-SOD活力表現(xiàn)出不同程度的升高，但蛋黃POV、MDA含量仍呈現(xiàn)上升趨勢，這是由于相比單一酶的抗氧化活性升高，T-AOC更能反映蛋黃整體抗氧化能力，它代表蛋黃中酶和非酶性抗氧化物的總體水平。此外，脂質氧化的過程十分復雜，除酶促氧化之外，自動氧化也是重要的氧化途徑[30]，最終導致蛋黃脂質氧化能力大于其抗氧化酶體系的抗氧化能力。

3 結 論

隨貯藏時間延長，蛋黃脂質氧化程度不斷加深，蛋黃T-AOC和GSH-Px、CAT活力逐漸下降，而T-SOD活力先下降后上升再下降的趨勢。相關性分析表明，脂質氧化前期T-SOD、GSH-Px、CAT共同形成抗氧化防御體系，而氧化后期主要由T-SOD發(fā)揮抗氧化作用。