腸膜明串珠菌素mesenterocin ZLG85分子結(jié)構(gòu)及對(duì)傷寒沙門氏菌的抗菌機(jī)理

高玉榮，李大鵬，張鳳琴，宋俊梅

（巢湖學(xué)院化學(xué)與材料工程學(xué)院，安徽 合肥 238000）

隨著人們對(duì)食品安全的日益重視，開(kāi)發(fā)新型無(wú)毒的生物防腐劑成為食品工業(yè)的重要發(fā)展方向之一[1-2]。乳酸菌細(xì)菌素是由乳酸菌通過(guò)代謝作用產(chǎn)生的對(duì)其他微生物具有抑制或殺滅作用的多肽或蛋白質(zhì)，是目前國(guó)內(nèi)外公認(rèn)安全的生物防腐劑[3-5]。目前廣泛應(yīng)用的乳酸菌細(xì)菌素是乳酸鏈球菌素，但由于其抗菌譜窄（只對(duì)部分革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌有抗菌作用，對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌無(wú)抗菌作用），適用的pH值范圍較窄，限制了其在食品中的應(yīng)用[6-7]。因此新型廣譜乳酸菌細(xì)菌素的研究和開(kāi)發(fā)成為目前該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

乳酸菌細(xì)菌素一般只對(duì)同屬內(nèi)或親緣關(guān)系較近的菌株有抑制作用，目前乳酸菌細(xì)菌素的抗菌機(jī)理是以革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌為模式菌株，缺少對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌抗菌機(jī)理的研究[8-12]；除了乳酸鏈球菌素外，對(duì)其他乳酸菌細(xì)菌素抗菌機(jī)理的研究并不系統(tǒng)，這使得新型廣譜乳酸菌細(xì)菌素的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用缺少理論支持。

國(guó)內(nèi)外普遍應(yīng)用于泡菜等蔬菜發(fā)酵中的腸膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroides是公認(rèn)安全的乳酸菌發(fā)酵劑[13]。目前國(guó)外已分離出少數(shù)產(chǎn)細(xì)菌素的Leuconostoc mesenteroides，如Héchard等[14]從羊奶中分離出一株Leuconostoc mesenteroides Y105，產(chǎn)生的細(xì)菌素mesentericin Y105分子質(zhì)量為2.5～3.0 kDa；Maria等[15]從肉制品中篩選出一株Leuconostoc mesenteroides，產(chǎn)生的細(xì)菌素mesentericin B-TA33a分子質(zhì)量為3.466 kDa。但目前發(fā)現(xiàn)的這些由Leuconostoc mesenteroides產(chǎn)生的細(xì)菌素只能抑制革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的生長(zhǎng)。

本課題組前期從傳統(tǒng)發(fā)酵酸黃瓜中分離到一株產(chǎn)細(xì)菌素的腸膜明串珠菌Leuconstoc mesenteroides subsp. mesenteroides ZLG85，研究發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)生的細(xì)菌素mesenterocin ZLG85是一種新型廣譜的乳酸菌細(xì)菌素，不僅對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌有抗菌作用，也對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌具有較強(qiáng)的抗菌作用，具有作為新型生物防腐劑的應(yīng)用前景[16-17]。本研究擬以前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的新型廣譜的細(xì)菌素mesenterocin ZLG85為對(duì)象，通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatograph-mass spectrometer，LC-MS）、Edman降解法及圓二色光譜（circular dichroism，CD）對(duì)細(xì)菌素mesenterocin ZLG85的分子質(zhì)量、氨基酸序列及二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，采用ProParam tool軟件對(duì)細(xì)菌素的理化性質(zhì)進(jìn)行分析；以傷寒沙門氏菌為模式菌株，通過(guò)對(duì)紫外吸收物質(zhì)滲漏、轉(zhuǎn)膜電勢(shì)及細(xì)胞膜通透性的影響來(lái)探討細(xì)菌素mesenterocin ZLG85對(duì)傷寒沙門氏菌的抗菌機(jī)理，以期為新型廣譜乳酸菌細(xì)菌素的研究和開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

腸膜明串珠菌ZLG85分離自發(fā)酵酸黃瓜，美國(guó)國(guó)家生物信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）菌株編號(hào)為KF746910[16]。

傷寒沙門氏菌ATCC14028購(gòu)買于中科院微生物研究所。

MRS培養(yǎng)基：魚(yú)肉蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、牛肉膏10 g/L、葡萄糖20 g/L、檸檬酸銨2 g/L、三水乙酸鈉5 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、結(jié)晶硫酸鎂0.58 g/L、硫酸錳0.25 g/L、吐溫-80 1 mL、碳酸鈣（粉）10 g/L、蒸餾水1 L，pH 6.5，121 ℃濕熱滅菌20 min。固體培養(yǎng)基則在此基礎(chǔ)上加入20 g/L的瓊脂。

營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：魚(yú)肉蛋白胨20 g/L、酵母浸粉6 g/L、氯化鈉5 g/L、磷酸氫二鉀2.5 g/L、葡萄糖2.5 g/L、蒸餾水1 L，pH 6.5，121 ℃濕熱滅菌20 min。半固體（固體）培養(yǎng)基則在此基礎(chǔ)上加入7.5 g/L（20 g/L）的瓊脂。

1.2 儀器與設(shè)備

ABI 491型蛋白測(cè)序儀 美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；TU-1810型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；LS55熒光分光光度計(jì) 美國(guó)PerkinElmer公司；EPICS-XL流式細(xì)胞儀 美國(guó)BD公司；J500型CD儀 日本JASCO公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化及液體培養(yǎng)

挑取腸膜明串珠菌ZLG85斜面保藏菌種1～2 環(huán)，接種于MRS固體斜面培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)24 h。

挑取活化的斜面菌種1～2 環(huán)接種于裝有50 mL MRS液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30 ℃、100 r/min搖瓶培養(yǎng)24 h。

1.3.2 細(xì)菌素分離純化

將腸膜明串珠菌ZLG85的培養(yǎng)液，按照Gao Yurong等[18]的方法進(jìn)行細(xì)菌素的分離純化，其中凝膠層析采用Sephadex G25進(jìn)行，每步純化后計(jì)算各步驟的總活力、比活力、蛋白質(zhì)量濃度、產(chǎn)量和純化倍數(shù)。其中：總活力（AU）是純化后所獲得樣品中細(xì)菌素的抗菌活力，是溶液中每毫升抗菌活力（AU/mL）與體積（mL）的乘積；比活力是樣品中每毫克蛋白所含的細(xì)菌素的活力單位，為一定體積純化樣品中抗菌活力（AU）與蛋白質(zhì)量（mg）之比；蛋白質(zhì)量濃度為1 mL細(xì)菌素樣品中的蛋白質(zhì)量（mg）。產(chǎn)量為純化后的總活力與無(wú)細(xì)胞發(fā)酵液的總活力之比；純化倍數(shù)為純化后的細(xì)菌素樣品的比活力與無(wú)細(xì)胞發(fā)酵液的比活力之比。

1.3.3 細(xì)菌素分子質(zhì)量及結(jié)構(gòu)分析

1.3.3.1 細(xì)菌素Tris-Tricine SDS-PAGE及LC-MS/MS分析

采用Tris-Tricine十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)16.5%，濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%。純化的細(xì)菌素和低分子質(zhì)量Marker同時(shí)在140 V電泳4 h。結(jié)束后，將膠切成兩半，帶有Marker的一半采用考馬斯亮藍(lán)染色脫色，另一半用無(wú)菌蒸餾水漂洗1 h后，小心地鋪在接有指示菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)24 h后與染色的半塊膠對(duì)比，找到具有抗菌活性的條帶，即細(xì)菌素條帶。將此條帶轉(zhuǎn)印在聚偏氟乙烯膜上，采用考馬斯亮藍(lán)染色。將切割的細(xì)菌素條帶洗脫后進(jìn)行LC-MS分析[19-20]。

1.3.3.2 細(xì)菌素氨基酸序列分析

將條帶切割后，用ABI 491型蛋白測(cè)序儀對(duì)細(xì)菌素進(jìn)行測(cè)序。采用Clustal Omega program將細(xì)菌素多肽序列與NCBI（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）數(shù)據(jù)庫(kù)中的細(xì)菌素相比較[21]。

1.3.3.3 細(xì)菌素理化性質(zhì)分析

使用ProParam tool（http://www.expasy.ch/tools/protparam.html）軟件對(duì)細(xì)菌素的理化性質(zhì)進(jìn)行分析[22]。

1.3.3.4 細(xì)菌素CD分析

將細(xì)菌素溶于10 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）中，細(xì)菌素濃度為100 μmol/L，采用J500型CD儀在室溫下測(cè)定，掃描范圍180～260 nm，樣品池光徑1 mm，CD數(shù)據(jù)以平均殘基摩爾橢圓度（[θ]）表示，CD譜圖為4 次累加的平均結(jié)果。以設(shè)備自帶的軟件對(duì)CD實(shí)測(cè)譜圖進(jìn)行平滑處理，使用Dichro Web（http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/home.shtml）進(jìn)行數(shù)據(jù)在線處理分析[23]。

1.3.4 細(xì)菌素抗菌機(jī)理分析

1.3.4.1 細(xì)菌素對(duì)傷寒沙門氏菌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

收集培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的傷寒沙門氏菌細(xì)胞，用無(wú)菌水調(diào)整細(xì)胞懸浮液濃度為107CFU/mL，向其中加入制備的細(xì)菌素樣品，使其終抗菌活力分別為40、80、160、320 AU/mL，30 ℃恒溫靜置培養(yǎng)16 h，以不添加細(xì)菌素的樣品為空白對(duì)照，采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定傷寒沙門氏菌的活菌數(shù)[24]。

1.3.4.2 細(xì)菌素對(duì)紫外吸收物質(zhì)滲漏的影響

將傷寒沙門氏菌的過(guò)夜培養(yǎng)物6 000×g離心15 min，收集菌體，細(xì)胞用無(wú)菌水洗滌兩次，并重新懸浮在無(wú)菌水中，制成細(xì)胞懸浮液。在細(xì)胞懸浮液中添加純化的細(xì)菌素mesenterocin ZLG85，使細(xì)菌素終抗菌活力為160 AU/mL，然后在36 ℃處理0、20、40、60、80 min和100 min。用0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾后，采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)分別在260 nm和280 nm波長(zhǎng)處測(cè)定無(wú)細(xì)胞上清液的光密度值，以用蒸餾水處理的樣品為空白對(duì)照。用處理一段時(shí)間后的上清液光密度值與初始光密度值的差值（ΔOD）來(lái)表示紫外吸收物質(zhì)的滲漏程度[25]。

1.3.4.3 細(xì)菌素對(duì)轉(zhuǎn)膜電勢(shì)的影響

采用3,3’-二丙基-二碳菁碘化物（3,3’-dipropylthi adicarbocyanine iodide，DISC3(5)）作為檢測(cè)轉(zhuǎn)膜電勢(shì)（Δφ）的熒光探針。離心收集傷寒沙門氏菌細(xì)胞，用磷酸鹽-4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖溶液（0.002 5 mol/L、pH 7.0）清洗，重新懸浮在相同的緩沖溶液中并添加0.1 m o l/L的葡萄糖。在細(xì)胞懸浮液中添加0.4 μmol/L的DISC3(5)混合后，分別添加0.1 μmol/L尼日利亞菌素、1 μmol/L纈氨霉素和終抗菌活力160 AU/mL的細(xì)菌素來(lái)測(cè)定細(xì)胞膜電勢(shì)的變化。以不添加任何物質(zhì)的細(xì)胞懸浮液作為空白對(duì)照，采用熒光分光光度計(jì)來(lái)測(cè)定熒光值，激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別設(shè)定為622 nm和670 nm[9]。

1.3.4.4 流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞通透性

處于對(duì)數(shù)期的10 mL OD600nm為0.8～1.0的傷寒沙門氏菌，6 000×g離心15 min收集菌體，用pH 6.5無(wú)菌磷酸緩沖溶液清洗兩次。用終抗菌活力160 AU/mL的mesenterocin ZLG85于37 ℃分別處理30 min和60 min后，6 000×g離心15 min收集菌體。以菌體懸浮在不含細(xì)菌素的純凈水中作為空白對(duì)照，以碘化丙啶（propidium iodide，PI）為染色劑，用流式細(xì)胞儀分析實(shí)驗(yàn)樣品與對(duì)照樣品的PI熒光強(qiáng)度[26]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，每次兩個(gè)重復(fù)樣品。采用SAS 8.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌素分離純化及Tris-Tricine SDS-PAGE分析結(jié)果

表1 細(xì)菌素mesenterocin ZLG85的純化Table 1 Purification steps of mesenterocin ZLG85

由表1可以看出，最初的無(wú)細(xì)胞上清液經(jīng)過(guò)乙醇抽提后，產(chǎn)量為90.2%，純化倍數(shù)達(dá)到10.87，說(shuō)明乙醇提取細(xì)菌素產(chǎn)量損失較小，且純度有了較大的提高，適合細(xì)菌素的粗提。經(jīng)過(guò)Sephadex G25凝膠層析，細(xì)菌素的損失較大，產(chǎn)量為57.8%，但純化倍數(shù)有較大幅度提高，純化倍數(shù)達(dá)25.37。經(jīng)過(guò)Sp-FF快速流陽(yáng)離子交換柱層析后，細(xì)菌素產(chǎn)量下降為42.6%，但純化倍數(shù)提高到52.10，比活力提高到5 775.28 AU/mg，可達(dá)到細(xì)菌素純化的要求。

從純化后的Tris-Tricine SDS-PAGE（圖1）分析可以看出，在2.5 kDa處出現(xiàn)明顯單一蛋白條帶，而且電泳后單一條帶對(duì)指示菌有明顯的抑制作用，形成了清晰的抑菌條帶，表明了2.5 kDa的條帶為抗菌肽，即mesenterocin ZLG85。

圖1 細(xì)菌素mesenterocin ZLG85的Tris-Tricine SDS-PAGEFig. 1 Tris-Tricine sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis of mesenterocin ZLG85

2.2 細(xì)菌素結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

2.2.1 Mesenterocin ZLG85的LC-MS分析結(jié)果

圖2 細(xì)菌素mesenterocinZLG85樣品液相色譜圖Fig. 2 Liquid chromatogram of mesenterocin ZLG85

圖3 細(xì)菌素mesenterocin ZLG85質(zhì)譜圖Fig. 3 Mass spectrum of mesenterocin ZLG85

將細(xì)菌素mesenterocin ZLG85轉(zhuǎn)膜純化后進(jìn)行了LC-MS分析，液相色譜圖（圖2）分析結(jié)果表明分離純化后細(xì)菌素mesenterocin ZLG85的純度為98.23%，質(zhì)譜圖（圖3）結(jié)果表明細(xì)菌素mesenterocin ZLG85的準(zhǔn)確分子質(zhì)量為2 522.5 Da。

2.2.2 Mesenterocin ZLG85的氨基酸序列

采用Edman降解法，測(cè)定細(xì)菌素mesenterocin ZLG85的氨基酸序列為KYYGNGVGGCSGAKNNKGCWGWKS。從數(shù)據(jù)庫(kù)http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.Cgi中搜索，沒(méi)有得到與mesenterocin ZLG85相同序列的細(xì)菌素。mesenterocin ZLG85與divercin V41（CAA11804.1）的同源性為57%；與enterocin CRL35（AAQ95741.1）的同源性為58%；與mesentericin Y105（AAB25127.1）和Chain A（1CW6_A）同源性為67%。采用Clustal Omega program（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）進(jìn)行細(xì)菌素序列的同源性分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。由Leu. mesenteroides subsp. mesenteroides ZLG85產(chǎn)生的細(xì)菌素mesenterocin ZLG85是一種新型廣譜細(xì)菌素。

圖4 采用Clustal Omega軟件分析mesenterocinZLG85與其他細(xì)菌素的同源性Fig. 4 Alignment of amino acid sequences of mesenterocin ZLG85 with those of other reported bacteriocins using Clustal Omega program

2.2.3 Mesenterocin ZLG85的物理化學(xué)特性

在線軟件ProParam tool分析結(jié)果表明，細(xì)菌素mesenterocin ZLG85的氨基酸數(shù)為24；理論分子質(zhì)量為2 521.81 Da；理論pI值為9.51；負(fù)電荷殘基總數(shù)為0，正電荷殘基總數(shù)為4；原子總數(shù)為338；脂肪氨基酸指數(shù)16.25，總平均親水性為－0.996；不穩(wěn)定系數(shù)為16.47，根據(jù)多肽不穩(wěn)定系數(shù)大于40則不穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)可知該多肽是穩(wěn)定的。

前期實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)菌素mesenterocin ZLG85的穩(wěn)定性進(jìn)行研究的結(jié)果表明，細(xì)菌素mesenterocin ZLG85具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，pH 2.0～10.0范圍內(nèi)，細(xì)菌素相對(duì)抗菌活性均在80%以上；121℃處理30 min后相對(duì)抗菌活性仍為93.77%。這與在線軟件分析結(jié)果相同。預(yù)測(cè)分子質(zhì)量（2 521.81 Da）與實(shí)際分子質(zhì)量（2 522.5 Da）誤差為0.28%，這些結(jié)果也說(shuō)明在線軟件ProParam tool進(jìn)行細(xì)菌素的理化性質(zhì)預(yù)測(cè)具有很高的準(zhǔn)確性。

2.2.4 Mesenterocin ZLG85的 CD分析結(jié)果

圖5 細(xì)菌素mesenterocin ZLG85的CD圖Fig. 5 CD spectrogram of mesenterocin ZLG85

表2 細(xì)菌素mesenterocin ZLG85二級(jí)結(jié)構(gòu)Table 2 Secondary structure composition of mesenterocin ZLG85

圖5為用CD儀自帶的軟件進(jìn)行平滑處理獲得的CD圖，表2為使用Dichro Web對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行在線分析得到細(xì)菌素mesenterocin ZLG85的二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量。由圖5和表2可以看出，細(xì)菌素mesenterocin ZLG85的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為反平行結(jié)構(gòu)、β-折疊和無(wú)規(guī)卷曲，分別為32.70%、20.70%和36.40%。

2.3 Mesenterocin ZLG85對(duì)傷寒沙門氏菌的抗菌機(jī)理

2.3.1 Mesenterocin ZLG85對(duì)傷寒沙門氏菌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

圖6 Mesenterocin ZLG85對(duì)傷寒沙門氏菌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Fig. 6 Effect of mesenterocin ZLG85 on the growth of Salmonella typhi

由圖6可以看出，不添加細(xì)菌素的傷寒沙門氏菌，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，活菌數(shù)顯著增加。當(dāng)細(xì)菌素mesenterocin ZLG85抗菌活力為40 AU/mL時(shí)，傷寒沙門氏菌活菌數(shù)沒(méi)有顯著增加（P＞0.05），起到了抑制傷寒沙門氏菌生長(zhǎng)的作用；當(dāng)細(xì)菌素抗菌活力為80 AU/mL時(shí)，處理20 h后傷寒沙門氏菌活菌數(shù)顯著下降（P＜0.05），但下降值為1.6，致死率小于99%；當(dāng)細(xì)菌素抗菌活力為160 AU/mL時(shí)，處理20 h后傷寒沙門氏菌活菌數(shù)顯著下降（P＜0.05），下降值為4.1，致死率大于99.99%，結(jié)果表明160 AU/mL的細(xì)菌素對(duì)傷寒沙門氏菌表現(xiàn)為殺菌作用。

2.3.2 Mesenterocin ZLG85對(duì)紫外吸收物質(zhì)滲漏的影響

圖7 Mesenterocin ZLG85對(duì)傷寒沙門氏菌在260 nm and 280 nm波長(zhǎng)處紫外吸收物質(zhì)滲漏的影響Fig. 7 Effect of mesenterocin ZLG85 on the leakage of UV-absorbing materials at 260 and 280 nm from Salmonella typhi cells

核酸和蛋白質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)分別為260 nm和280 nm，因此常用這兩個(gè)波長(zhǎng)下的光密度值表征核酸和蛋白的濃度。由圖7可以看出，當(dāng)用mesenterocin ZLG85處理沙門氏菌40 min后，在260 nm和280 nm波長(zhǎng)處的ΔOD值分別提高到0.469和0.495，而空白樣品僅提高到0.018和0.034。結(jié)果表明mesenterocin ZLG85導(dǎo)致了大量260 nm和280 nm波長(zhǎng)處紫外吸收物質(zhì)的滲漏。

2.3.3 Mesenterocin ZLG85對(duì)Δφ的影響

圖8 Mesenterocin ZLG85處理傷寒沙門氏菌后DISC3(5))熒光強(qiáng)度Fig. 8 Fluorescence absorption values of DISC3(5) in Salmonella typhi treated with mesenterocin ZLG85

采用熒光探針DISC3(5)來(lái)測(cè)定傷寒沙門氏菌的轉(zhuǎn)膜電勢(shì)Δφ。如果傷寒沙門氏菌細(xì)胞膜被破壞，將導(dǎo)致轉(zhuǎn)膜電勢(shì)Δφ的消散，使DISC3(5)釋放到培養(yǎng)基中，引起培養(yǎng)液中熒光強(qiáng)度的提高。添加valinomycin引起傷寒沙門氏菌轉(zhuǎn)膜電勢(shì)Δφ的消散。但添加nigericin后，傷寒沙門氏菌細(xì)胞能維持轉(zhuǎn)膜電勢(shì)。在添加細(xì)菌素mesenterocin ZLG85 10 min后，引起了傷寒沙門氏菌轉(zhuǎn)膜電勢(shì)快速和完全的耗散，耗散速率與valinomycin相當(dāng)。這些結(jié)果表明細(xì)菌素mesenterocin ZLG85引起了傷寒沙門氏菌細(xì)胞轉(zhuǎn)膜電勢(shì)的耗散。這種變化與Moll等[27]報(bào)道的II類細(xì)菌素plantaricins EF和plantaricins JK對(duì)Lactobacillus plantarum965的作用方式相似。

2.3.4 Mesenterocin ZLG85對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響

PI能與DNA結(jié)合產(chǎn)生熒光，用PI染色細(xì)胞則染料能通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA結(jié)合。MnX是平均熒光道數(shù)，MnX越大，表明進(jìn)入細(xì)胞的PI越多，與遺傳物質(zhì)DNA結(jié)合后熒光強(qiáng)度越大，細(xì)胞膜的損傷越大，細(xì)胞的通透性越高。由圖9可以看出，與不用細(xì)菌素作用的對(duì)照樣品相比，用160 AU/mL的細(xì)菌素mesenterocin ZLG85分別作用傷寒沙門氏菌30 min和60 min后，MnX從2.86分別提高到5.49和7.12。因此，用160 AU/mL的細(xì)菌素mesenterocin ZLG85作用沙門氏菌導(dǎo)致其細(xì)胞膜通透性的增大，形成了較大的孔隙。

圖9 Mesenterocin ZLG85作用傷寒沙門氏菌流式細(xì)胞儀分析結(jié)果Fig. 9 Flow cytometry analysis of Salmonella typhi treated with mesenterocin ZLG85

3 討 論

Mesenterocin ZLG85是從發(fā)酵黃瓜中分離出的腸膜明串珠菌Leuconstoc mesenteroides subsp.Mesenteroides ZLG85產(chǎn)生的細(xì)菌素，不僅能抑制革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，也能抑制某些革蘭氏陰性細(xì)菌，具有廣譜的抗菌活性[16-17]。本研究首先對(duì)細(xì)菌素進(jìn)行了分離純化，并采用LC-MS測(cè)定其分子質(zhì)量為2 522.5 Da；通過(guò)Edman降解法測(cè)定其氨基酸序列為KYYGNGVGGCSGAKNNKGCWGWKS。在數(shù)據(jù)庫(kù)http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.Cgi中未搜索到與之序列相同的細(xì)菌素，采用在線軟件C l u s t a l Omega program（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）進(jìn)行細(xì)菌素序列的同源性分析，結(jié)果表明腸膜明串珠菌素mesenterocin ZLG85與mesentericin Y105（AAB25127.1）和Chain A（1CW6_A）的同源性最高，為67%，是一種新型細(xì)菌素。采用CD對(duì)腸膜明串珠菌素mesenterocin ZLG85二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析，發(fā)現(xiàn)主要結(jié)構(gòu)為反平行結(jié)構(gòu)、β-折疊和無(wú)規(guī)卷曲。采用ProParam tool軟件分析細(xì)菌素mesenterocin ZLG85的理論P(yáng)I值為9.51，且具有穩(wěn)定性。

此外，實(shí)驗(yàn)以傷寒沙門氏菌為模式菌株，采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)、熒光分光光度計(jì)和流式細(xì)胞儀，通過(guò)對(duì)紫外吸收物質(zhì)滲漏、轉(zhuǎn)膜電勢(shì)及細(xì)胞膜通透性的影響探討腸膜明串珠菌素mesenterocin ZLG85對(duì)革蘭氏陰性菌的抗菌機(jī)理。結(jié)果表明，腸膜明串珠菌素mesenterocin ZLG85的主要作用部位是在目標(biāo)菌的細(xì)胞膜上，其對(duì)傷寒沙門氏菌的抗菌機(jī)理是導(dǎo)致沙門氏菌在260 nm和280 nm波長(zhǎng)處紫外吸收物質(zhì)的大量滲漏和轉(zhuǎn)膜電勢(shì)Δφ的消散，并導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增大，形成孔洞，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。腸膜明串珠菌素mesenterocin ZLG85的這種作用機(jī)制與細(xì)菌素plantaricins EF和plantaricins JK[28]、bacteriocins ST194BZ和ST23LD[28]以及pentocin 31-1[29]對(duì)敏感菌的作用機(jī)制一致。

腸膜明串珠菌素mesenterocin ZLG85不僅對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌有抑菌作用，而且對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌也有抑菌作用。細(xì)菌素作用的靶位點(diǎn)是細(xì)胞質(zhì)膜，而革蘭氏陰性菌的細(xì)胞外膜作為屏障阻止細(xì)菌素對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜發(fā)揮抑菌作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明腸膜明串珠菌素mesenterocin ZLG85最終也可作用于傷寒沙門氏菌的細(xì)胞膜，引起膜的穿孔作用。在線軟件ProParam tool分析mesenterocin ZLG85是一種帶正電荷的抗菌肽，對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌的作用方式符合細(xì)胞膜損傷機(jī)理的假設(shè)[30]。細(xì)菌素mesenterocin ZLG85可能是通過(guò)靜電作用，作用于革蘭氏陰性細(xì)菌傷寒沙門氏菌細(xì)胞壁表面脂多糖的陰離子磷脂和磷酸基團(tuán)，從而吸附到傷寒沙門氏菌細(xì)菌的表面，進(jìn)而穿過(guò)細(xì)胞壁與細(xì)胞膜結(jié)合。Mesenterocin ZLG85疏水端可借助分子中連接結(jié)構(gòu)的柔性插入到傷寒沙門氏菌的細(xì)胞膜中，并牽引其進(jìn)入細(xì)胞膜，擾亂膜上脂質(zhì)及蛋白質(zhì)的排列秩序，多個(gè)細(xì)菌素聚合形成跨膜離子通道，導(dǎo)致大分子物質(zhì)的流失，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。