大米蛋白質(zhì)酰胺Ⅲ帶三級紅外光譜研究

武玉潔,王麗欣,封卓帆,辛?xí)?肖霄,于宏偉

(1.河北一品制藥股份有限公司,河北 石家莊,052165;2.石家莊學(xué)院 化工學(xué)院,河北 石家莊,050035)

大米中含碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪,及豐富的B族維生素等,是我國南方大部分地區(qū)人民的主要食品[1-4]。大米富含蛋白質(zhì),而蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值在很大程度和其結(jié)構(gòu)有關(guān)。IR光譜是物質(zhì)定性的重要方法之一。它的解析能夠提供許多關(guān)于官能團(tuán)的信息。其定性分析有特征性高、分析時(shí)間短、不破壞試樣、測定方便等優(yōu)點(diǎn)[5-8]。蛋白質(zhì)在酰胺Ⅰ帶具有較強(qiáng)的紅外吸收峰[9-10],但由于酰胺Ⅰ帶和水分子的部分IR吸收峰重疊,因此影響了傳統(tǒng)的IR光譜在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的深入研究。而水分子在蛋白質(zhì)酰胺Ⅲ帶吸收頻率附近沒有吸收峰,因此可采用IR光譜法測定大米酰胺Ⅲ帶研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)[11]。由于蛋白質(zhì)的酰胺Ⅲ帶的對應(yīng)的官能團(tuán)IR吸收強(qiáng)度不高,并不能提供有價(jià)值的光譜信息。2D-IR光譜是一項(xiàng)較為先進(jìn)的IR光譜技術(shù)[12-13],本文采用2D-IR光譜,結(jié)合傳統(tǒng)的IR光譜及TD-IR光譜進(jìn)一步開展食品(包括：玉米,小麥及食用酵母)蛋白質(zhì)酰胺Ⅲ帶IR光譜研究工作[14-16],研究了溫度變化對大米蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)及熱穩(wěn)定的影響,為大米的存貯及鑒別研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器及操作方法

大米(產(chǎn)地：遼寧省盤錦市,石家莊市長安區(qū)北國超市談固店售);傅里葉紅外光譜儀(Spectrum 100型,美國PE公司);ATR-FTIR附件(Golden Gate型,英國Specac公司);ATR-FTIR變溫控件(WEST 6100+型,英國Specac公司)。

1.2 紅外光譜數(shù)據(jù)獲得及圖形處理

大米IR光譜實(shí)驗(yàn)以空氣為背景,每次對于信號進(jìn)行8次掃描累加;大米TD-IR光譜測溫范圍293～393 K(變溫步長10 K)。大米IR光譜和TD-IR光譜數(shù)據(jù)采用Spectrum v 6.3.5軟件,大米2D-IR光譜數(shù)據(jù)獲得采用TD Versin 4.2軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 大米IR光譜研究

大米的一維IR光譜如圖1A所示。由圖1A可知,3 283 cm-1頻率處對應(yīng)的吸收峰是大米OH伸縮振動模式(νOH-one-dimensional-rice),2 925 cm-1頻率處對應(yīng)的吸收峰是大米CH2不對稱伸縮振動模式(νasCH2-one-dimensional-rice),2 855 cm-1頻率處對應(yīng)的吸收峰是大米CH2對稱伸縮振動模式(νsCH2-one-dimensional-rice),1 745cm-1頻率處對應(yīng)的吸收峰是大米油脂C=O伸縮振動模式(νC=O-one-dimensional-rice),1 539 cm-1頻率處對應(yīng)的吸收峰是大米蛋白質(zhì)酰胺Ⅱ帶模式(νamide-Ⅱ-one-dimensional-rice), 而 1 240 cm-1頻率處對應(yīng)的吸收峰是大米蛋白質(zhì)酰胺Ⅲ帶模式(νamide-Ⅲ-one-dimensional-rice)。大米的二階導(dǎo)數(shù)IR光譜如圖1B所示。由圖1B可知,其譜圖分辨能力有了一定 的 提 高 , 其 中 1 660 cm-1(νamide-Ⅰ-1-secondderivative-rice)和 1 649 cm-1(νamide-Ⅰ-2-second derivative-rice)頻率處對應(yīng)的吸收峰是大米蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ帶模式(νamide-Ⅰ-second derivative-rice), 而大米νamide-Ⅱ-rice 對應(yīng)吸收頻率包括：1 548 cm-1(νamide-Ⅱ-1-second derivative-rice)、1 515 cm-1(νamide-Ⅱ-2-second derivative-rice), 相關(guān) IR 光譜數(shù)據(jù)見表1。

表1 大米的IR光譜數(shù)據(jù)(303 K)

圖1 大米IR光譜(303 K)

2.2 大米蛋白質(zhì)酰胺Ⅲ帶νamide-Ⅲ-rice的TD-IR光譜研究

首先開展了大米蛋白質(zhì)酰胺Ⅲ帶νamide-Ⅲ-one-dimensional-rice的一維TD-IR光譜研究(圖2A)。由圖2A可知,隨著測定溫度的升高,大米νamide-Ⅲ-one-dimensiona-rice對應(yīng)的吸收頻率出現(xiàn)了紅移,而相應(yīng)的吸收強(qiáng)度明顯降低。進(jìn)一步開展了大米蛋白質(zhì)酰胺Ⅲ帶νamide-Ⅲ-second derivative-rice 的 二 階導(dǎo)數(shù)TD-IR光譜研究(圖2B),其光譜信息比較復(fù)雜。由圖2B可知,在303～393K的 加 熱 過 程 中 , 大 米 νamide-Ⅲ-secondderivative-rice出現(xiàn)了新的紅外吸收峰,相關(guān)TD-IR光譜信息見表2。大米蛋白質(zhì)酰胺Ⅲ帶νamide-Ⅲ-rice的TD-IR光譜實(shí)驗(yàn)則進(jìn)一步證明,大米的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)對于溫度變化比較敏感,而隨著測定溫度的升高,大米的蛋白質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。

表2 大米蛋白質(zhì)酰胺Ⅲ帶νamide-Ⅲ-rice的TD-IR光譜數(shù)據(jù)(303～393 K)

圖2 大米蛋白質(zhì)酰胺Ⅲ帶νamide-Ⅲ-riceTD-IR光譜(303～393 K)

2.3 大米蛋白質(zhì)酰胺Ⅲ帶νamide-Ⅲ-rice的2D-IR光譜研究

2.3.1 同步2D-IR光譜研究

在1 200～1 330 cm-1頻率范圍內(nèi),首先開展了大米蛋白質(zhì)酰胺Ⅲ帶νamide-Ⅲ-rice的同步2D-IR光譜研究(圖3),其譜圖分辨能力要優(yōu)于相應(yīng)的一維及二階導(dǎo)數(shù)IR光譜。首先在(1 214 cm-1,1 214 cm-1)、(1 270 cm-1,1 270 cm-1)、(1 289 cm-1,1 289 cm-1)和(1 306 cm-1,1 306 cm-1)頻率處發(fā)現(xiàn)了4個相對強(qiáng)度較大的自動峰。1 214 cm-1頻率處的吸收峰歸屬于大米蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中的β-折疊結(jié)構(gòu)[14-16],1 270 cm-1頻率處的吸收峰歸屬于大米蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中的無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu),1 289 cm-1頻率處的吸收峰歸屬于大米蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中的β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu),而1 306 cm-1頻率處的吸收峰歸屬于大米蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中的α-螺旋結(jié)構(gòu)。大米νamide-Ⅲ-rice同步二維紅外光譜自動峰數(shù)據(jù)則證明：大米蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中的β-折疊結(jié)構(gòu)(1 214 cm-1)、無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)(1 270 cm-1)、β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)(1 289 cm-1)和α-螺旋結(jié)構(gòu)(1 306 cm-1)對應(yīng)的官能團(tuán)對于溫度變化比較敏感。此外在(1 214 cm-1,1 306 cm-1)和(1 270 cm-1,1 289 cm-1)頻率處發(fā)現(xiàn)二個相對強(qiáng)度較大的交叉峰,則進(jìn)一步證明大米蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中,β-折疊結(jié)構(gòu)(1 214 cm-1)和α-螺旋結(jié)構(gòu)(1 306 cm-1)之間存在著較強(qiáng)的分子內(nèi)相互作用,此外大米蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)(1 270 cm-1)和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)(1 289 cm-1)之間存也在著較強(qiáng)的分子內(nèi)相互作用。

圖3 大米蛋白質(zhì)酰胺Ⅲ帶νamide-Ⅲ-rice同步2D-IR光譜(1 200～1 330 cm-1)

2.3.2 異步2D-IR光譜研究

在1200～1330 cm-1頻率范圍內(nèi),進(jìn)一步開展了大米蛋白質(zhì)酰胺Ⅲ帶νamide-Ⅲ-rice異步2D-IR光譜研究(圖4),相關(guān)光譜數(shù)據(jù)及解釋見表3。

圖4 大米蛋白質(zhì)酰胺Ⅲ帶νamide-Ⅲ-rice異步2D-IR光譜(1200～1330 cm-1)

表3 大米蛋白質(zhì)酰胺Ⅲ帶νamide-Ⅲ-rice的2D-IR光譜數(shù)據(jù)及解釋

根據(jù)NODA原則[17-19]和表3數(shù)據(jù)可知,隨著測定溫度的升高,大米蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)紅外吸收峰變化快慢順序依次為：1 306 cm-1(α-螺旋結(jié)構(gòu))＞ 1 270 cm-1(無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu))＞ 1 289 cm-1(β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu))＞ 1 214 cm-1(β-折疊結(jié)構(gòu))。研究結(jié)果說明,大米蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中的α-螺旋結(jié)構(gòu)對于溫度比較敏感,隨著溫度的升高,其結(jié)構(gòu)最先被破壞,而大米蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中的β-折疊結(jié)構(gòu)則相對較為穩(wěn)定。

3 結(jié)論

開展了大米蛋白質(zhì)酰胺 Ⅲ 帶的三級紅外光譜研究。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：在1 200～1 330 cm-1頻率范圍內(nèi),大米蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)主要包括：α-螺旋結(jié)構(gòu)(1 306 cm-1)、無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)(1 270 cm-1)、β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)(1 289 cm-1)和 β-折疊結(jié)構(gòu)(1 214 cm-1)。隨著測定溫度的升高,大米蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,其熱穩(wěn)定性進(jìn)一步降低。本文拓展了三級紅外光譜在大米蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及熱穩(wěn)定性的研究范圍,具有重要的理論研究價(jià)值。