姬松茸多肽提取物對D-半乳糖致衰老模型小鼠的保護作用

馮晴霞，閆宇寧，楊 嶧，周嘉寧，李樂斌，盧學春*，安麗萍,*

（1.北華大學藥學院，吉林 吉林 132013；2.中國人民解放軍總醫(yī)院血液科，北京 100853）

人體細胞及組織的衰老是指在結構和機能上出現退行性變化，在衰老過程中神經系統(tǒng)逐步衰退進而產生學習記憶能力減退等現象[1-2]。機體氧化應激程度加劇是衰老發(fā)生的重要原因，而氧化應激的程度取決于氧化與抗氧化體系的平衡[3-6]。因此，提高機體的抗氧化能力可以延緩衰老進程。天然產物中含有大量的抗氧化活性物質，將天然抗氧化活性物質用于預防衰老及相關疾病已成為現代生物研究領域的熱點。

真菌作為天然產物的重要來源，其抗氧化活性物質的研究已顯示出廣闊的發(fā)展前景。姬松茸（Agaricus blazei Murill）又名小松菇、巴西蘑菇，是一種大型真菌，具有濃郁杏仁香味，屬擔子菌亞門層菌綱傘菌目蘑菇（黑傘）科蘑菇（黑傘）屬[6]。姬松茸子實體中富含蛋白質、糖類、甾醇、黃酮等多種生物活性物質，具有廣泛的生物活性，如抗腫瘤、降血糖、抗炎、增強免疫力等[7-8]。姬松茸蛋白具有明顯的抗氧化和提高乙酰膽堿酯酶活性等功效[9]。蛋白質經蛋白酶部分水解后，可獲得具有生物活性的多肽；與大分子蛋白相比，活性生物多肽具有安全穩(wěn)定、易溶于水、易吸收等優(yōu)點，且其清除自由基的能力與分子質量有關，分子質量越小，其抗氧化能力越強[10-12]。姬松茸多肽是姬松茸子實體中提取的蛋白質經過蛋白酶水解后的活性物質，本課題組前期實驗證明，姬松茸多肽對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基和羥自由基均具有較好的清除作用，體外抗氧化作用明顯，但其抗衰老作用和機制還需要進一步研究。

本研究優(yōu)化姬松茸多肽的提取方法，通過建立D-半乳糖（D-galactose，D-gal）誘導的小鼠衰老模型，觀察姬松茸多肽對衰老模型小鼠的保護作用，為姬松茸的應用提供更多的理論及實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

S P F級雄性I C R小鼠（4～5 周齡，體質量（20.0±2.0）g，n＝40，生產許可證號：SCXK（吉）-2016-0003）及飼料 長春億斯實驗動物技術有限責任公司；姬松茸子實體粉末 江蘇省蘇威微生物研究有限公司。

Sephadex G-50 中國長征制藥廠；D-gal 美國Sigma-Aldrich公司；總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒 南京建成生物工程研究院；核因子E2相關因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）、NAD(P)H∶醌氧化還原酶（NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1，NQO1）、谷氨酸半胱氨酸連接酶（glutamate-cysteine ligase，GCLM）、β-actin引物、BCA蛋白定量試劑盒 北京鼎國昌盛生物技術有限公司；RNA提取試劑盒、一步法逆轉錄聚合酶鏈式反應（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒 諾唯贊生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

UV-2550型紫外-可見分光光度計 島津國際貿易（上海）有限公司；MT-200 Morris水迷宮分析儀、BA-200小鼠避暗儀 成都泰盟科技有限公司；PCR儀美國Applied Biosystems公司。

1.3 方法

1.3.1 姬松茸多肽的提取

將姬松茸子實體粉末去除顆粒雜質，稱取一定量與蒸餾水以1∶2（m/V）比例混合，于冰上勻漿后5 000×g離心3 min，取上清液，加入0.157 g/mL硫酸銨溶液，在4 ℃下將上清液中的可溶性蛋白質沉淀過夜，4 000×g離心10 min，合并沉淀。用去離子水溶解沉淀，并使用截留分子質量30 kDa的透析膜在4 ℃下用去離子水透析24 h，透析后冷凍干燥制得姬松茸蛋白粉。取一定量姬松茸蛋白粉按1∶20（m/V）加入蒸餾水，用0.1 mol/L鹽酸溶液調節(jié)pH值至2.5，加入胃蛋白酶解液（3 000 U/mg），混勻后置于37 ℃恒溫水浴中水解4 h，酶解結束后，100 ℃加熱10 min滅酶，冷凍干燥制得初步提取粗多肽級分。

1.3.2 姬松茸多肽的純化

稱取Sephadex G-50（50～100 目）約50 g，加入1 L純凈蒸餾水中，于室溫（22 ℃）下靜置3 h，進行溶脹。垂直安裝色譜柱，蒸餾水平衡3 h后加樣，以蒸餾水為洗脫液進行洗脫，流速1 mL/min，檢測波長280 nm。收集組分冷凍干燥，即為姬松茸多肽提取物。使用BCA蛋白定量試劑盒測定得到姬松茸多肽提取物中多肽質量分數為87%。

1.3.3 姬松茸多肽的鑒定

采用Tricine-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）鑒定小分子肽，凝膠制備參考表1。取樣品溶液10 μL，加入40 μL樣品緩沖液后，沸水浴冷卻后上樣。按預定順序加樣后電泳電壓為60 V，當樣品進入分離膠后，120 V恒壓繼續(xù)電泳直至溴酚藍移動至分離膠底部。電泳結束后取出凝膠染色1 h，脫色液脫色。

表1 Tricine-SDS-PAGE凝膠的組成Table 1 Compositions of Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis gel

1.3.4 實驗動物分組與給藥

選取6 周齡雄性ICR小鼠40 只，喂養(yǎng)7 d，隨機分為4 組，每組10 只，分別為空白組、模型組、姬松茸多肽組和陽性藥物（吡拉西坦）組。除空白組外，其余各組小鼠每日固定時間皮下注射D-gal 300 mg/（kgmb·d），空白組小鼠注射相同劑量的生理鹽水。同時，陽性對照組小鼠灌胃400 mg/（kgmb·d）吡拉西坦，姬松茸多肽組小鼠灌胃400 mg/（kgmb·d）姬松茸多肽提取物，空白組、模型組小鼠每日灌胃等量蒸餾水，持續(xù)6 周。

1.3.5 避暗實驗

末次給藥后第2天進行避暗實驗。小鼠放入明室中，使其適應環(huán)境后給予5 min持續(xù)電流，小鼠進入暗室即受電擊返回明室，實驗重復2 d。從實驗開始至第1次進入暗室的時間記為潛伏期，實驗開始5 min內小鼠進入暗室的次數記為錯誤次數，記錄小鼠潛伏期和錯誤次數。實驗期內未進入暗室的小鼠潛伏期計為300 s[13]。

1.3.6 Morris水迷宮實驗

末次給藥后第2天進行Morris水迷宮實驗檢測小鼠的空間學習記憶能力。固定隱形平臺位置，將各組小鼠沿池壁從定點放入水池，記錄每只小鼠在120 s內到達隱形平臺的時間（逃避潛伏期），并能夠在隱形平臺區(qū)停留10 s。若超過120 s則記為120 s，共訓練6 d。第7天撤去平臺，隨機選下水點，記錄120 s內小鼠分別在中心區(qū)、中環(huán)、目標象限的游泳穿梭次數[14-15]。

1.3.7 生化指標檢測

末次給藥結束第2天處死小鼠，眼球取血，4 ℃、10 000×g離心分離血清。T-AOC采用比色法測定；CAT活力采用黃嘌呤氧化酶法測定，以每毫克血紅蛋白計；MDA濃度采用硫代巴比妥酸法測定；ROS水平使用熒光探針2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽進行檢測，以每毫升血清的熒光強度表示ROS水平。具體操作流程按照試劑盒說明書進行。

1.3.8 小鼠腦組織海馬區(qū)及周圍組織形態(tài)病理學觀察

末次給藥后第2天，小鼠注射0.2 mL 10 g/100 mL水合氯醛溶液麻醉后開胸，在右心耳處剪開，緩慢灌注20 mL磷酸鹽緩沖液和20 mL 4 g/100 mL多聚甲醛，灌注后取全腦，脫水后冷凍切片。加入體積比1∶1的乙醚-乙醇固定5～10 s，自來水沖洗2～5 s，加入蘇木精染液滴染1～2 min，自來水沖洗2～5 s，再加入鹽酸-乙醇（體積比1∶99）分化液反應2～5 s，自來水沖洗2～5 s，加入1%氨水反藍，自來水沖洗5～10 s，加入伊紅染液染色2～5s，自來水沖洗，進行蘇木精-伊紅（hematoxylineosin，HE）染色。染色結束后，分別用體積分數80%、92%和無水乙醇脫水，按體積比1∶3加入苯酚二甲苯反應2～5 s，再加入二甲苯透明3 次，中性樹膠封片，觀察小鼠腦組織海馬區(qū)及周圍組織形態(tài)變化。

1.3.9 RT-PCR檢測Nrf2、NQO1、GCLMmRNA相對表達量

小鼠取腦組織海馬區(qū)應用試劑盒提取組織中總RNA。按照試劑盒說明書進行RT-PCR擴增，PCR條件為：50 ℃、30 min；94 ℃、3 min；94 ℃、30 s，30 個循環(huán)；55～58 ℃、30 s，30 個循環(huán)；72 ℃、30 s，30 個循環(huán)；72 ℃、5 min；37 ℃、4 min。以β-actin為內參，計算Nrf2、NQO1、GCLMmRNA的相對表達量。引物設計見表2。

表2 RT-PCR引物Table 2 Primer sequences used for RT-PCR

1.4 數據處理與分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件處理各組數據，結果用平均值±標準差表示，選用t檢驗判斷結果的顯著性，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 姬松茸多肽的純化結果

圖1 姬松茸多肽粗提物的Sephadex G-50凝膠層析圖Fig. 1 Sephadex G-50 chromatogram of crude peptide extract from Agaricus blazei

由圖1可知，經過Sephadex-50葡聚糖凝膠過濾后洗脫，洗脫曲線出現2 個波峰，12 min處呈現出1 個明顯的波峰即為姬松茸多肽。

2.2 姬松茸多肽的Tricine-SDS-PAGE結果

圖2 姬松茸多肽提取物的Tricine-SDS-PAGE圖Fig. 2 Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis of puri fi ed peptide extract from Agaricus blazei

將酶解后的姬松茸粗多肽級分和純化后的姬松茸多肽提取物進行Tricine-SDS-PAGE。由圖2可知，酶解后的姬松茸粗多肽級分分子質量在6～70 kDa內均有分布；而經Sephadex-50葡聚糖凝膠純化后的姬松茸多肽提取物，顯示均一條帶，分子質量在10 kDa左右。

2.3 姬松茸多肽對小鼠一般情況的影響

給藥實驗結束后，空白組小鼠組行動活躍，反應靈敏，且毛色光滑。模型組小鼠毛色發(fā)黃、無光澤，皮膚松弛，行動緩慢，精神萎靡，四肢無力，易抓取，呈趴伏蜷縮態(tài)，出現明顯的衰老特征。姬松茸多肽組與陽性藥物組小鼠毛色發(fā)暗、臟亂，但無明顯毛發(fā)稀疏的現象，其中個別呈趴伏蜷縮態(tài)，且有弓背現象，剩余小鼠外觀及狀態(tài)介于空白組與模型組之間。

2.4 小鼠避暗實驗結果

圖3 小鼠避暗實驗錯誤次數（A）和潛伏期時間（B）（n＝10）Fig. 3 Effect of puri fi ed peptide extract from Agaricus blazei on number of errors (A) and step-through latency in mice (B) (n = 10)

由圖3可知，與空白組比較，模型組小鼠避暗實驗2 d內錯誤次數顯著增高，潛伏期時間（48 h）顯著縮短（P＜0.05）；與模型組比較，陽性藥物組小鼠錯誤次數顯著減少（P＜0.05），潛伏期時間（48 h）顯著延長（P＜0.05），姬松茸多肽組小鼠錯誤次數顯著減少（P＜0.05或P＜0.01），潛伏期時間（48 h）極顯著延長（P＜0.01）。

2.5 Morris水迷宮實驗結果

3 Morris水迷宮實驗中小鼠的逃避潛伏期（ ＝10）Table 3 Effect of purififi ed peptide extract from Agaricus blazei on escape latency of mice in Morris water maze ( = 10)

表4 Morris水迷宮實驗中小鼠的游泳穿梭次數（ ＝10）Table 4 Effect of purififi ed peptide extract from Agaricus blazei on platform-crossing number of mice in Morris water maze ( = 10)

由表3、4可知，與空白組比較，模型組小鼠在定位航行（水迷宮實驗）中的逃避潛伏期（除第1天）顯著延長（P＜0.05或P＜0.01），同時中心區(qū)和中環(huán)的穿梭次數顯著減少（P＜0.05或P＜0.01），目標象限的穿梭次數稍有減少但不顯著。與模型組比較，姬松茸多肽組小鼠定位航行中的逃避潛伏期顯著縮短，且實驗期內呈遞減趨勢，第6天時逃避潛伏期僅為24.23 s，較模型組（85.28 s）極顯著降低（P＜0.01）。模型組小鼠穿越中心區(qū)次數僅有1 次，姬松茸多肽組小鼠約為3 次，穿越次數極顯著增多（P＜0.01）。與模型組小鼠比較，姬松茸多肽組小鼠穿越中環(huán)次數顯著增多（P＜0.05）。

2.6 姬松茸多肽對小鼠血清生化指標的影響

表5 小鼠血清MDA、CAT、ROS、T-AOC水平（ ＝8）Table 5 Effect of purififi ed peptide extract from Agaricus blazei on MDA, CAT, ROS and T-AOC levels in serum of mice ( = 8)

由表5可知，與空白組比較，模型組小鼠血清MDA濃度極顯著升高（P＜0.01），ROS水平顯著升高（P＜0.05），CAT活力和T-AOC顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，姬松茸多肽組小鼠血清MDA濃度顯著降低（P＜0.05），ROS水平極顯著降低（P＜0.01），CAT活力和T-AOC極顯著升高（P＜0.01）。

2.7 小鼠腦組織海馬區(qū)神經元形態(tài)學變化

圖4 HE染色觀察小鼠腦組織海馬區(qū)神經元形態(tài)變化（×200）Fig. 4 Morphological changes of hippocampal neurons observed by HE staining (× 200)

由圖4可知，空白組小鼠腦組織海馬區(qū)神經元排列緊密有序，胞核和胞漿清晰可見，單個細胞面積較大。而模型組與空白組相比，小鼠腦組織海馬區(qū)錐體神經元結構松散，排列稀疏，間隙增大，正常錐體神經元數量明顯減少，大部分細胞出現核固縮，細胞形態(tài)不一。姬松茸多肽干預后小鼠海馬錐體細胞形態(tài)基本保持正常，與模型組比較排列緊密，間隙減少，層次清晰，形狀體積均一。

2.8 姬松茸多肽對腦組織中Nrf2、NQO1、GCLM基因表達的影響

圖5 姬松茸多肽對Nrf2Nrf2、NQO1NQO1、GCLMGCLM基因表達的影響（n＝3）3Fig. 5 Effect of purified peptide extract from Agaricus blazei on the expression of Nrf2, NQO1 and GCLM genes (n = 3)

由圖5可知，與空白組相比，模型組小鼠腦組織Nrf2、NQO1、GCLMmRNA相對表達量顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，姬松茸多肽組小鼠腦組織中Nrf2mRNA相對表達量顯著增高（P＜0.05），誘導其下游靶基因NQO1、GCLMmRNA相對表達量顯著增高（P＜0.05）。進一步驗證有可能通過影響Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白1（Kelch-like epichlorohydrin-related protein 1，Keap1）/Nrf2/抗氧化反應元件（antioxidant response element，ARE）信號通路中Nrf2、NQO1、GCLM表達而發(fā)揮相關作用。

3 討 論

姬松茸多肽是從姬松茸中提取的有效成分，許多動、植物蛋白中的多肽在體內或體外釋放后均表現出生物活性，這些多肽除具有營養(yǎng)作用外，在體內還具有一些生理功能，如抗菌、促進礦物質吸收、增強免疫和抗氧化等[9]。本研究采用硫酸銨沉淀結合酶解法提取姬松茸活性多肽并通過葡聚糖凝膠進行純化，冷凍干燥后得到有活性的姬松茸多肽提取物。

自由基損傷學說是眾多科學家共識的衰老學說。D-gal誘導的衰老模型是目前較經典的衰老動物模型，能夠阻斷大腦皮層、隔區(qū)、海馬區(qū)中受體的結合位點并且伴隨腦內氧化應激狀態(tài)的改變，從而使自由基過量引起衰老[16-18]，接近于自然衰老規(guī)律。其具體機制在于可使生物體中產生大量ROS，導致細胞線粒體系統(tǒng)損傷，產生大量過氧化脂質，同時ROS及其過氧化產物MDA水平升高，CAT等抗氧化酶活力下降，最終導致機體抗氧化水平降低甚至損傷，出現各種衰老變化[18-22]。本實驗結果提示，模型組小鼠毛發(fā)稀疏、狀態(tài)萎靡，并伴隨學習記憶力衰退、行為能力降低、反應遲緩等，具有明顯的衰老癥狀。而給予姬松茸多肽干預后，衰老小鼠運動和耐應激能力有所提高，血清T-AOC、CAT活力增強，并且能夠清除過剩ROS，降低脂質過氧化物的產生。且海馬區(qū)神經細胞的結構完整性好，出現退化固縮的細胞數量明顯減少，抗衰老作用明顯。

Nrf2作為細胞氧化應激反應的重要因子，可以在氧化應激中發(fā)揮核心調控作用，提高體內的抗氧化能力，減輕細胞氧化損傷，增強對ROS的清除能力，延緩衰老[22-26]。當機體遭受氧化損傷時，Nrf2磷酸化進而與Keap1解偶聯，進入細胞核內，隨后結合相關基因的ARE轉錄，并誘導其下游靶基因GCLM、NQO1表達，使其表達量降低[26-30]。本實驗結果中，與空白組相比，模型組小鼠腦組織中Nrf2、NQO1、GCLM mRNA相對表達量顯著降低，而給予姬松茸多肽后表達水平較模型組增高，表明姬松茸多肽抗衰老作用機制可能與Nrf2/ARE抗氧化信號通路有關。

綜上所述，姬松茸多肽提取物對D-gal誘導的衰老小鼠具有保護作用，該作用為開發(fā)姬松茸系列產品提供理論參考。