桑葉生物堿對四氯化碳聯(lián)合高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化的改善作用

王祖文，楊忠敏，黃先智，丁曉雯,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，食品科學(xué)與工程國家級實驗教學(xué)示范中心，重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏重點實驗室，重慶 400716；2.西南大學(xué)科技處，重慶 400716）

肝纖維化是由各種刺激如病毒感染、乙醇、藥物毒性或其他因素誘導(dǎo)的慢性炎癥反應(yīng)的最終結(jié)果[1-2]。肝纖維化也是肝損傷發(fā)展至肝硬化的中間環(huán)節(jié)，延緩或逆轉(zhuǎn)肝纖維化的發(fā)生是治愈大多數(shù)慢性肝病的關(guān)鍵[3]。

大量研究表明，天然活性成分如總生物堿類（排錢草生物堿[4]、巴蓮蓮子生物堿[5]和小檗堿[6]）、多糖類（黃芪多糖[7]和杜仲多糖[8]）、酚類物質(zhì)（姜黃素[9]和白蘆藜醇[10]）等具有抗肝纖維化的作用。桑葉廣泛分布于全國各地，作為中藥的歷史源遠(yuǎn)流長?！吨袊幍洌?015版）》中記載桑葉甘、苦，寒，歸肺、肝經(jīng)，具有疏風(fēng)散熱、益肝通氣、清肝明目等功效[11]，桑葉營養(yǎng)豐富、無毒副作用，可作為藥食兩用植物。桑葉生物堿作為桑葉的一種特征活性成分，具有降糖[12]、降脂[13]、抑制病毒活性[14]、抗腫瘤細(xì)胞生長[15]和減輕腎損傷[16]等作用。本實驗室前期研究結(jié)果表明，桑葉生物堿能顯著降低高脂飲食誘導(dǎo)的肝損傷小鼠血漿谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）活性，調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素10（interleukin-10，IL-10）和細(xì)胞凋亡因子Bcl-2與Bax mRNA表達(dá)水平，對高脂飲食引起的肝損傷有顯著改善作用[17]?；谇捌谘芯拷Y(jié)果，本實驗利用低劑量（體積分?jǐn)?shù)10%）四氯化碳（CCl4）橄欖油溶液聯(lián)合高脂飲食建立小鼠肝纖維化模型，通過灌胃不同劑量桑葉生物堿，觀察桑葉生物堿對肝纖維化小鼠肝功能、肝纖維化的改善作用，旨在為桑葉資源的合理利用以及作為保肝食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPF級雄性昆明小鼠（4 周齡，體質(zhì)量（20±2）g；生產(chǎn)許可證號：SCXK（渝）2018-0003；使用許可證號：SYXK（渝）2018-0003）和基礎(chǔ)飼料由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。高脂飼料為實驗室自制，配方參照文獻(xiàn)[17]，并進(jìn)行適當(dāng)修改：基礎(chǔ)飼料69.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）、豬油12%、蔗糖10%、蛋黃粉4%、膽固醇4%、膽酸鈉0.5%。

桑葉粉末由重慶畜牧科學(xué)院蠶業(yè)研所提供；桑葉生物堿為重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏重點實驗室自制，方法參照文獻(xiàn)[18]；采用硅鎢酸沉淀法[19]測得樣品中總生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為93.57%。

橄欖油、CCl4成都市科龍化工試劑廠；水飛薊賓（純度≥98%） 南京道斯夫生物科技有限公司；AST、ALT、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、總蛋白（total protein，TP）、白蛋白（albumin，ALB）、總膽紅素（total bilirubin，TBil）、直接膽紅素（direct bilirubin，DBil）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）、層黏連蛋白（laminin，LN）、IV型膠原（type IV collagen，IV-C）、III型前膠原（type III precollagen，PC-III）酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒 上海優(yōu)選生物科技有限公司；31050102W型組織包埋盒 江蘇世泰實驗器材有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ALPAAI-4LSC型高速離心機 德國CHRIST公司；DW-HL438型超低溫冰箱 合肥美菱股份有限公司；XW-80A型微型漩渦旋混儀 上海精科實業(yè)有限公司；Synergy H1型酶標(biāo)儀 美國基因有限公司；DHP-9082型恒溫培養(yǎng)箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；5880R型冷凍離心機 德國Eppendorf公司；EG1105H型石蠟切片機 德國徠卡公司；生物顯微鏡 日本OLYMPUS株式會社。

1.3 方法

1.3.1 實驗動物分組及處理

本實驗獲得西南大學(xué)實驗動物保護(hù)協(xié)會許可，小鼠按照西南大學(xué)實驗動物保護(hù)和使用規(guī)則飼養(yǎng)，室溫22～25 ℃，相對濕度40%～60%，12 h明暗交替（9∶00－21∶00），自由進(jìn)食飲水。60 只昆明種小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機分為6 組，分別為正常對照組、模型組、陽性藥物組、桑葉生物堿低、中、高劑量組，每組10 只。除正常對照組，其余各組小鼠均腹腔注射體積分?jǐn)?shù)10% CCl4橄欖油溶液（5 mL/kgmb），每隔1 d注射1 次，持續(xù)8 周，并在此期間給予高脂飼料，建立小鼠肝纖維化模型；正常對照組小鼠腹腔注射等量橄欖油，并給予基礎(chǔ)飼料。以正常對照組與造模小鼠之間血漿ALT、AST活力和肝纖維化4 項指標(biāo)差異顯著，且肝纖維化小鼠肝臟組織病變明顯、膠原沉積，判定造模成功。待造模成功后，分別以低（50 mg/kgmb）、中（100 mg/kgmb）、高（200 mg/kgmb）劑量桑葉生物堿溶液和陽性藥物水飛薊賓溶液（100 mg/kgmb）灌胃小鼠，正常對照組和模型組給予等量蒸餾水（10 mL/kgmb），每日1 次，連續(xù)灌胃45 d，同時喂飼基礎(chǔ)飼料。實驗期間觀察并記錄小鼠一般生長情況。

1.3.2 血脂、血漿肝功能相關(guān)指標(biāo)和肝纖維化標(biāo)志物水平測定

末次灌胃后，小鼠禁食不禁水16 h，各組小鼠在進(jìn)行取材前稱量并記錄體質(zhì)量。摘眼球取血，放于含肝素鈉的真空采血管中，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，收集上清液，于－80 ℃保存?zhèn)溆?。血漿AST、ALT、ALP、TP、ALB、TBil、DBil、TC、TG、HA、LN、IV-C、PC-III水平測定均按照試劑盒 說明書步驟進(jìn)行。

1.3.3 小鼠肝臟指數(shù)計算

采血完畢后，頸椎脫臼處死小鼠，快速取出肝臟，用冷生理鹽水漂洗除去表面血液，濾紙拭干，稱質(zhì)量，按下式計算肝臟指數(shù)[20]。

1.3.4 肝臟組織病理學(xué)觀察

取肝臟左葉浸泡于體積分?jǐn)?shù)10%甲醛溶液中，固定48 h，脫水，石蠟包埋，切片（厚度約為4 μm），蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 20.0軟件對結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著。采用Origin 8.6軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葉生物堿對肝纖維化小鼠一般生長情況的影響

實驗期間，正常對照組小鼠在飼養(yǎng)過程中狀態(tài)良好；模型組小鼠精神萎靡、行動遲緩、皮毛不光滑、腹部微隆、食欲減退并伴有不同程度的腹瀉；與模型組比較，陽性藥物組及桑葉生物堿各劑量組小鼠狀況均有所改善。

2.2 桑葉生物堿對肝纖維化小鼠體質(zhì)量和肝臟指數(shù)的影響

表1 桑葉生物堿對肝纖維化小鼠體質(zhì)量和肝臟指數(shù)的影響（ ＝10）Table 1 Effect of mulberry leaf alkaloids on body mass and liver index of mice with hepatic fifi brosis ( = 10)

在動物實驗中，臟器質(zhì)量和指數(shù)是藥物慢性實驗指定檢測項目，通過實驗動物的臟器質(zhì)量和臟器指數(shù)可大概確定臟器損傷或病變的性質(zhì)和程度[21]。由表1可知，與正常對照組相比，模型組小鼠體質(zhì)量顯著降低（P＜0.05），肝臟指數(shù)顯著增加（P＜0.05），表明CCl4聯(lián)合高脂飲食對小鼠體質(zhì)量增長產(chǎn)生了影響，對小鼠肝臟造成了一定的損傷。陽性藥物組和桑葉生物堿各劑量組小鼠體質(zhì)量雖呈現(xiàn)不同程度的增長，但與模型組無顯著差異（P＞0.05）；其中低劑量組與正常對照組之間無顯著差異（P＞0.05）。與模型組相比，陽性藥物組和桑葉生物堿各劑量組小鼠的肝臟指數(shù)均有所下降，其中陽性藥物組趨于正常，與正常對照組無顯著差異（P＞0.05）；桑葉生物堿高劑量組小鼠肝臟系數(shù)與模型組之間存在顯著差異（P＜0.05），與陽性藥物組之間無顯著差異（P＞0.05），但顯著高于正常對照組（P＜0.05）。結(jié)果表明，桑葉生物堿能改善肝損傷小鼠的體質(zhì)量和肝臟指數(shù)，但在實驗劑量與時間內(nèi)未能使之恢復(fù)到正常水平。

2.3 桑葉生物堿對肝纖維化小鼠血漿ALT、AST和ALP活力的影響

ALT、AST和ALP是反映肝毒性的重要指標(biāo)。正常情況下，機體ALT、AST主要分布于肝細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)肝細(xì)胞出現(xiàn)損傷或壞死時，肝細(xì)胞膜通透性增加，ALT、AST被釋放入血液，引起血液中ALT、AST含量上升，因此血液中ALT、AST含量的升高反映了肝臟損傷程度[22-23]。此外，ALP在正常情況下存在于骨骼中，由膽道系統(tǒng)排出；當(dāng)肝臟受到損傷時，ALP會反流入血液，從而使血液中ALP含量顯著升高[24]。

表2 桑葉生物堿對肝纖維化小鼠血漿ALT、AST和ALP活力的影響Table 2 Effect of mulberry leaf alkaloids on plasma ALT, AST and ALP activity of mice with hepatic fi brosis

由表2可知，與正常對照組相比，模型組小鼠血漿ALT、AST、ALP活力均顯著升高（P＜0.05），提示肝細(xì)胞受損，造模成功。與模型組比較，陽性藥物組及桑葉生物堿各劑量組小鼠血漿ALT、AST、ALP活力均有不同程度降低；灌胃陽性藥物水飛薊賓45 d后，小鼠血漿ALT、AST、ALP活力分別下降了63.19%、60.29%、46.89%；桑葉生物堿高劑量組小鼠血漿ALT、AST、ALP活力分別下降了60.60%、54.85%、49.72%，且桑葉生物堿中、高劑量組與陽性藥物組上述指標(biāo)無顯著差異（P＞0.05），但仍遠(yuǎn)高于正常對照組（P＜0.05）。結(jié)果表明，桑葉生物堿能有效降低CCl4聯(lián)合高脂飲食導(dǎo)致的肝損傷，但在實驗劑量和時間內(nèi)還不能使ALT、AST、ALP活力恢復(fù)到正常水平。

2.4 桑葉生物堿對小鼠肝纖維化程度的影響

CCl4會引起肝臟細(xì)胞外基質(zhì)過度增生與異常沉積，引起肝臟纖維化。HA、LN、PC-III、IV-C是反映肝纖維化程度的重要指標(biāo)，其中HA水平能較為靈敏地反映肝纖維量；LN水平反映了肝臟的損傷程度，是判斷有無活動性肝纖維的指標(biāo)之一；PC-III與肝纖維形成的活動密度相關(guān)，反映肝纖維合成狀況和炎癥活動性；IV-C是最早增生的纖維，能敏感地反映肝炎向肝纖維化發(fā)展的過程和程度，是肝纖維化早期診斷的良好指標(biāo)[25-26]。

表3 桑葉生物堿對肝纖維化小鼠血漿HA、LN、PC-III和IV-C質(zhì)量濃度的影響Table 3 Effect of mulberry leaf alkaloids on plasma HA, LN, PC-III and IV-C levels of mice with hepatic fifi brosis

由表3可知，與正常對照組比，模型組小鼠血漿肝纖維化標(biāo)志物HA、LN、PC-III、IV-C質(zhì)量濃度均顯著升高（P＜0.05），表明CCl4聯(lián)合高脂飲食誘導(dǎo)小鼠肝纖維化造模成功。與模型組比較，陽性藥物組與桑葉生物堿中、高劑量組小鼠血漿HA、LN、PC-III、IV-C質(zhì)量濃度均顯著下降（P＜0.05）；灌胃陽性藥物水飛薊賓45 d后，小鼠血漿HA、LN、PC-III、IV-C質(zhì)量濃度分別下降了18.06%、17.50%、20.82%、18.44%；桑葉生物堿高劑量組小鼠血漿HA、LN、PC-III、IV-C分別下降了12.01%、15.77%、17.55%、17.42%，其中LN、PC-III、IV-C質(zhì)量濃度與陽性藥物組無顯著差異（P＞0.05），但與正常對照組比差異顯著（P＜0.05）。此外，各指標(biāo)質(zhì)量濃度隨劑量增加整體呈下降趨勢，但無明顯量效關(guān)系。以上結(jié)果表明，桑葉生物堿能降低肝纖維化標(biāo)志物水平，對小鼠肝纖維化具有改善作用。

2.5 桑葉生物堿對肝纖維化小鼠血漿TP和ALB質(zhì)量濃度的影響

表4 桑葉生物堿對肝纖維化小鼠血漿TP和ALB質(zhì)量濃度的影響Table 4 Effect of mulberry leaf alkaloids on plasma TP and ALB concentrations of mice with hepatic fi brosis

TP包含ALB和球蛋白，主要來自肝臟的合成。當(dāng)肝細(xì)胞受損，蛋白質(zhì)在機體內(nèi)的合成、運輸和釋放受到影響，血液中蛋白質(zhì)含量會下降[5,27]。由表4可知，與正常對照組相比，模型組小鼠血漿TP、ALB質(zhì)量濃度均顯著降低（P＜0.05），說明造模過程中CCl4和高脂飲食的聯(lián)合作用造成了小鼠肝損傷，影響了肝臟蛋白質(zhì)的合成、運輸和釋放。與模型組相比，陽性藥物組與桑葉生物堿各劑量組小鼠血漿TP、ALB質(zhì)量濃度均顯著升高，其中，陽性藥物組小鼠血漿TP、ALB質(zhì)量濃度分別升高了26.36%、31.85%；桑葉生物堿高劑量組小鼠血漿TP、ALB質(zhì)量濃度分別升高了26.50%、27.75%，與陽性藥物組相比無顯著差異（P＞0.05），與正常對照組相比差異顯著（P＜0.05）。此外，TP、ALB質(zhì)量濃度隨劑量升高，但無明顯量效關(guān)系。以上結(jié)果表明，桑葉生物堿能提高肝纖維化小鼠肝臟TP、ALB質(zhì)量濃度，改善小鼠肝臟受損情況。

2.6 桑葉生物堿對肝纖維化小鼠血漿TBil和DBil濃度的影響

血液中膽紅素水平反映了肝細(xì)胞通過肝臟網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)對膽紅素進(jìn)行攝取、結(jié)合和排泄的能力。當(dāng)肝細(xì)胞受損時，肝臟對膽紅素的處理能力下降，血膽紅素水平升高[22]。由表5可知，與正常對照組比，模型組小鼠血漿TBil、DBil濃度均顯著升高（P＜0.05），說明造模過程中CCl4和高脂飲食的聯(lián)合作用造成了小鼠肝損傷，影響了肝細(xì)胞對膽紅素的處理能力。與模型組比較，陽性藥物組與桑葉生物堿各劑量組小鼠血漿TBil、DBil濃度均顯著下降（P＜0.05）。陽性藥物組小鼠血漿TBil、DBil濃度分別下降了45.46%、74.91%；桑葉生物堿高劑量組小鼠血漿TBil、DBil濃度分別下降了35.56%、74.50%，與陽性藥物組相比無顯著差異（P＞0.05），與正常對照組相比差異顯著（P＜0.05）。此外，桑葉生物堿各劑量組之間無明顯量效關(guān)系。以上結(jié)果表明，桑葉生物堿能調(diào)節(jié)肝損傷小鼠血漿TBil和DBil濃度，小鼠肝臟對膽紅素的處理能力有所恢復(fù)。

表5 桑葉生物堿對肝纖維化小鼠血漿TBil和DBil濃度的影響Table 5 Effect of mulberry leaf alkaloids on plasma TBil and DBil concentrations of mice with hepatic fi brosis

2.7 桑葉生物堿對肝纖維化小鼠血漿TC和TG含量的影響

表6 桑葉生物堿對肝纖維化小鼠血漿TC和TG含量的影響Table 6 Effect of mulberry leaf alkaloids on plasma TC and TG contents of mice with hepatic fi brosis

CCl4和長期高脂飲食均會引起機體脂質(zhì)代謝紊亂，引起TC、TG含量的升高[28-29]。由表6可知，與正常對照組比較，模型組小鼠血漿TC、TG含量均顯著升高（P＜0.05），表明小鼠脂代謝出現(xiàn)異常。與模型組比較，陽性藥物組（TG含量除外）與桑葉生物堿各劑量組小鼠血漿TC、TG含量均顯著下降（P＜0.05）。陽性藥物組TC、TG含量分別下降了32.44%、20.99%；桑葉生物堿高劑量組TC、TG含量分別下降了28.67%、23.76%，與陽性藥物組無顯著差異（P＞0.05），并且桑葉生物堿高劑量組TC、TG含量均顯著高于正常對照組（P＜0.05）。此外，TC、TG含量隨桑葉生物堿灌胃劑量增加而減少，但無明顯量效關(guān)系。以上結(jié)果表明，桑葉生物堿對CCl4聯(lián)合高脂飲食引起的小鼠血脂異常具有改善作用。

2.8 桑葉生物堿對小鼠肝組織病理變化的影響

小鼠處死后取肝臟進(jìn)行外觀觀察發(fā)現(xiàn)，正常對照組小鼠肝臟表面光滑、紅潤、質(zhì)地柔軟、邊緣鋒利；模型組小鼠肝臟表面粗糙有顆粒狀、邊緣圓鈍，略帶油膩感，體積偏大。

圖1 HE染色觀察小鼠肝組織病理切片（×200）Fig. 1 Histopathological section of liver tissue of mice in each group (× 200)

由圖1可知，正常對照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞排列整齊，肝竇正常，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清晰，無膠原纖維沉積；模型組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)模糊，胞質(zhì)疏松，胞核體積變小，肝細(xì)胞排列紊亂，纖維增生明顯；與模型組比，陽性藥物組和桑葉生物堿各劑量組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)相對清晰，肝細(xì)胞排列較為整齊，膠原沉積減少，肝損傷明顯減輕。

3 討 論

CCl4是一種肝毒性化學(xué)物質(zhì)，是肝纖維化模型的經(jīng)典誘導(dǎo)劑[30]。CCl4被機體吸收后，在肝內(nèi)經(jīng)微粒體細(xì)胞色素氧化酶P450激活為CCl3·和Cl·[31]，這兩種自由基可以與生物大分子結(jié)合，使膜完整性喪失，肝細(xì)胞壞死和膠原沉積，導(dǎo)致肝纖維化[32]。用高濃度CCl4進(jìn)行肝纖維化造模，動物死亡率高；而長期高脂飲食雖可引起肝臟脂肪變性，但很難進(jìn)展到肝纖維化階段。采用腹腔注射低濃度CCl4聯(lián)合高脂飲食的方式進(jìn)行肝纖維化造模不但可以加速肝臟損傷，且模型穩(wěn)定[33-34]。

肝纖維化屬可逆性病變[35]，延緩或逆轉(zhuǎn)肝纖維化的發(fā)生是治愈大多數(shù)慢性肝病的關(guān)鍵。大量研究表明，天然活性成分在防治肝纖維化方面具有一定優(yōu)勢。本實驗室前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，桑葉生物堿可改善高脂飲食誘導(dǎo)小鼠的肝損傷[17]，本實驗進(jìn)一步探討了桑葉生物堿抗肝纖維化的效果。本研究采用腹腔注射體積分?jǐn)?shù)10% CCl4橄欖油溶液聯(lián)合高脂飲食喂飼小鼠構(gòu)建肝纖維化小鼠模型，結(jié)果表明，CCl4聯(lián)合高脂飲食導(dǎo)致小鼠肝臟指數(shù)增大，血漿ALT、AST、ALP活力，HA、LN、PC-III、IV-C質(zhì)量濃度，TBil、DBil濃度和TC、TG含量顯著升高，同時引起小鼠體質(zhì)量和血漿TP、ALB質(zhì)量濃度顯著下降，表明在CCl4聯(lián)合高脂飲食誘導(dǎo)下小鼠肝臟受損，肝臟出現(xiàn)嚴(yán)重病變，血漿肝纖維化標(biāo)志物質(zhì)量濃度顯著升高，蛋白質(zhì)合成、運輸和釋放受阻，肝臟對膽紅素處理能力下降，血脂出現(xiàn)異常。在灌胃不同劑量桑葉生物堿45 d后，上述指標(biāo)均不同程度地有所改善。本實驗中桑葉生物堿低劑量組小鼠體質(zhì)量恢復(fù)到正常水平，而中、高劑量組小鼠體質(zhì)量未恢復(fù)到正常水平，這可能是由于灌胃桑葉生物堿劑量增加，其中具有降脂作用的特征成分——1-脫氧野尻霉素[36]含量也相應(yīng)增加，進(jìn)而發(fā)揮了控制小鼠體質(zhì)量增加、調(diào)節(jié)血漿TC、TG含量的作用。此外，隨著桑葉生物堿灌胃劑量增加，小鼠肝臟指數(shù)、血漿轉(zhuǎn)氨酶活力、肝纖維化4 項指標(biāo)、膽紅素濃度顯著降低，血漿TP、ALB質(zhì)量濃度顯著升高，其中高劑量桑葉生物堿的作用效果與藥物水飛薊賓無顯著差異；但在實驗劑量和時間內(nèi)，不同劑量桑葉生物堿均未能使小鼠肝纖維化恢復(fù)正至常水平。該實驗僅從基礎(chǔ)指標(biāo)改變上證明了桑葉生物堿對肝纖維化的改善作用，其在機體內(nèi)的具體調(diào)節(jié)機制還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，桑葉生物堿對CCl4聯(lián)合高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化有較好的改善作用，且在本實驗劑量與灌胃時間范圍內(nèi)與藥物水飛薊賓作用效果相近。該研究結(jié)果表明，桑葉生物堿具有抗肝臟纖維化的潛力，可為桑葉在保肝食品方面的開發(fā)利用提供理論參考。