游泳運(yùn)動對2型糖尿病小鼠海馬Aβ及生成相關(guān)蛋白的影響

姚曦,何標(biāo)

(1.安徽機(jī)電職業(yè)技術(shù)學(xué)院,安徽 蕪湖,241003;2.安徽師范大學(xué) 體育學(xué)院,安徽 蕪湖,241002)

阿爾茨海默病是一種多發(fā)于老年人群的神經(jīng)系統(tǒng)疾病[1]。被認(rèn)為是伴隨機(jī)體衰老而引起的神經(jīng)退行性病變,按照發(fā)病病因的不同可分為遺傳性阿爾茨海默病和散發(fā)性阿爾茨海默病(sporadicAlzheimer's,sAD)。目前,sAD病因尚不清楚,普遍認(rèn)為是遺傳和環(huán)境等因素共同作用的結(jié)果[2]。有研究表明,sAD發(fā)生的始動因素可能是胰島素抵抗或胰島素功能異常[3]。神經(jīng)退行性疾病可能始發(fā)于外周的胰島素抵抗,而sAD可能與腦內(nèi)胰島素代謝異常密切相關(guān)[4]。運(yùn)動作為一種有效的干預(yù)手段,對IR和AD有積極的預(yù)防和緩解作用,但具體的分子機(jī)制尚不清楚,本實(shí)驗(yàn)擬通過建立T2DM小鼠模型,探討8周的游泳運(yùn)動對T2DM小鼠海馬Aβ42及生成相關(guān)蛋白含量的影響,及運(yùn)動預(yù)防STZ致T2DM小鼠阿爾茨海默病樣變化的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

購4周齡清潔級雄性C57BL/6小鼠,常規(guī)分籠飼養(yǎng),實(shí)驗(yàn)小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機(jī)分為正常對照組 (C,N=6)和糖尿病建模組(N=30),C組小鼠普通飼料喂養(yǎng)。糖尿病建模組小鼠進(jìn)行6周的高脂膳食后,腹腔注射STZ(25mg/kg),連續(xù)5 d,以空腹血糖≥11.1 mmol/L為糖尿病小鼠標(biāo)準(zhǔn)[5]。把糖尿病小鼠隨機(jī)分為糖尿病安靜組(DC,N=6)和糖尿病運(yùn)動組(DE,N=6)。

1.2 運(yùn)動方案

DE組小鼠進(jìn)行8周的無負(fù)重游泳運(yùn)動,每周5次,每次持續(xù)60 min,游泳運(yùn)動開始前進(jìn)行3 d的預(yù)游泳實(shí)驗(yàn),分別15 min、30 min和45 min,第4 d開始正式游泳運(yùn)動,持續(xù)8周,C組和DC組安靜飼養(yǎng)。

1.3 取材

小鼠末次運(yùn)動結(jié)束后禁食12 h,脫頸處死實(shí)驗(yàn)小鼠,取海馬,放入-80℃冰箱保存,待測。

1.4 測定方法

采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測海馬APP、PS1、BACE1和Aβ42蛋白相對表達(dá)水平,參照文獻(xiàn)[6]進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)。取適量海馬,按1∶7的質(zhì)量比加入混有PMSF的裂解液,均漿,離心,取上清,BCA試劑盒測定蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳,PVDF轉(zhuǎn)膜,脫脂牛奶封閉,加一抗(APP,CST,1∶1 000;PS1,Santa,1∶1 000;BACE-1,abcam,1∶1 000;Aβ42,CST,1∶1 000),搖床過夜,孵二抗,TBST搖床清洗,暗室ECL顯影,用AIpha成像系統(tǒng)曝光,ImageJ1.46進(jìn)行灰密度值分析,將目的蛋白與內(nèi)參平均密度的比值作為目的蛋白相對表達(dá)水平。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理

用SPSS 18.0軟件對所獲數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析,所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較用單因素分析法(One-Way ANOVA),事后檢驗(yàn)采用LSD法。P＜0.05為差異具有顯著性,P＜0.01為差異具有極顯著性,運(yùn)用Graph Prism 7進(jìn)行圖像處理。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 游泳運(yùn)動對小鼠海馬Aβ42蛋白相對表達(dá)水平的影響

Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與C組(0.86±0.22)相比較,DC組小鼠海馬Aβ42相對表達(dá)水平(1.46±0.11)顯著增加(P＜0.01),與DC組相比,DE組小鼠海馬Aβ42相對表達(dá)水平(1.03±0.35)顯著降低(P＜0.05),如圖1-A所示。

2.2 游泳運(yùn)動對小鼠海馬APP、BACE1和 PS1蛋白相對表達(dá)水平的影響

Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與C組(0.88±0.27)相比較,DC組小鼠海馬APP相對表達(dá)水平(1.30±0.15)顯著增加(P＜0.01),與DC組相比,DE組小鼠海馬APP相對表達(dá)水平(1.01±0.12)顯著降低(P＜0.05),如圖1-B所示。

Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與C組(0.89±0.22)相比較,DC組小鼠海馬BACE1相對表達(dá)水平(1.40±0.20)顯著增加(P＜0.01),與DC組相比,DE組小鼠海馬BACE1相對表達(dá)水平(1.07±0.18)顯著降低(P＜0.05),如圖1-C所示。

Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與C組(1.00±0.16)相比較,DC組小鼠海馬PS1相對表達(dá)水平(1.48±0.22)顯著增加(P＜0.01),與DC組相比,DE組小鼠海馬PS1相對表達(dá)水平(1.10±0.11)顯著降低(P＜0.01),如圖1-D所示。

圖1 各組小鼠海馬APP、BACE1、PS1和Aβ42蛋白相對表達(dá)統(tǒng)計(N=6)

3 結(jié)果分析

AD以細(xì)胞外老年斑、神經(jīng)纖維纏結(jié)和以膽堿能神經(jīng)元的變性和突觸的丟失為主要病理特征,起病隱襲,在以后的數(shù)年里緩慢發(fā)展為明顯的癡呆癥狀[2]。sAD發(fā)生的始動因素可能是胰島素抵抗或胰島素功能異常,腦胰島素抵抗可能是神經(jīng)退行性疾病的始動因素[4]。神經(jīng)元胰島素功能異常引起sAD葡萄糖代謝異常、線粒體功能障礙、ATP代謝減少等癥狀,導(dǎo)致海馬Aβ異常積聚等AD樣病理變化[7]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),腹腔注射STZ誘導(dǎo)的T2DM小鼠海馬Aβ42蛋白相對表達(dá)水平顯著高于正常對照組,提示外周胰島素功能異常導(dǎo)致T2DM小鼠海馬發(fā)生AD樣病理改變,其機(jī)制可能是外周胰島素和葡萄糖穩(wěn)態(tài)的改變影響腦內(nèi)胰島素及受體的功能,導(dǎo)致海馬Aβ異常聚集[8]。自發(fā)性糖尿病大鼠海馬Aβ1-42質(zhì)量濃度也顯著增加[9]。高脂膳食導(dǎo)致的IR大鼠海馬Aβ蛋白相對表達(dá)水平顯著增加[10]。上述研究表明,外周胰島素抵抗導(dǎo)致小鼠海馬Aβ蛋白相對表達(dá)增多,出現(xiàn)AD樣病理改變。

Aβ細(xì)胞外異常聚集是AD的主要病因所在,其中以對神經(jīng)細(xì)胞毒性較大的Aβ42為主要成分[11]。Aβ是淀粉樣前體蛋白(Amyloid precursor protein,APP)在β-分泌酶和γ-分泌酶的作用下生成的[12]。APP首先在β-分泌酶的作用下,水解產(chǎn)生sAPPβ和膜結(jié)合的C末端含有99個氨基酸片段的C99,隨后在γ-分泌酶的作用下,C99被裂解為Aβ,即Aβ代謝途徑,BACE1和PS1分別是β-分泌酶和γ-分泌酶的主要成分[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與C組相比較,小劑量腹腔注射STZ誘導(dǎo)的T2DM小鼠海馬APP、BACE1和PS1蛋白相對表達(dá)水平均顯著升高,Aβ42蛋白相對表達(dá)水平顯著增加,提示T2DM小鼠海馬發(fā)生AD樣病理改變。IR和胰島素信號傳導(dǎo)障礙上調(diào)小鼠海馬和皮層APP蛋白相對表達(dá)水平,加速了Aβ的積聚速率,最終導(dǎo)致AD的發(fā)生[14]。對3 d齡新生幼鼠腦室注射STZ后發(fā)現(xiàn),腦室注射STZ顯著上調(diào)新生幼鼠顳葉和下丘腦APP mRNA表達(dá)水平,提示腦內(nèi)IR和胰島素信號傳導(dǎo)障礙上調(diào)APP mRNA表達(dá)水平[15]。而高果糖飲食誘導(dǎo)的IR大鼠海馬APP、BACE1及PS1蛋白相對表達(dá)水平顯著高于對照組,IR大鼠海馬APP異常裂解增多,Aβ生成增多[16]。而8月齡自發(fā)性糖尿病大鼠皮層APP、β-分泌酶蛋白相對表達(dá)水平顯著高于同齡對照組[17]。提示胰島素抵抗及胰島素信號傳導(dǎo)障礙導(dǎo)致Aβ生成相關(guān)蛋白表達(dá)增多。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相一致,研究結(jié)果提示胰島素抵抗及胰島素信號傳導(dǎo)障礙導(dǎo)致與Aβ生成相關(guān)的APP、BACE1和PS1等蛋白相對表達(dá)水平上調(diào),其機(jī)制可能是胰島素抵抗引起腦內(nèi)胰島素信號通路傳導(dǎo)障礙,上調(diào)APP、BACE1和PS1蛋白相對表達(dá)水平,最終加速了Aβ的生成[18]。

適宜的身體鍛煉有助于增強(qiáng)海馬功能,提高學(xué)習(xí)記憶能力[19]。每周一次的身體活動可以有效降低sAD的發(fā)病機(jī)率[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與DC組相比,DE組小鼠海馬APP、BACE1、PS1和Aβ42的蛋白相對表達(dá)水平顯著降低,證實(shí)適宜的運(yùn)動能夠預(yù)防和緩解AD的發(fā)生。文獻(xiàn)[21]發(fā)現(xiàn),與安靜組相比,5周的跑臺運(yùn)動顯著降低APP/PS1小鼠海馬APP蛋白相對表達(dá)水平和Aβ質(zhì)量濃度。Yu等[22]證實(shí),對腹腔注射D半乳糖導(dǎo)致的AD大鼠進(jìn)行8周的跑臺運(yùn)動后發(fā)現(xiàn),運(yùn)動組大鼠海馬APP、BACE1、PS1和Aβ42蛋白表達(dá)水平較安靜組顯著降低。上述研究結(jié)果提示,適宜的身體活動可能通過減少Aβ聚集,延緩AD的病理進(jìn)程。其機(jī)制可能是運(yùn)動通過抑制APP、BACE1和PS1蛋白相對表達(dá)水平,減少Aβ的生成[23]。側(cè)腦室注射STZ上調(diào)SD大鼠海馬Aβ42蛋白相對表達(dá)水平,對側(cè)腦室注射STZ的SD大鼠進(jìn)行6周的自主跑輪運(yùn)動后發(fā)現(xiàn),運(yùn)動組大鼠海馬Aβ42蛋白相對表達(dá)水平顯著降低[24]。提示長期的運(yùn)動可以抑制胰島素抵抗導(dǎo)致的海馬Aβ42的生成。文獻(xiàn)[25]證實(shí)6周的游泳運(yùn)動降低T1DM大鼠海馬APP蛋白相對表達(dá)水平。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示,8周的游泳運(yùn)動降低T2DM小鼠海馬APP蛋白相對表達(dá)水平,與上述研究結(jié)果相一致。針對運(yùn)動對Aβ生成相關(guān)蛋白影響的研究也有不同的結(jié)論,不同的運(yùn)動方式對CD1小鼠大腦皮層APP和PS1蛋白相對表達(dá)水平產(chǎn)生不同的影響,與同齡安靜組相比較,8周的自主跑輪運(yùn)動上調(diào)了CD1小鼠大腦皮層APP和PS1蛋白相對表達(dá)水平,雖然16周的跑臺運(yùn)動對CD1小鼠大腦皮層APP蛋白表達(dá)水平?jīng)]有產(chǎn)生影響,但降低CD1小鼠大腦皮層PS1蛋白相對表達(dá)水平[26]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),8周的游泳訓(xùn)練降低T2DM小鼠海馬APP和PS1蛋白表達(dá)水平,導(dǎo)致研究結(jié)果不一致的原因可能是實(shí)驗(yàn)動物的模型不同以及運(yùn)動方式和動物年齡不同導(dǎo)致的。

4 結(jié)論

外周胰島素抵抗及信號傳導(dǎo)障礙導(dǎo)致海馬發(fā)生AD樣病例改變,主要表現(xiàn)為海馬Aβ42生成增多,Aβ生成相關(guān)蛋白APP、BACE1及PS1蛋白相對表達(dá)水平增多。而8周的游泳運(yùn)動通過抑制海馬APP、BACE1和PS1蛋白相對表達(dá)水平,減少Aβ42的生成,推測運(yùn)動可能通過抑制海馬Aβ生成相關(guān)蛋白表達(dá)水平,減少Aβ42的生成,最終達(dá)到延緩AD的目的。