茶樹白化突變研究進(jìn)展

劉丁丁，梅菊芬，王君雅，湯榕津，陳亮，馬春雷*

1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所國(guó)家茶樹改良中心 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部茶樹生物學(xué)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，310008；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，100081；3.江蘇省茶葉研究所 江蘇省茶樹種質(zhì)資源圃，214063

茶樹起源于我國(guó)西南地區(qū)，作為一種多年生木本經(jīng)濟(jì)作物，在世界范圍內(nèi)廣泛種植[1-2]。隨著茶樹栽培和選育技術(shù)的發(fā)展，育種者們發(fā)掘和培育了許多優(yōu)良的茶樹品種，其中白化茶樹品種加工而成的茶葉因具有較高的氨基酸含量和優(yōu)質(zhì)的外形在市場(chǎng)上廣受歡迎。我國(guó)自唐朝起就有對(duì)白化茶的介紹，歷史上記載的描述白化茶樹的史料有許多，如唐朝陸羽《茶經(jīng)》“七之事”中記載“永嘉圖經(jīng)，永嘉縣東三百里有白茶山”；北宋宋子安《東溪試茶錄》中記載“茶之名有七，一曰白葉茶，民間大重，出于近歲，園焙時(shí)有之，地下以山川遠(yuǎn)近，發(fā)不以社之先后。芽發(fā)如紙，民間以為茶瑞”。1864年張星煥《皖游紀(jì)聞》中記載“蘭生言，石埭某山近日間產(chǎn)白茶。其味絕殊，但不可多得，或千百株中偶有一株變白，或今年白，明年仍可復(fù)原色，土人以為瑞茶，得則珍藏之”；而產(chǎn)于慧苑巖火焰峰下的白雞冠是延續(xù)至今的適制烏龍茶的白化茶樹資源[3]?，F(xiàn)代對(duì)白化茶樹種質(zhì)資源的研究，要追溯到上世紀(jì)七八十年代，研究者最初主要從白葉1號(hào)組織結(jié)構(gòu)、生理生化等角度開展白化茶樹資源的相關(guān)研究；近十幾年，隨著組學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，有大量利用轉(zhuǎn)錄組、代謝組、蛋白質(zhì)組等技術(shù)對(duì)這一表型進(jìn)行研究的文章發(fā)表。本文從白化茶樹資源的分類、生理生化特征、分子機(jī)制等方面對(duì)相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，以期為茶樹白化機(jī)制的解析提供參考。

一、白化茶樹突變體分類

白化茶樹是一類在特定環(huán)境條件下茶樹新梢呈現(xiàn)白化表型的茶樹突變體。根據(jù)誘導(dǎo)白化產(chǎn)生的因素，現(xiàn)有白化資源主要分為生態(tài)敏感型、生態(tài)不敏感型、生態(tài)復(fù)合型和未知型幾類。生態(tài)敏感型白化茶樹主要是對(duì)氣候因子比較敏感，可分為低溫敏感型和光照敏感型（表1），其中低溫敏感型茶樹的白化現(xiàn)象主要是受早春茶芽萌發(fā)時(shí)的溫度影響，并且隨著溫度的升高，白化表現(xiàn)減弱[4]，這種類型的茶樹在自然栽培條件下一般只在春末夏初發(fā)生“返白—復(fù)綠”現(xiàn)象，如白葉1號(hào)、千年雪等。而對(duì)于光照敏感型白化茶樹，多數(shù)資源全年表現(xiàn)為白化現(xiàn)象，如黃金芽、御金香等。與生態(tài)敏感型白化茶樹的“階段性白化”不同的是，生態(tài)不敏感型白化茶樹的白化現(xiàn)象屬于“恒定性白化”，即表現(xiàn)為白者恒白，綠者恒綠的現(xiàn)象[5]，如花月等。生態(tài)復(fù)合型白化茶樹是指茶樹組織的一部分依賴溫度或者光照的變異，一部分對(duì)生態(tài)因子不敏感，如金玉緣、春雪3 號(hào)等。而對(duì)于未知類型的白化茶樹資源，筆者認(rèn)為屬于上述3種類型之一，但仍需進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

表1 白化茶樹資源統(tǒng)計(jì)

對(duì)目前已有報(bào)道的白化茶樹資源進(jìn)行綜合分析可發(fā)現(xiàn)，白化茶樹也可依據(jù)芽葉顏色進(jìn)行分類，具體可分為以白色系和黃色系為主的純色類型和以斑馬葉、條紋葉、斑點(diǎn)葉為主的非純色類型（圖1）。其中白色系茶樹主要表現(xiàn)為低溫敏感型，黃色系茶樹主要表現(xiàn)為光照敏感型；在氨基酸含量上，白化茶樹資源的氨基酸含量較常規(guī)綠色茶樹品種高，但也并不是所有的白化茶樹資源氨基酸含量都高。表明了這些資源雖同為葉色突變體，但是不同資源之間的葉色形成機(jī)制及生理生化特征存在一定的差異，也正是這種差異的存在為我們進(jìn)行新種質(zhì)的創(chuàng)制提供了豐富的材料。

二、白化茶樹生理生化特征

植物葉片的色澤是葉綠體體內(nèi)的光合色素和液泡中的花青素綜合作用的結(jié)果，其中光合色素在光合作用中具有吸收、傳遞、轉(zhuǎn)化光能的作用，其含量是決定光合效率的重要因素[34]。葉綠體不僅能通過光合作用為植物的生長(zhǎng)發(fā)育提供養(yǎng)料，同時(shí)也是葉綠素、類胡蘿卜素和葉黃素等色素物質(zhì)合成的場(chǎng)所，因此其形態(tài)結(jié)構(gòu)與植物葉片色澤的變化具有緊密的聯(lián)系[35]。所以研究白化茶樹突變體葉綠體結(jié)構(gòu)變異以及光合性能變化是解答茶樹白化機(jī)理的基礎(chǔ)。

圖1 不同葉色的茶樹資源

1.葉綠體超微結(jié)構(gòu)

杜穎穎[36]利用透射電鏡觀察了處于15℃、20℃、25℃條件下的小雪芽葉片中葉綠體的超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)在15℃條件下，葉肉細(xì)胞內(nèi)無成熟葉綠體存在，可觀察到大量的白色體，但白色體內(nèi)無類囊體和基粒的堆疊。在20℃和25℃條件下，葉肉細(xì)胞內(nèi)均觀察到發(fā)育完整的葉綠體結(jié)構(gòu)，內(nèi)有發(fā)育良好的類囊體和緊密堆疊的基粒片層，不同的是在20℃條件下觀察到的葉綠體膜有損傷，推測(cè)可能是此時(shí)葉綠體膜的發(fā)育還不完全。李素芳等[37]利用透射電鏡觀察白葉1號(hào)階段性“白化—返綠”過程中葉綠體的超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)在返白階段葉綠體不斷退化解體、內(nèi)部空泡化，在復(fù)綠階段葉綠體結(jié)構(gòu)又重新恢復(fù)正常，并提出白葉1 號(hào)的白化現(xiàn)象可能是由核基因或核質(zhì)互作引起的[38]。李娜娜[39]則以白色系資源小雪芽為材料，研究發(fā)現(xiàn)其不同葉位葉綠體超微結(jié)構(gòu)的變化與白葉1 號(hào)不同白化階段的結(jié)果極其相似，在白色葉片中也出現(xiàn)了葉綠體解體和內(nèi)部空泡化的現(xiàn)象，而低葉位的偏綠色葉片葉綠體結(jié)構(gòu)又恢復(fù)了正常。韋康等[40]以光照敏感型白化品種中黃2 號(hào)和正常綠色品種龍井43 為試驗(yàn)材料比較葉綠體的超微結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)中黃2 號(hào)葉綠體結(jié)構(gòu)完整，沒有出現(xiàn)解體或大量囊泡，但是基粒片層堆疊少于龍井43。由此可以看出，幾乎所有白化茶樹葉色突變體的形成，在細(xì)胞結(jié)構(gòu)層面都伴隨著葉綠體空泡化、類囊體發(fā)育不完全、白色體的產(chǎn)生和基粒片層結(jié)構(gòu)缺乏等現(xiàn)象，但它們的相互關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

2.光合作用

光合作用為茶樹碳、氮代謝提供碳源和能量，同時(shí)也是決定生產(chǎn)力高低的重要指標(biāo)。但是茶樹的光合能力不僅受到環(huán)境的影響，也受品種自身遺傳因素的制約[41]。到目前為止，對(duì)白化茶樹品種在生理生化、葉色相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控等方面已有一些研究，但是對(duì)白化茶樹的光合生理特性研究還較少。李勤等[42]從凈光合效率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度和蒸騰速率等角度分析白葉1號(hào)在“返白—復(fù)綠”幾個(gè)階段的光合作用變化，發(fā)現(xiàn)在白化階段（白化前期、白化中期、白化期）葉片的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，而胞間CO2濃度則呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)；在復(fù)綠階段（復(fù)綠前期、復(fù)綠中期、全綠期）葉片的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率表現(xiàn)為逐漸上升的趨勢(shì)，胞間CO2濃度表現(xiàn)為逐漸下降趨勢(shì)。胞間CO2濃度在階段性“返白—復(fù)綠”過程中的變化和凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率的變化呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)，這可能與葉片的發(fā)育程度和葉綠體的結(jié)構(gòu)有關(guān)。Dong等[43]測(cè)定了黃金芽在自然光照和遮陰條件下葉片的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度、蒸騰速率，發(fā)現(xiàn)和遮陰條件下的綠色葉片相比較，自然光照條件下的黃色葉片凈光合速率、胞間CO2濃度均降低，而蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度均升高。由此可看出，白葉1 號(hào)和黃金芽雖同為葉色變異資源，但其光合性能還是有較大區(qū)別的。

3.生化成分

茶樹作為一種葉用作物，葉片生化成分的種類和含量是評(píng)價(jià)茶葉品質(zhì)和茶葉功能的重要指標(biāo)[44]。對(duì)不同白化茶樹進(jìn)行生化水平上的分析，有助于了解不同白化茶樹資源的特征特性，從而更好地指導(dǎo)相關(guān)資源的開發(fā)利用。

（1）主要代謝物

氨基酸、多酚類物質(zhì)和咖啡堿等是茶樹中重要的代謝物質(zhì)，也是茶葉中重要的呈味物質(zhì)，對(duì)茶樹生長(zhǎng)發(fā)育和茶葉品質(zhì)影響很大。而白化茶樹資源普遍表現(xiàn)為高氨基酸含量、適中的茶多酚，但在不同的處理下，其生化物質(zhì)也會(huì)發(fā)生明顯的變化。如Li 等[45]對(duì)黃金芽進(jìn)行遮陰處理，結(jié)果表明，遮陰處理的黃金芽新梢咖啡堿含量高于自然光照下的黃金芽新梢中的含量；隨著遮陰程度增加，黃金芽新梢中總氨基酸含量增加；而自然光照下，新梢中茶多酚總量明顯低于單層遮陰的黃金芽，但高于雙層遮陰的黃金芽。這說明遮陰有利于咖啡堿的積累和氨基酸含量的增加，但是過度遮陰會(huì)引起茶多酚含量的降低，這可能是遮陰導(dǎo)致茶樹體內(nèi)碳氮代謝發(fā)生變化，進(jìn)而引起各種次級(jí)代謝物質(zhì)含量發(fā)生變化的原因。此外，Lu等[46]以一個(gè)“帶白化枝條的正常綠色茶樹”為材料，比較白化枝條和綠色枝條中次級(jí)代謝物質(zhì)的變化。研究表明，與綠色葉片相比，白化葉片中EGCG、EGC、ECG、EC 含量大幅度降低；咖啡堿含量略微降低；而游離氨基酸，如茶氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸等顯著升高。杜穎穎[36]以小雪芽、白葉1 號(hào)、千年雪、黃金芽和福鼎大白茶為材料，研究白化資源與綠葉品種中茶多酚和咖啡堿含量的差異，結(jié)果表明，白化資源中茶多酚和咖啡堿含量顯著低于綠葉品種福鼎大白茶。

（2）色素含量

葉綠素和類胡蘿卜素作為光合色素，不僅在光合作用中起到捕獲、吸收、傳遞光能的作用，同時(shí)作為主要的脂溶性色素，其含量的高低直接決定茶樹葉片的顏色，進(jìn)而影響茶葉干茶和葉底色澤的形成。Cheng等[47]以綠色正常茶樹品種英紅9號(hào)及其白化突變體為材料，在春季和冬季分別測(cè)定了葉綠素a和葉綠素b的含量，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)季節(jié)的白化突變體中葉綠素a和葉綠素b的含量均顯著低于正常茶樹品種中的含量。Li 等[45]以黃金芽為研究材料，對(duì)其進(jìn)行遮陰處理，研究遮陰處理前后黃金芽的各種色素含量的差異。結(jié)果表明，遮陰處理綠色葉片的葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總量均明顯高于光照下黃色葉片的含量；而遮陰處理綠色葉片的紫黃質(zhì)、新黃質(zhì)、葉黃素和類胡蘿卜素總量均低于光照下黃色葉片的含量，分析認(rèn)為光照強(qiáng)度增強(qiáng)可能刺激了類胡蘿卜素的積累。Wang 等[48]分別測(cè)定中黃2 號(hào)和龍井43 中的葉綠素、類胡蘿卜素和葉黃素的含量，發(fā)現(xiàn)中黃2 號(hào)中葉綠素、類胡蘿卜素和葉黃素的含量均顯著低于龍井43。

（3）酶活性

研究發(fā)現(xiàn)，白化茶樹新梢在白化時(shí)期體內(nèi)酶活性會(huì)發(fā)生顯著的變化，主要表現(xiàn)為1,5-二磷酸核酮糖羧化酶活性下降，蛋白水解酶活性增強(qiáng)；在復(fù)綠時(shí)期兩種酶活性變化與白化時(shí)期相反。李素芳[49]研究白葉1號(hào)各白化時(shí)期和復(fù)綠時(shí)期酶活性與氨基酸含量的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)：隨白化程度加深，蛋白水解酶活性增強(qiáng)，將體內(nèi)多余蛋白質(zhì)水解，導(dǎo)致游離氨基酸含量增加，推測(cè)這可能是白葉1 號(hào)在白化時(shí)期氨基酸含量較高的原因。

過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）作為茶樹體內(nèi)的保護(hù)酶，在茶樹白化期間其活性也會(huì)發(fā)生變化。陸建良等[50]研究發(fā)現(xiàn)，在白葉1號(hào)返白過程中，POD酶活力升高，SOD 和CAT 酶活力降低，而當(dāng)芽梢復(fù)綠后，POD 酶活力降低，CAT、SOD 酶活力回升；Wu等[51]在研究光照和遮陰處理?xiàng)l件下白雞冠葉片中POD、SOD、CAT 酶活性變化時(shí)，也得出相同的結(jié)論。推測(cè)造成此類現(xiàn)象的原因可能是葉片內(nèi)葉綠體結(jié)構(gòu)發(fā)育異常，打破了活性氧平衡，使茶樹啟動(dòng)了保護(hù)酶機(jī)制。

三、組學(xué)技術(shù)在白化茶樹資源研究中的應(yīng)用

近些年來，隨著各種組學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，將茶學(xué)的相關(guān)研究帶入了一個(gè)新的高度。截至目前，已有2 個(gè)茶樹基因組草圖相繼發(fā)表[52-53]，標(biāo)志著茶學(xué)研究正式進(jìn)入了后基因組時(shí)代，這為不同白化茶樹分子機(jī)制的解析提供了新的研究方向。

1.基因差異表達(dá)

基因差異表達(dá)作為功能基因組學(xué)的重要組成部分，是從RNA水平上研究生物體在不同組織結(jié)構(gòu)、不同發(fā)育時(shí)期、不同環(huán)境條件下基因的表達(dá)情況。在白化資源的研究中，相關(guān)的分析方法已得到廣泛應(yīng)用。通過將不同葉色新梢差異表達(dá)的基因進(jìn)行Blast、GO、KEGG等分析，可初步了解引起白化表型的基因有哪些，以及它們主要富集在哪些代謝通路中，從而為探究白化茶樹資源的白化分子機(jī)制提供支撐。

因白葉1 號(hào)是較早發(fā)現(xiàn)的葉色變異資源，所以針對(duì)它的相關(guān)研究也最為系統(tǒng)，不同階段的差異表達(dá)技術(shù)在這一資源上均有應(yīng)用，如王新超等[54]利 用DDRT-PCR （Differential display of reverse transcriptional PCR）技術(shù)從白葉1 號(hào)不同葉色新梢中獲得58 條差異表達(dá)片段，進(jìn)一步通過RT-PCR分析，驗(yàn)證了12條陽性片段；Blastx序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，5個(gè)陽性片段分別與編碼血紅素結(jié)合蛋白、甲硫氨酸合酶、1-氨基環(huán)丙烷羧酸合酶等的基因序列高度相似。李娟[55]利用SSH（Suppression subtractive hybridization）技術(shù)從白葉1號(hào)綠色葉和白化期葉片中分離80個(gè)差異表達(dá)基因，進(jìn)一步分析篩選到1個(gè)可能調(diào)控白葉1號(hào)返白現(xiàn)象的鈣調(diào)熱激蛋白基因和2 個(gè)與高氨基酸性狀相關(guān)的絲氨酸-乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶基因。吳 揚(yáng)[56]、Ruan 等[57]分 別 利 用cDNA-AFLP （cDNA-amplified fragment length polymorphism）技術(shù)從白葉1 號(hào)不同葉色新梢中獲得了31 個(gè)和127 條差異表達(dá)片段，對(duì)這些差異表達(dá)的基因進(jìn)行同源序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，均與細(xì)胞周期、信號(hào)傳導(dǎo)、物質(zhì)和能量代謝等相關(guān)。Ma等[58]利用基因芯片技術(shù)從白葉1號(hào)不同葉色發(fā)育時(shí)期的葉片中獲得671個(gè)差異表達(dá)基因，這些基因主要參與到能量代謝、碳固定、次級(jí)代謝、植物生長(zhǎng)和防御等過程，并鑒定了一些參與葉綠素合成和葉綠體發(fā)育的催化酶和調(diào)控蛋白，其中發(fā)現(xiàn)編碼鎂-螯合酶基因的表達(dá)趨勢(shì)和葉色性狀的變化相一致。Li等[59]對(duì)白葉1號(hào)黃綠期、白化期、返綠期3 個(gè)時(shí)期的新梢進(jìn)行RNA-Seq 測(cè)序，通過兩兩比較分析差異表達(dá)基因，這些差異表達(dá)基因主要參與到代謝途徑、次級(jí)代謝物生物合成、苯丙烷代謝和碳固定途徑中。

近些年，隨著葉色變異資源的增多，基因差異顯示技術(shù)也開始在更多的品種資源中得到應(yīng)用（表2），如李娜娜等[60]利用RNA-Seq法對(duì)福鼎大白茶和小雪芽葉片的差異基因進(jìn)行了研究，篩選到1 821 個(gè)上調(diào)表達(dá)基因和1 779 個(gè)下調(diào)表達(dá)基因，進(jìn)一步對(duì)差異基因進(jìn)行GO 和COG 分析，認(rèn)為引起小雪芽新梢白化的遺傳機(jī)制可能與蛋白質(zhì)翻譯后修飾過程有關(guān)。Wu等[51]利用RNA-Seq技術(shù)對(duì)白雞冠的白化葉片和綠色葉片的差異表達(dá)基因進(jìn)行研究，這些差異表達(dá)基因主要參與葉綠體發(fā)育、活性氧清除、光合色素合成、次級(jí)代謝和晝夜節(jié)律調(diào)控過程。一些科研人員也分別利用RNA-Seq技術(shù)研究了御金香、華白1 號(hào)、黃金芽、炎陵銀邊茶等不同葉色時(shí)期的差異表達(dá)基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因同樣參與了葉綠體發(fā)育、光合色素合成、次級(jí)代謝等過程[61-66]。這說明雖然不同白化資源的遺傳背景并不相同，但在基因表達(dá)層面上，葉綠體發(fā)育異常和葉綠素合成受阻是導(dǎo)致這類資源白化表型產(chǎn)生的直接原因。

表2 白化茶樹資源的基因差異表達(dá)研究

2.蛋白質(zhì)組學(xué)

蛋白質(zhì)組學(xué)是以生物體內(nèi)基因所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)為研究對(duì)象，從整體、動(dòng)態(tài)的角度研究蛋白質(zhì)特征，從而幫助科研人員從蛋白質(zhì)水平上整體而全面地理解生物體的組織變化、物質(zhì)代謝等過程[67-68]。目前，基于雙向凝膠電泳、質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在白化茶樹資源的研究中已得到初步應(yīng)用（表3）。如Li 等[69]在白葉1 號(hào)3 個(gè)葉色發(fā)育階段利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS）技術(shù)鑒定了26個(gè)生育期差異表達(dá)蛋白，這些差異表達(dá)蛋白主要參與碳氮硫代謝、光合作用、RNA 和蛋白質(zhì)加工、脅迫防御等過程；之后同樣在白葉1 號(hào)3個(gè)葉色發(fā)育階段利用質(zhì)譜鑒定了22個(gè)葉綠體差異表達(dá)蛋白，發(fā)現(xiàn)與光合作用、物質(zhì)代謝、核酸代謝、應(yīng)激響應(yīng)等相關(guān)[70]。Xu 等[71-72]從轉(zhuǎn)錄后修飾角度，利用LC-MS/MS （Liquid chromatography-tandem mass spectrometry）技術(shù)先后從白葉1號(hào)不同白化時(shí)期的表達(dá)蛋白中鑒定了3 161 個(gè)乙?；稽c(diǎn)和3 530 個(gè)琥珀?；稽c(diǎn)，其中與光合作用、碳固定、氨基酸生物合成和葉綠素代謝相關(guān)蛋白的琥珀?；皆诟鱾€(gè)白化時(shí)期存在差異，同時(shí)與光合作用和次級(jí)代謝相關(guān)蛋白的乙酰化水平也發(fā)生了變化，而且部分琥珀?；鸵阴；鞍椎淖饔么嬖诓糠种丿B。除了對(duì)低溫敏感型白葉1 號(hào)進(jìn)行研究之外，還有研究分別利用同位素相對(duì)標(biāo)記和絕對(duì)定量技術(shù)（Isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ）分別鑒定了光照敏感型的黃金芽和中黃1 號(hào)的173 個(gè)、56 個(gè)、437 個(gè)差異表達(dá)蛋白，大多數(shù)蛋白均參與光合作用、類黃酮代謝、碳水化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝、次級(jí)代謝物的合成等過程[43,73-74]。

3.代謝組學(xué)

代謝組學(xué)可以通過定性或定量分析生物體在不同發(fā)育時(shí)期、不同組織結(jié)構(gòu)、不同環(huán)境條件下代謝產(chǎn)物的變化情況，從而整體揭示生物體的代謝調(diào)控機(jī)制和生命活動(dòng)規(guī)律。近些年來，研究者們利用代謝組學(xué)技術(shù)與多元統(tǒng)計(jì)分析相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)不同葉色茶樹品種之間、同一茶樹品種不同葉色之間的代謝物變化均存在顯著的差異（表4）。如Zeng 等[75]利用UPLC-QTOF-MS（Ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-Flight mass spectrometry）技術(shù)在白葉1 號(hào)3 個(gè)葉色發(fā)育階段共鑒定了92 種差異代謝物，這些差異代謝物主要參與類黃酮、苯丙烷、氨基酸等的生物合成途徑，并發(fā)現(xiàn)在白化期內(nèi)氨基酸含量較高、碳水化合物含量較低，兒茶素和黃酮類物質(zhì)含量在白化前期和返綠期含量較高；Li等[76]利用LC-MS技術(shù)同樣在白葉1號(hào)的3個(gè)葉色發(fā)育階段鑒定了65個(gè)差異代謝物，這些差異代謝物與半乳糖、色氨酸代謝和苯丙烷、類黃酮生物合成等相關(guān)。Zhang等[77]在黃金芽白化葉片和綠色葉片中共鑒定了52個(gè)差異代謝物，與類黃酮物質(zhì)生物合成和苯丙烷代謝相關(guān)，并發(fā)現(xiàn)CG、槲皮素和黃酮醇苷類物質(zhì)在白化葉片中大量積累，而楊梅苷和EGCG含量則較低；之后Zhang等[78]又鑒定了41 個(gè)差異代謝物，與氨基酸和碳骨架代謝相關(guān)，其中在白化葉片中谷氨酸、谷氨酰胺、茶氨酸、檸檬酸和α-酮戊二酸含量增加，而單糖、二糖和咖啡堿含量降低。Shen 等[79]為解析白化葉片氨基酸代謝增強(qiáng)的機(jī)制，利用HPLC （High performance liquid chromatography）檢測(cè)了黃山白茶白化前期、芽期、白化期和返綠期新梢中的游離氨基酸含量，并以綠色品種黃山種為對(duì)照，同時(shí)利用qRT-PCR 技術(shù)檢測(cè)了參與氨基酸代謝的基因在幾個(gè)不同時(shí)期的表達(dá)量，結(jié)果表明茶氨酸合成增強(qiáng)和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)能力降低是導(dǎo)致白化時(shí)期新梢中氨基酸含量增加的主要原因。此外，F(xiàn)eng 等[80]利用HPLC 技術(shù)研究了不同葉色品種之間的代謝譜差異，發(fā)現(xiàn)和綠色品種福鼎大白茶相比，白化品種白葉1 號(hào)、黃金芽、御金香葉片中含有較低的葉綠素、類胡蘿卜素、咖啡堿、兒茶素，而玉米黃素和茶氨酸含量較高。

表3 白化茶樹資源的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

目前，利用代謝組學(xué)技術(shù)研究白化茶樹資源的代謝物變化，主要關(guān)注氨基酸、黃酮類和糖類等物質(zhì)，而對(duì)香氣物質(zhì)的報(bào)道很少。根據(jù)已有研究，Dong 等[81]利用GC-MS 技術(shù)分析了4月、8月和12月份英紅9 號(hào)白化葉片和綠色葉片中香氣物質(zhì)的變化，發(fā)現(xiàn)3 個(gè)時(shí)期中白化葉片的順-3-乙烯醇和芳樟醇含量均顯著低于綠色葉片，其他香氣物質(zhì)含量變化不明顯；這可能就是導(dǎo)致白化葉片中香氣物質(zhì)含量低于綠色葉片的直接原因。

表4 白化茶樹資源的代謝組學(xué)研究

四、分子標(biāo)記技術(shù)在白化資源研究中的應(yīng)用

隨著測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，也推動(dòng)了DNA分子標(biāo)記技術(shù)的廣泛應(yīng)用，與形態(tài)學(xué)標(biāo)記、同工酶標(biāo)記相比，DNA分子標(biāo)記直接從基因組水平上研究生物的遺傳變異，不受發(fā)育時(shí)期、環(huán)境因素的限制[82]。目前分子標(biāo)記技術(shù)在白化茶樹資源研究中主要應(yīng)用于遺傳多樣性分析、品種鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建及QTL定位等方面。

王松琳[83]等利用SSR （Simple sequence repeats）分子標(biāo)記對(duì)16個(gè)白化茶樹品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，通過分析等位基因數(shù)、多態(tài)性信息含量和shannon 值等，發(fā)現(xiàn)品種間遺傳結(jié)構(gòu)差異明顯。并篩選出3 對(duì)核心SSR 引物，用于品種鑒定。王開榮等[3]利用RAPD（Random amplification polymorphic DNA）技術(shù)結(jié)合DNA序列測(cè)定，以福鼎大白茶為對(duì)照，研究黃金芽、千年雪、御金香、白葉1 號(hào)、四明雪芽、金光和花月等7 個(gè)白化品種的特異DNA 分子標(biāo)記，以期找到與白化相關(guān)的基因。通過對(duì)單一品種唯一擴(kuò)增位點(diǎn)和缺失位點(diǎn)分析，發(fā)現(xiàn)一些位點(diǎn)可能與葉綠素代謝和抑制與葉綠素代謝相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)；進(jìn)一步篩選了21個(gè)特異分子標(biāo)記，并成功測(cè)序了4條DNA序列，通過Blast序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)與蛋白激酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族基因等具有同源性；同時(shí)這一分子標(biāo)記也可應(yīng)用于白化茶樹品種的遺傳鑒定。吳永勝[84]以白葉1號(hào)、黃金芽、御金香、四明雪芽等10份茶樹資源為材料，先利用50對(duì)RAPD反應(yīng)體系及程序進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，引物S20 在御金香中擴(kuò)增出1條特異性片段，之后在引物S20基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)SCAR引物SY20，用于擴(kuò)增10份材料，發(fā)現(xiàn)該引物同樣在御金香中擴(kuò)增出特異性片段，表明了RAPD標(biāo)記成功地轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記，并且利用該標(biāo)記能夠?qū)⒂鹣銖亩喾N茶樹資源中鑒別出來。

葉綠素、類胡蘿卜素等色素物質(zhì)直接影響茶樹新梢葉片色澤，屬于數(shù)量性狀。為研究其遺傳機(jī)制，王松琳[35]以白雞冠和龍井43 作為父母本構(gòu)建遺傳群體，對(duì)親本和子代個(gè)體測(cè)序獲得大量SNP（Single nucleotide polymorphisms）標(biāo)記，結(jié)合擬測(cè)交策略構(gòu)建遺傳圖譜，隨后利用遺傳圖譜對(duì)葉綠素和類胡蘿卜素這2 個(gè)性狀進(jìn)行QTL（Quantitative trait locus）作圖，結(jié)果共定位了10個(gè)QTL，分布于4 個(gè)連鎖群上，表型貢獻(xiàn)率在18.2%～72.0%，均為主效QTL。

五、展望

綜上所述，茶樹白化現(xiàn)象的產(chǎn)生與細(xì)胞色素的合成和降解、光合系統(tǒng)、葉綠體的發(fā)育等密切相關(guān)。在生理水平上表現(xiàn)為葉綠體解體或退化消失，進(jìn)而影響了葉綠素和類胡蘿卜素等色素的生物合成；在生化成分上體現(xiàn)為含有較高含量的游離氨基酸；但是在分子水平上茶樹的白化機(jī)理仍不明確。目前，雖也有部分參與葉綠素、類胡蘿卜素、氨基酸合成相關(guān)的茶樹基因得到了分離克隆，如鄧婷婷等[85-86]根據(jù)cDNA-AFLP 的結(jié)果，利用RACE（Rapid amplification of cDNA ends）技術(shù)克隆了泛素活化酶基因和八氫番茄紅素脫氫酶3 基因；馬春雷等[87]根據(jù)芯片雜交結(jié)果，克隆了3 個(gè)參與葉綠素合成途徑的基因：谷氨酸-tRNA 還原酶基因、葉綠素合酶基因、葉綠素醋酸氧化酶基因。但相關(guān)研究均屬于同源克隆，因此到底是哪個(gè)基因的突變導(dǎo)致了白葉1 號(hào)、黃金芽等白化突變體的白化表型問題仍未有答案。

從已報(bào)道的研究結(jié)果來看，在茶樹白化突變體研究中還存在諸多亟待解決的問題。

首先，雖然近些年各地陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了很多的白化茶樹突變材料，但大多數(shù)資源的譜系關(guān)系和遺傳背景均不清楚；以這些突變體為研究材料的相關(guān)研究也多集中在生理生化、基因表達(dá)和代謝層面，而缺少遺傳層面的深入分析。

第二，因茶樹是多年生木本植物，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，導(dǎo)致構(gòu)建白化相關(guān)遺傳群體的難度很大；而茶樹基因組龐大，遺傳位點(diǎn)高度雜合，使得茶樹白化性狀的遺傳解析困難重重。

第三，因茶樹轉(zhuǎn)基因技術(shù)尚不成熟，很難通過本源表達(dá)驗(yàn)證基因功能，從而導(dǎo)致白化相關(guān)基因的鑒定很難開展。針對(duì)這些問題，課題組從2013年開始，對(duì)保存在國(guó)家種質(zhì)杭州茶樹圃的十幾份白化茶樹資源的遺傳特性進(jìn)行了連續(xù)多年的觀察，發(fā)現(xiàn)這些資源中的大多數(shù)都具有葉色遺傳規(guī)律，如黃金芽、白雞冠、安吉黃茶、中黃1 號(hào)等（表5）。

表5 不同白化品種資源的遺傳特性分析

隨后課題組以其中3 個(gè)具有葉色遺傳特性的白化資源為父本，通過多年的連續(xù)雜交，已建立了3 個(gè)白化性狀在子代中能有效分離的F1 群體，這些遺傳群體將是以后解答白化茶樹資源葉色突變機(jī)制的重要研究材料。