濮陽市涂陰肺結(jié)核患者采用利福平耐藥實時熒光定量核酸擴(kuò)增聯(lián)合T-SPOT.TB檢測的應(yīng)用效果

王明遠(yuǎn)，趙順現(xiàn)

（濮陽市第五人民醫(yī)院結(jié)核病科,河南 濮陽457000）

我國屬世界上結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一,據(jù)統(tǒng)計,我國結(jié)核病患病人數(shù)僅次于印度，高居全球第2位，防治形勢非常嚴(yán)峻[1]。以往臨床多通過從患者體液、血液、分泌物中分離出結(jié)核分支桿菌來診斷結(jié)核病，檢測方法包括分離培養(yǎng)法及涂片顯微鏡檢查法，其中分離培養(yǎng)法診斷靈敏度較高，但耗時較長；而涂片法診斷靈敏度較低，僅為30%~50%[2]。因此，既往結(jié)核病診斷方法已無法滿足臨床早期確診結(jié)核病的需要。利福平耐藥實時熒光定量核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)屬全自動分子診斷方法之一，此項技術(shù)是基于結(jié)核桿菌核酸擴(kuò)增為基礎(chǔ),故可有效提高對結(jié)核病的診斷靈敏度[3]。近些年,T-SPOT.TB開始逐漸被應(yīng)用于臨床檢測,使涂陰肺結(jié)核等結(jié)核病診斷取得較大突破。T-SPOT.TB是通過檢測外周血中特異性T淋巴細(xì)胞來明確結(jié)核分支桿菌感染的檢測方法，此種檢測方法診斷敏感性較高，尤其適用于結(jié)核病診斷，尤其對免疫功能低下患者具有較高敏感性,在目前臨床各類結(jié)核病診斷中備受關(guān)注[4]。本文選取涂陰肺結(jié)核患者126例,旨在探究濮陽市涂陰肺結(jié)核患者采用利福平耐藥實時熒光定量核酸擴(kuò)增聯(lián)合T-SPOT.TB檢測的應(yīng)用效果，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我市2015年3月-2017年12月涂陰肺結(jié)核患者126例設(shè)為研究組,均經(jīng)影像學(xué)檢查確診，排除免疫缺陷患者，其中女52例，男74例，年齡 21～82 歲，平均（55.47±10.23）歲；另選同期結(jié)核潛伏感染患者121例設(shè)為對照組,結(jié)核菌素試驗均呈陽性，胸部X線片檢測正常，具有結(jié)核病接觸史，排除免疫缺陷患者，其中女49例，男72例，年齡 22～83 歲，平均（54.68±9.41）歲，2 組臨床資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 T-SPOT.TB 采集靜脈血4 ml,置于真空采血管，迅速將其混勻，于2 h內(nèi)分離出外周血單個核細(xì)胞；以T-SPOT.TB試劑盒（購于上海逸峰生物科技有限公司）檢測結(jié)核菌致敏T細(xì)胞，且依據(jù)試劑盒上面說明進(jìn)行各項操作,以顯微鏡觀察陰性斑點數(shù),記錄所檢出的具有結(jié)核特異抗原致敏效應(yīng)的細(xì)胞數(shù)目。

1.2.2 利福平耐藥實時熒光定量核酸擴(kuò)增檢測 采集患者痰液進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基購于珠海貝索公司，以4%氫氧化鈉溶液進(jìn)行分離培養(yǎng)，將痰標(biāo)本置于處理管中，加入4%氫氧化鈉溶液且充分混勻，靜置15 min后以處理液均勻接種于培養(yǎng)基斜面上，觀察且記錄培養(yǎng)情況；檢測儀器購于美國Cepheid公司，取1 ml痰標(biāo)本與2 ml處理液并混勻，于渦旋震蕩器上震蕩25 s，靜置15 min后，取混合液2 ml置于一次性多室塑料反應(yīng)盒中,將反應(yīng)盒置于檢測模塊中，進(jìn)行自動化分析，2~3 h后讀取結(jié)果。

1.3 觀察指標(biāo) ⑴統(tǒng)計利福平耐藥實時熒光定量核酸擴(kuò)增檢測與T-SPOT.TB單一檢測及聯(lián)合檢測涂陰肺結(jié)核的結(jié)果;⑵比較利福平耐藥實時熒光定量核酸擴(kuò)增檢測與T-SPOT.TB單一檢測及聯(lián)合檢測涂陰肺結(jié)核的診斷效能。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 以SPSS 23.0處理，計數(shù)資料（診斷特異度、診斷靈敏度、診斷準(zhǔn)確度、陰性預(yù)測值、陽性預(yù)測值、誤診率、漏診率）以n（%）表示、卡方檢驗，檢驗標(biāo)準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 單一檢測及聯(lián)合檢測涂陰肺結(jié)核的結(jié)果 經(jīng)利福平耐藥實時熒光定量核酸擴(kuò)增檢測確診涂陰肺結(jié)核真陽性71例，經(jīng)T細(xì)胞酶聯(lián)免疫斑點試驗檢測確診涂陰肺結(jié)核真陽性73例，經(jīng)聯(lián)合檢測確診涂陰肺結(jié)核真陽性109例，見表1。

表1 單一檢測及聯(lián)合檢測涂陰肺結(jié)核的結(jié)果

2.2 單一檢測及聯(lián)合檢測涂陰肺結(jié)核的診斷效能利福平耐藥實時熒光定量核酸擴(kuò)增檢測與TSPOT.TB聯(lián)合檢測涂陰肺結(jié)核診斷特異度為97.52%、診斷靈敏度為86.51%、診斷準(zhǔn)確度為91.90%、陰性預(yù)測值87.41%、陽性預(yù)測值97.32%均較單一檢測高，誤診率2.48%、漏診率13.49%均較單一檢測低，約登指數(shù)較單一檢測高（P＜0.05），見表2。

表2 單一檢測及聯(lián)合檢測涂陰肺結(jié)核的診斷效能n（%）

3 討論

目前，在全球公共衛(wèi)生問題中，肺結(jié)核屬病死率最高傳染性疾病之一,且近些年隨全球人口老齡化情況日益加劇，肺結(jié)核發(fā)病率亦不斷攀升，極大影響患者身心健康及生活質(zhì)量[5-7]。目前，肺結(jié)核實驗室常規(guī)檢測方法為痰涂片,此種方法檢測時間較短，費用相對低廉，但診斷敏感性較低，尤其對標(biāo)本含菌量要求較高，易造成涂陰肺結(jié)核患者漏診。痰培養(yǎng)結(jié)核桿菌亦為涂陰肺結(jié)核診斷常用方法，但此種方法檢測周期較長，診斷敏感性亦較低，且對實驗室生物安全性要求較高,使其推廣受到極大限制。涂陰肺結(jié)核患者若不能及時確診，則會導(dǎo)致喪失最佳治療時機(jī)，致使其病情惡化發(fā)展，甚至危及其生命安全。因此，探尋一種早期發(fā)現(xiàn)及精準(zhǔn)迅速診斷涂陰肺結(jié)核方法，具有重要臨床意義。

利福平耐藥實時熒光定量核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)是集標(biāo)本處理、利福平耐藥基因rpoB突變檢測、結(jié)核桿菌特異核酸檢測、DNA提取、核酸擴(kuò)增為一體的結(jié)核病快速診斷方法，檢測過程僅需1.5 h，且可同時進(jìn)行利福平耐藥及結(jié)核分支桿菌檢測。此項技術(shù)被應(yīng)用于兒童結(jié)核病、縱隔淋巴結(jié)核、脊柱結(jié)核、結(jié)核性淋巴炎、結(jié)核性腦膜炎及結(jié)核性胸膜炎等疾病診斷,均表現(xiàn)出較高的靈敏度及特異度[8,9]。Moure R等[10]學(xué)者研究表明，采取利福平耐藥實時熒光定量核酸擴(kuò)增檢測涂片陰性培養(yǎng)的肺外結(jié)核標(biāo)本，診斷靈敏度為58.30%。利福平耐藥實時熒光定量核酸擴(kuò)增檢測對無菌體液標(biāo)本檢測敏感性較低，如對胸腔積液檢測敏感性僅為26.90%，但對非液體標(biāo)本檢測敏感性較高,如對膿腫穿刺物檢測敏感性為76.50%[11]。Vadwai V等[12]學(xué)者研究報道，采取利福平耐藥實時熒光定量核酸擴(kuò)增檢測肺外結(jié)核，診斷敏感性為80.57%。

當(dāng)機(jī)體感染結(jié)核分支桿菌時,體內(nèi)將產(chǎn)生及分泌結(jié)核相關(guān)性記憶T淋巴細(xì)胞,若二次遭受結(jié)核相關(guān)性抗原刺激時，則可轉(zhuǎn)化為效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，從而分泌IFN-γ，CFP-10及ESAT-6屬結(jié)核分支桿菌基因RD1區(qū)域rv3874及rv3875編碼的結(jié)核相關(guān)性蛋白抗原，能從結(jié)核感染患者T細(xì)胞中，介導(dǎo)產(chǎn)生較強(qiáng)IFN-γ釋放反應(yīng),依據(jù)上述原理設(shè)計產(chǎn)生的T-SPOT.TB技術(shù)逐漸成為目前臨床檢測結(jié)核病最主要診斷方法。近些年，T-SPOT.TB被廣泛應(yīng)用于艾滋病伴發(fā)結(jié)核、兒童結(jié)核病、肺外結(jié)核、活動性結(jié)核病、結(jié)核感染等疾病的輔助診斷，均獲得良好效果[13,14]。文獻(xiàn)表明，T-SPOT.TB檢測活動性結(jié)核病的診斷敏感性為53%～96%，診斷特異性為60%～85%[15]。但T-SPOT.TB檢測技術(shù)亦存在不足，如不能有效鑒別活動性結(jié)核病與結(jié)核潛伏感染,在結(jié)核潛伏感染高發(fā)地區(qū)可能會導(dǎo)致診斷特異性偏低，因此不能僅憑T-SPOT.TB來診斷涂陰肺結(jié)核。利福平耐藥實時熒光定量核酸擴(kuò)增檢測與T-SPOT.TB聯(lián)合檢測涂陰肺結(jié)核患者,能互相彌補彼此的不足，進(jìn)而顯著提高診斷準(zhǔn)確率。本文可知，聯(lián)合檢測涂陰肺結(jié)核診斷特異度為97.52%、診斷靈敏度為86.51%、診斷準(zhǔn)確度為91.90%、陰性預(yù)測值87.41%、陽性預(yù)測值97.32%高于單一檢測，誤診率2.48%、漏診率13.49%低于單一檢測，約登指數(shù)較單一檢測高（P＜0.05）。可見，利福平耐藥實時熒光定量核酸擴(kuò)增檢測與T-SPOT.TB聯(lián)合檢測涂陰肺結(jié)核患者，能有效提高診斷特異度、診斷靈敏度及診斷準(zhǔn)確率，降低誤診率及漏診率，且能為臨床擬定治療方案提供依據(jù)。

綜上,利福平耐藥實時熒光定量核酸擴(kuò)增檢測與T-SPOT.TB聯(lián)合檢測,可顯著提高涂陰肺結(jié)核患者的診斷效能,有助于涂陰肺結(jié)核患者早期診斷及臨床控制。