TFF3、TPX2、WIP1、Ang2 表達(dá)水平變化與甲狀腺結(jié)節(jié)患病的關(guān)系

尹洪濤 ，古君 ，郭向陽 ，李英昭 ，陳秋

(1.信陽市中心醫(yī)院，河南 信陽 464000；2.信陽市淮濱縣衛(wèi)生學(xué)校，河南 信陽 464400；3.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院)

甲狀腺結(jié)節(jié)與甲狀腺乳頭狀癌的鑒別診斷對臨床上治療方案的確定及治療效果和預(yù)后具有重要作用[1]。目前較多的研究報(bào)道已經(jīng)明確VEGF、MMP-9等在甲狀腺乳頭狀癌組織中較高的染色陽性率[2]。TFF3是呈三葉草結(jié)構(gòu)的小分子多肽，有研究報(bào)道其含量與乳腺癌、食管癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，較少的報(bào)道其與甲狀腺乳頭狀癌的關(guān)系[3]。TPX2是被證實(shí)的與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、凋亡、周期等密切相關(guān)的微管相關(guān)蛋白，可反映腫瘤的增殖能力、分化能力，凋亡失衡，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖分化[4]。WIP1是具有絲/蘇氨酸活性的磷酸蛋白酶[5]。有研究報(bào)道[6]其濃度與乳腺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，很少報(bào)道其水平變化與不同類型甲狀腺結(jié)節(jié)的相關(guān)性。本文檢測 TFF3、TPX2、WIP1、Ang2 在不同類型甲狀腺結(jié)節(jié)中的表達(dá)情況,并比較表達(dá)的陽性率與腫瘤大小、是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床特征的相關(guān)性。旨在為甲狀腺結(jié)節(jié)及甲狀腺乳頭狀癌的鑒別診斷提供科學(xué)依據(jù)。現(xiàn)報(bào)告如下。

1.1 一般資料 隨機(jī)選取2016年1月－2017年1月我院甲狀腺手術(shù)切除標(biāo)本306例,經(jīng)病理證實(shí)分類，結(jié)節(jié)性甲狀腺腫56例、甲狀腺腺瘤95例、乳頭狀癌79例、濾泡癌41例、髓樣癌15例、未分化癌20例，患者中男性104例，女性202例，年齡為26歲～75歲，平均年齡為(45.56±9.12)歲；甲狀腺惡性腫瘤經(jīng)術(shù)后病理學(xué)檢查，腫瘤直徑≥2.0cm者78例，腫瘤直徑＜2.0cm者77例，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者57例，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者98例。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者臨床資料完整；術(shù)前未接受放化療；患者及家屬知情同意,均簽署知情同意書且經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：伴有心、肝、腎等主要臟器功能不全；伴有其他部位惡性腫瘤者；妊娠期和哺乳期婦女；伴有免疫系統(tǒng)疾病。

1.2 檢測指標(biāo) 取術(shù)后切除的甲狀腺結(jié)節(jié)組織，大小約為0.5cm×0.5cm×0.5cm,常規(guī)制作石蠟切片，采用免疫組化 SP 法檢測 TFF3、TPX2、WIP1、Ang2 蛋白表達(dá)。

1.3 檢測方法 采用石蠟進(jìn)行連續(xù)性切片，脫蠟至水后采用H2O2室溫下孵育10min，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次3～5min，8%的蛋白粉封閉液（商品名：BSA購自南京博奧生物科技公司），封閉2h，倒去封閉液后加入一抗(兔來源 濃度1：1000～1500)，4℃冰箱過夜,磷酸鹽緩沖液沖洗3次,每次3～5min,加入二抗(鼠來源濃度 1：400～500),室溫孵育20～30min,磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次3～5min，加入辣根酶或堿性磷酸酶的標(biāo)記物，室溫孵育10min，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次3～5min，滴加顯色劑（DAB購自南京博奧生物科技公司），復(fù)染，脫水，封片。

1.4判定標(biāo)準(zhǔn) 以細(xì)胞膜內(nèi)出現(xiàn)棕黃色的顆粒為陽性染色,綜合陽性細(xì)胞數(shù)占瘤細(xì)胞比例和著色強(qiáng)度進(jìn)行半定量判定。 TFF3、TPX2、WIP1、Ang2 蛋白表達(dá)著色強(qiáng)度判定標(biāo)準(zhǔn)：不著色為0分；淺黃色為1分；黃棕色為2分；棕褐色為3分。陽性細(xì)胞數(shù)占瘤細(xì)胞比例判斷標(biāo)準(zhǔn)：選擇5～10個高倍視野,計(jì)算1000個腫瘤細(xì)胞中陽性細(xì)胞的百分率，陽性細(xì)胞數(shù)<5%為0分；5%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；>75%為4分。2種評分相加，最終結(jié)果 0～1 分為陰性(-)；2 分為陽性(+)；3～4 分為強(qiáng)陽性(++)；5～7 分為極強(qiáng)陽性(+++)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件，各類甲狀腺結(jié)節(jié)、不同直徑癌組織、是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,癌組織間各蛋白表達(dá)強(qiáng)度比較采用Wileoxon秩和檢驗(yàn),組間各蛋白弱表達(dá)與強(qiáng)表達(dá)組織數(shù)量比較采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 甲狀腺結(jié)節(jié)組織TFF3蛋白表達(dá) 表1、表2結(jié)果顯示：在甲狀腺腫組織中，TFF3蛋白表達(dá)弱，在甲狀腺腺瘤組織中呈中等強(qiáng)度表達(dá),而在甲狀腺癌組織中陽性至強(qiáng)陽性表達(dá)率高達(dá)80.65%，三組表達(dá)強(qiáng)度分布有顯著性差異（P<0.01）。在甲狀腺癌組織中，腫瘤直徑＞2cm組TFF3蛋白表達(dá)強(qiáng)于≤2cm組，發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移患者癌組織TFF3蛋白表達(dá)強(qiáng)于未發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移患者癌組織,差異均有顯著性（P<0.01）。

表1 各類甲狀腺結(jié)節(jié)組織TFF3蛋白表達(dá)比較

表2 不同類型甲狀腺癌組織TFF3蛋白表達(dá)比較

表3 各類甲狀腺結(jié)節(jié)組織TPX2蛋白的表達(dá)比較

表4 不同類型甲狀腺癌組織TPX2蛋白表達(dá)比較

表5 各類甲狀腺結(jié)節(jié)組織WIP1蛋白的表達(dá)比較

2.2 甲狀腺結(jié)節(jié)組織TPX2蛋白表達(dá) 表3、表4結(jié)果顯示：不同性質(zhì)的甲狀腺結(jié)節(jié)組織TPX2蛋白陽性表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。臨床因素分析表明，TPX2蛋白表達(dá)與甲狀腺癌腫瘤大小及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有相關(guān)性（P<0.01）。

2.3 甲狀腺結(jié)節(jié)組織WIP1蛋白表達(dá) 表5、表6結(jié)果顯示：不同性質(zhì)的甲狀腺結(jié)節(jié)組織WIP1蛋白陽性表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。臨床因素分析表明，WIP1蛋白表達(dá)僅與甲狀腺癌腫瘤大小有關(guān)（P<0.01），而與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)。

2.4 甲狀腺結(jié)節(jié)組織Ang2蛋白表達(dá) 表7、表8結(jié)果顯示：不同性質(zhì)的甲狀腺結(jié)節(jié)組織Ang2蛋白陽性表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。臨床因素分析表明，Ang2蛋白表達(dá)僅與甲狀腺癌腫瘤大小有關(guān)（P<0.01），而與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)。

表6 不同類型甲狀腺癌組織WIP1蛋白表達(dá)比較

表7 各類甲狀腺結(jié)節(jié)組織Ang2蛋白的表達(dá)比較

表8 不同類型甲狀腺癌組織Ang2蛋白表達(dá)比較

3 討論

目前，已經(jīng)有報(bào)道證明［7］MMP-9、VEGF 與腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲有密切聯(lián)系，并有報(bào)道證實(shí)[8]MMP－9、VEGF在甲狀腺乳頭狀癌組織中高表達(dá)。張寅等[9]通過免疫組織化學(xué)法發(fā)現(xiàn)甲狀腺乳頭狀癌患者組織中PCNA具有較高的染色陽性率。研究能生物標(biāo)志物以鑒別診斷甲狀腺腫瘤的良性與否對治療方案的確定及預(yù)后至關(guān)重要。

TFF3是哺乳動物TFF家族中三個成員之一，呈三葉草形態(tài)的小分子多肽?？梢种起つさ蛲?，具有黏膜保護(hù)和修復(fù)作用。促進(jìn)腫瘤擴(kuò)散。有報(bào)道證實(shí)其水平變化與乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[10]。 吳靖芳等報(bào)道［11］TFF3在甲狀腺乳頭狀癌患者與甲狀腺乳頭狀腺瘤中表達(dá)水平具有顯著差異。PTC組織中TFF3蛋白、mRNA陽性表達(dá)率高于腺瘤、良性腫瘤伴增生。且其含量與腫瘤分期有關(guān)，董猛等［12］報(bào)道，III/IV期甲狀腺乳頭狀腫瘤患者TFF3表達(dá)水平高于I/II期患者,本研究結(jié)果顯示 TFF3、TPX2、WIP1、Ang2 蛋白在甲狀腺腫、甲狀腺瘤和甲狀腺癌三組間表達(dá)強(qiáng)度均有顯著差異（P<0.01）。TFF3、TPX2蛋白表達(dá)與腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<0.01）,與陳勇華等報(bào)道一致［13］。說明，TFF3可作為甲狀腺結(jié)節(jié)與甲狀腺乳頭狀癌的鑒別診斷依據(jù)，且能評估臨床分期，細(xì)化診斷結(jié)果。TPX2是微管相關(guān)蛋白，在有絲分裂尤其是紡錘體形成過程中作用顯著。劉世強(qiáng)等報(bào)道［14］TPX2表達(dá)水平與胃癌、食管癌等表達(dá)密切相關(guān)。TPX2異常表達(dá)，可導(dǎo)致中心體異常擴(kuò)增，異倍體形成，細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化發(fā)生，促進(jìn)細(xì)胞增殖，與腫瘤細(xì)胞的周期、凋亡、分化、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)密切相關(guān)。本文顯示 TFF3、TPX2、WIP1、Ang2 蛋白在甲狀腺腫、甲狀腺瘤和甲狀腺癌三組間表達(dá)強(qiáng)度均有顯著差異（P<0.01）。提示，TPX2標(biāo)志甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的增殖能力,反映細(xì)胞分化和凋亡失衡狀態(tài),促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)現(xiàn)。TPX2可使腫瘤凋亡通路抑制，腫瘤細(xì)胞凋亡受阻。WIP1是具有絲/蘇氨酸活性的蛋白磷酸酶，有研究報(bào)道其與乳腺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。Joe Y等［15］利用免疫組化法和PCR擴(kuò)增技術(shù)發(fā)現(xiàn),甲狀腺乳頭狀癌組織及正常甲狀腺組織高表達(dá)共濟(jì)失調(diào)-毛細(xì)血管擴(kuò)張突變基因chk2，其磷酸化組織腫瘤發(fā)生，甲狀腺乳頭狀癌組織中高表達(dá)的WIP1與chk2結(jié)合,去磷酸化,促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展。本文顯示TFF3、TPX2、WI P1、Ang2蛋白在甲狀腺腫、甲狀腺瘤和甲狀腺癌三組間表達(dá)強(qiáng)度均有顯著差異（P<0.01）。提示，WIP1在甲狀腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、周期中起重要作用,在甲狀腺乳頭狀癌患者組織中高表達(dá)。腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)與新生血管的形成密不可分。新生血管的形成不僅為腫瘤的生長提供營養(yǎng),并且新生血管壁薄弱，基底膜不完整，為腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移提供條件。Ang包含Ang1、Ang2、Ang3、Ang4四個成員,其中前兩種與新生血管的形成關(guān)系密切。Ang2作為一種分泌型糖蛋白,常以同源二聚體形式存在，是腫瘤誘導(dǎo)新生血管形成的早期標(biāo)志。本文顯示：TFF3、TPX2、WIP1、Ang2蛋白在甲狀腺腫、甲狀腺瘤和甲狀腺癌三組間表達(dá)強(qiáng)度均有顯著差異 （P＜0.01）。且WIP1、Ang2蛋白表達(dá)僅與腫瘤大小有關(guān) （P＜0.01），而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)（P＞0.05）。 說明，Ang2表達(dá)水平在甲狀腺乳頭狀癌與甲狀腺結(jié)節(jié)患者表達(dá)差異顯著，前者顯著高于后者，可作為鑒別診斷的依據(jù)。

綜上所述 TFF3、TPX2、WIP1、Ang2 蛋白的免疫組化檢測有助于判別甲狀腺結(jié)節(jié)性質(zhì)。旨在為甲狀腺結(jié)節(jié)的臨床鑒別診斷提供科學(xué)依據(jù)。