警犬狂犬病血清中和抗體調查

杜曉鵬 毛愛國 徐 陶 王翠萍 謝寶澤 張明飛 王 雄 黨西鋒 卓丙德 蔣輝軍 朱文靜 張俊森

狂犬?。≧abies）是由狂犬病病毒（Rabies virus，RABV）感染引起的一種致死性人獸共患病，病死率幾乎高達100%。目前，對狂犬病尚無有效的治療方法，及時接種疫苗是預防狂犬病的最有效措施之一。

全世界所有報告的動物狂犬病病例中約有95%是在犬，超過90%的人死亡歸因于狂犬病犬，大規(guī)模疫苗接種是犬狂犬病防治的主要方法。犬的狂犬病免疫覆蓋率低于70%是誘發(fā)人間狂犬病發(fā)生的主要原因，2017年全國共報告502例人狂犬病死亡病例，狂犬病疫情呈整體下降趨勢，但是我國西南地區(qū)的廣西、云南、四川和貴州四省依然是我國人和動物狂犬病高發(fā)省份，僅華南地區(qū)的海南省為我國低發(fā)省份。

為了解我國南方地區(qū)的警犬狂犬病疫苗免疫效果，分析影響警犬免疫合格率的因素，2017～2018年對西南地區(qū)狂犬病高發(fā)省份廣西、云南、四川和貴州，以及華南地區(qū)低發(fā)省份海南省五省部分地區(qū)警犬狂犬病血清中和抗體進行調查，隨機抽樣342頭警犬，有效樣本342份，采用熒光抗體病毒中和試驗（FAVN），檢測血清中RABV血清中和抗體效價。

一、調查對象

根據(jù)抽樣地區(qū)警犬工作布局情況，選取云南、貴州、四川、廣西、海南五省部分地區(qū)進行抽樣。按照7月齡以上訓練犬與工作犬總數(shù)量的10%進行抽樣：每個性別組按照10%的比例進行間隔抽樣；當超過20頭時，可按照隔2抽1、隔3抽1的原則抽樣，以此類推。共選取警犬342頭，為訓練犬和工作犬，身體健康。

（一）范圍

云南選取昆明、楚雄某訓練場56頭警犬，貴州選取貴陽某訓練場60頭警犬，四川選取成都、綿陽、德陽、瀘州四個訓練場71頭警犬，廣西選取南寧、桂林、梧州、玉林93頭警犬，海南選取?？凇⑷齺?、萬寧、陵水、保亭、瞻洲、澄邁等62頭警犬，總共342頭。

（二）警犬免疫程序與免疫覆蓋率

1. 警犬免疫程序 3月齡時進行1次狂犬病滅活疫苗注射，以后每年注射1次；1歲以上的犬，每年進行1次狂犬病滅活疫苗注射。5個?。▍^(qū)）都對轄區(qū)單位開展警犬訓練培訓工作，幼犬在6月齡左右進行訓練，3～6月后訓練結束，由上述訓練單位調至新的工作單位，狂犬病免疫程序并入新單位的年度免疫。

疫苗：云南、貴州選用疫苗為A品牌（Pasteur RIV株，至少2IU），定義為A組；四川選用B品牌（HCP-SAD株，滅活前不少于106.3FAID50/mL），定義為B組；南寧、桂林、玉林均使用A疫苗；梧州使用A疫苗、B疫苗和C疫苗（Rb/E3株≥105.0LD50/0.03ml）、D疫苗（G52株，每頭份至少為1IU），后兩種疫苗分別定義為C組、D組。

2. 經(jīng)查閱檔案調查，南方5省的警犬狂犬病疫苗免疫覆蓋率為100%。

（三） 檢測犬種 包括德國牧羊犬、馬里努阿犬、昆明犬、羅威納犬、拉布拉多犬、史賓格犬、尋血獵犬、維茲拉犬與昆馬雜交犬，按照中國工作犬管理協(xié)會的犬種分組表，將檢測犬分為大型犬（55cm以上）、中型犬（35.1-54.9cm）與小型犬（35cm以下）。本研究中德國牧羊犬、馬里努阿犬、昆明犬、羅威納犬、尋血獵犬與昆馬雜交犬屬于大型犬，拉布拉多犬、史賓格犬與維茲拉犬屬于中型犬。

（四） 采樣 2016～2018年完成南方5省的警犬采樣工作，檢測犬覆蓋了上述地區(qū)所有訓練犬與工作犬，檢測犬的采樣時間為最近一次免疫后28天的各個時間段，所有數(shù)據(jù)均為橫斷面采集。

二、 材料與方法

（一）待檢血清：在警犬狂犬病滅活疫苗免疫后28天，從待檢犬前肢頭靜脈采血至少3mL，靜置2小時，1500rmp/min離心30min，分離血清，冷凍保存或冷鏈運輸至實驗室，備用。出現(xiàn)溶血需重新采取血樣并分離血清。

（二）檢測試劑

1.標準血清：購自法國歐盟狂犬病血清學參考實驗室，效價為5.92IU/mL。

2. 陰性血清：采集自未免疫健康犬，由軍事獸醫(yī)研究所世界動物衛(wèi)生組織（OIE）狂犬病參考實驗制備。

3.熒光抗體：FITC熒光素標記的抗狂犬病病毒核蛋白單克隆抗體購自Fujiribio公司。

4. 狂犬病病毒CVS-11細胞毒：軍事獸醫(yī)研究所保存，滴度為106.67TCID50/mL。

（三）檢測方法

1. 樣本處理：待檢血清分別在56℃滅活30min。

2. 檢測：采用OIE《陸生動物診斷測試和免疫手冊》2013版直接免疫熒光病毒中和試驗（FAVN）對待檢血清中RABV中和抗體效價進行檢測。首先對標準血清和待檢血清進行3倍梯度稀釋，稀釋區(qū)域第1列各孔內預先加入100μL培養(yǎng)液，每孔加入血清50μL，混勻后吸取50μL加入第2列，依此稀釋。取預先確定滴度的狂犬病病毒CVS-11，以MEM培養(yǎng)液稀釋至30-300TCID50/50μL，除細胞及培養(yǎng)液對照孔外每孔加入50μL，置37℃中和60min。BHK-21細胞經(jīng)胰酶消化、分散、計數(shù)，稀釋至4×105/mL，除培養(yǎng)液對照孔外每孔加入50μL細胞懸液，于37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。棄細胞培養(yǎng)上清，加入50μL冷丙酮-20℃固定細胞1h，PBST洗滌后，將狂犬病病毒核蛋白熒光抗體稀釋至工作濃度，每孔加入50μL工作液，37℃孵育1h。PBST洗滌，熒光顯微鏡下觀察每個孔，孔內有熒光細胞即記為感染，為陽性；無熒光細胞為完全中和，為陰性?；赟pearman-Karber公式的推導公式計算待檢血清RABV中和效價。

以犬免疫后血清RABV中和抗體效價≥0.50IU/mL為陽性標準，達到或超過0.50IU/mL即具有效保護水平。

（四）統(tǒng)計學分析

檢測數(shù)據(jù)采用SPSS18.0及Excel2007進行分析處理。

表1 342頭警犬RABV中和抗體檢效價檢測結果

表2 不同年齡的警犬RABV中和抗體效價檢測結果

表3 不同免疫次數(shù)的警犬RABV中和抗體效價檢測結果

三、結果與分析

（一） 342頭警犬RABV中和抗體效價檢測結果，見表1。342頭警犬中和抗體陽性230頭，整體免疫合格率為67.25%。其中，四川地區(qū)免疫合格率最高，為76.06%；云南最低，為57.14%。分析顯示：四川的免疫合格率與云南、廣西、貴州3個地區(qū)免疫合格率之間差異顯著（P＜0.05），與海南之間差異不顯著。

表4 不同疫苗免疫的警犬RABV中和抗體效價檢測結果 單位：份

表5 不同體型的警犬RABV中和抗體效價檢測結果

表6 不同性別的警犬RABV中和效價檢測結果

（二） 不同年齡的警犬RABV中和抗體效價檢測結果，見表2。將342頭警犬分成3～6月齡犬、7～12月齡、13～24月齡、2～6歲、6歲以上5個年齡組，各個年齡段的免疫合格率分別為56.14%、39.13%、68.42%、76.80%、78.95%。分析表明：1歲以上的犬免疫合格率明顯高于1歲以下犬，它們之間差異極顯著（P＜0.01）；7～12月齡犬的免疫合格率明顯低于其他年齡段的犬，差異極顯著（P＜0.01）。

（三） 不同免疫次數(shù)的警犬RABV中和抗體效價檢測結果，見表3。對342頭警犬，按照不同的免疫次數(shù)進行分組，數(shù)據(jù)顯示：免疫1次以上的警犬免疫合格率明顯高于免疫1次的警犬，免疫1次的警犬合格率僅為49.60%。分析顯示，免疫1次的免疫合格率與免疫2～3次之間差異極顯著（P＜0.01），免疫1次的免疫合格率與免疫4次及4次以上之間差異極顯著（P＜0.01）。

（四） 不同疫苗免疫的警犬RABV中和抗體效價檢測結果，見表4。結果顯示：云南、貴州、廣西和海南大多選用A組疫苗，四川選用B組疫苗；廣西梧州個別單用選用C組與D組疫苗，警犬數(shù)量分別為2頭與1頭，不具有統(tǒng)計學意義，對于C組與D組疫苗的免疫效果不做分析。分析發(fā)現(xiàn)：云南、貴州、廣西和海南使用的A組疫苗，免疫合格率為65.53%，四川選用的B組疫苗免疫，合格率為76.06%，高于云南、貴州、廣西和海南的免疫效果，A組疫苗和B組疫苗之間差異顯著（P＜0.05）。

（五） 不同體型犬種的警犬RABV中和抗體效價檢測結果，見表5。本次檢測警犬為中型犬和大型犬，從結果看出：中型犬的免疫合格率為65.12%，大型犬的免疫合格率為67.97%，兩者之間差異不顯著（P＞0.05），說明在中型犬與大型犬中，體型大小對免疫合格率無影響。

（六） 不同性別的警犬RABV中和抗體效價檢測結果，見表6。結果顯示：檢測的公犬與母犬，其免疫合格率為67.37%（128/190），母犬的合格率為67.11%（102/152），兩者之間沒有差異，說明警犬的性別對狂犬病疫苗免疫合格率沒有影響。

（七） 不同采樣時間的警犬RABV中和抗體效價檢測結果。342頭警犬的采樣時間分別為最后一次免疫后的14d、34d、60d、90d、120d、180d、270d、300d、330d和360d，其免疫合格率見表7。在免疫后14d內采樣，其免疫合格率可以達到92.86%（13/14）；而在免疫后90d采樣，其免疫合格率將出現(xiàn)下降，說明在免疫后90d，血清中和抗體將出現(xiàn)下降趨勢。

表7 不同采樣時間的警犬RABV中和效價檢測結果

四、 討論

（一）本次檢測通過橫斷面數(shù)據(jù)分析云南、貴州、四川、廣西和海南五省部分地區(qū)警犬的RABV中和抗體水平，342頭檢測警犬，陽性230份，免疫合格率為67.25%。說明警犬的狂犬病疫苗免疫效果無法達到100%的保護作用，需加強南方五省警犬狂犬病疫苗接種工作。

（二） 在我國狂犬病高發(fā)省份與低發(fā)省份，按照現(xiàn)行的警犬狂犬病疫苗免疫程序，其免疫合格率接近，沒有出現(xiàn)與國內狂犬病疫情流行相似的規(guī)律。說明對犬進行狂犬病疫苗接種，可保證犬的免疫合格率，應繼續(xù)加強對警犬的狂犬病疫苗接種工作。

（三） 警犬的免疫合格率與年齡成正相關。本次檢測1歲以下的警犬免疫合格率39.13～56.14%，1歲以上的均超過70%。這與Kennedy等人的研究結果相同，年齡較小的犬由于免疫系統(tǒng)不健全，接種疫苗的效果較差。

（四） 警犬的免疫合格率與免疫次數(shù)密切相關。本次檢測將免疫次數(shù)分為免疫1次、免疫2～3次、免疫4次及以上3個組別，其免疫合格率分別為49.60%、78.49%、77.05%。數(shù)據(jù)顯示：免疫2次及以上的警犬免疫合格率明顯高于免疫1次（P＜0.01），說明免疫次數(shù)越多，免疫合格率越高。Tk S的調查顯示，連續(xù)多次接種狂犬病疫苗的犬比只接種1次疫苗的犬具有更好的抗體滴度。

（五）對于大型犬與中型犬，警犬的體型大小對免疫合格率影響不大。本次檢測中，沒有出現(xiàn)小型犬，檢測的大型犬與中型犬的免疫合格率分別為67.97%、65.12%，兩者之間差異不顯著；檢測犬種僅出現(xiàn)1頭雜交犬（大型犬），其檢測結果不具備統(tǒng)計學意義。據(jù)Berndtsson LT等人報道，中大型純種犬免疫效果不如小型犬或雜交犬，體型較小的犬比體型較大的犬能產(chǎn)生更高的抗體水平。這可能的原因是相同劑量的疫苗，體型越小，抗體反應就越強。

（六）警犬的性別對免疫合格率沒有影響。本次檢測結果與Mansfield KL等人、JAKEL等人的研究結果一致，說明犬的性別對抗體應答沒有影響。

（七） 不同種類的疫苗種對免疫合格率有影響。不同種類疫苗，免疫合格率之間存在差異，這是否與疫苗毒株型，以及抗原含量、所用佐劑的濃度和完整性有關，需要進一步實驗驗證。

（八） 不同采樣時間對免疫合格率的影響。本次橫斷面的數(shù)據(jù)顯示，在免疫后不同時間采樣，免疫合格率存在明顯差異。免疫后14d內采樣，其免疫合格率可達92.86%，而在免疫后90d采樣，免疫合格率將出現(xiàn)下降趨勢。Kennedy 報道了在免疫后30d采樣，免疫合格率最高，隨著采樣時間的延續(xù)，未達到抗體應答點的犬的比例也在增加。據(jù)報道，F(xiàn)AVN的最高通過率出現(xiàn)在犬接種后1～4周，這與本次檢測結果相似。

（九） 免疫失敗是導致免疫合格率低的重要原因。本次檢測中，某警犬訓練單位的10頭3～7歲的全部檢測警犬，檢測結果均低于0.50IU/mL，這對整個抽檢地區(qū)的檢測結果造成影響。有研究證明：犬的中和抗體水平與免疫次數(shù)成正比，免疫次數(shù)越多，抗體水平越高。按照規(guī)定的警犬免疫程序至少有3～7次的狂犬病疫苗接種史，結果不應該全部不合格。低水平的不合格檢測結果說明：該單位過去幾年的狂犬病免疫屬于免疫失敗，應查找原因，盡快加強狂犬病疫苗接種。

五、 結論與建議

（一） 本次橫斷面數(shù)據(jù)分析顯示，我國南方五省警犬狂犬病防控工作存在不足，應加強狂犬病疫苗接種工作，杜絕免疫失??；狂犬病高發(fā)省份與低發(fā)省份的警犬狂犬病防控工作，沒有出現(xiàn)與國內狂犬病疫情流行相似的規(guī)律。警犬的免疫合格率與年齡成正相關，與免疫次數(shù)關系密切，免疫次數(shù)越多，免疫合格率越高；警犬的免疫合格率與采樣時間、疫苗種類有關，與犬的性別沒有關系；對于大型犬和中型犬，體型大小對免疫合格率影響不大。

（二） 隨著警犬社會化訓養(yǎng)工作的加強和“民犬警用”工作的延伸，應從警犬的“入口”加強狂犬病防控工作。據(jù)我們對云南某犬場社會化訓養(yǎng)區(qū)域農戶家養(yǎng)犬及散養(yǎng)犬、流浪犬的監(jiān)測，其血清中和抗體水平合格的不足20%，若該區(qū)域有狂犬病野毒存在，將威脅社會化訓養(yǎng)區(qū)域的警犬。

（三） 完善《警犬疾病防治工作規(guī)則》。其中規(guī)定“警犬3月齡時進行1次狂犬病滅活疫苗注射，以后每年注射1次”。本次調查，警犬在12月齡前免疫合格率普遍偏低，尤其是7～12月齡的警犬。作者在“云南某犬場犬狂犬病滅活疫苗免疫抗體效價評估”中，同樣發(fā)現(xiàn)12月齡以下警犬免疫合格率僅為9.68%。建議規(guī)則修改為“警犬3月齡時進行第1次狂犬病滅活疫苗注射，28天后進行第2次狂犬病滅活疫苗免疫，以后每年注射1次”。

（四） 規(guī)范警犬狂犬病滅活疫苗免疫工作，嚴格執(zhí)行公安部頒發(fā)的《警犬疾病防治工作規(guī)則》，包括疫苗的采購、運輸、保存及注射工作。

（五） 加強帶犬人員狂犬病的預防和保護工作，對每個新從業(yè)人員進行狂犬病防護知識培訓。

（六） 有條件的單位可以開展警犬狂犬病滅活疫苗免疫效果監(jiān)測工作，監(jiān)測方法包括：狂犬病抗體測試板、ELISA檢測法、熒光抗體病毒中和試驗（FAVN）等。