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    PAIP1在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及臨床意義

    2020-04-24 12:26:18鄭劍鋒楊峻李金平楊小潔邵文華秘思思
    關(guān)鍵詞:肝細(xì)胞免疫組化肝癌

    鄭劍鋒 ,楊峻 ,李金平 ,楊小潔 ,邵文華 ,秘思思

    ((1.深圳市寶安區(qū)中心醫(yī)院/深圳大學(xué)第五附屬醫(yī)院,廣東 深圳 518102;2.桂林醫(yī)學(xué)院,廣西 桂林 541004)

    肝細(xì)胞癌 (hepatocellular carcinoma,HCC),簡(jiǎn)稱肝癌,是全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一。中國(guó)作為肝癌高發(fā)地區(qū),多年來發(fā)病率、死亡率居高不下,嚴(yán)重地威脅著人民的健康。全球每年新增病例約85萬例,死亡病例約80萬例,我國(guó)的新增病例與死亡病例約占全球總數(shù)的一半以上[1-5],其中,20~39歲的年輕患癌人群中死亡率最高的是肝癌[6]。肝癌發(fā)生的分子機(jī)制是研究熱點(diǎn),Poly(A)結(jié)合蛋白相互作用蛋白1(Poly(A)binding protein interacting protein 1,PAIP1)在蛋白質(zhì)翻譯起始過程中發(fā)揮作用,已有研究發(fā)現(xiàn)PAIP1參與乳腺癌[7]、胰腺癌[8]、胃癌[9]等腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程,但PAIP1在肝癌中的作用目前尚不明了。本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫組化等技術(shù)檢測(cè)肝癌臨床標(biāo)本中PAIP1的表達(dá)水平,分析PAIP1表達(dá)水平與肝癌患者臨床特征之間的關(guān)系。

    1 資料與方法

    1.1 組織標(biāo)本 22例新鮮組織標(biāo)本,為2017年6月-2017年12月在桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肝膽外科手術(shù)切除的肝細(xì)胞癌組織 (術(shù)后均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)),每例均包括肝細(xì)胞癌組織及距癌灶距離不少于2cm的無瘤正常肝組織。術(shù)中切除后半小時(shí)內(nèi)立即投入液氮罐中,隨后放入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩0?0例病例的組織芯片購自上海芯超生物科技有限公司。本研究患者知情同意,同時(shí)通過醫(yī)院倫理委員會(huì)備案。

    1.2 PAIP1表達(dá)水平檢測(cè) 依照Invitrogen公司的Trizol試劑操作說明書進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞及肝癌組織RNA提取,根據(jù)Promega公司M-MLV操作說明書進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,采用兩步法進(jìn)行Real-Time PCR反應(yīng),引物序列見表1,目的基因的表達(dá)水平采用Ct值比較法[10,11]。使用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白,酶標(biāo)儀BCA法測(cè)蛋白濃度,將蛋白濃度調(diào)至合適濃度,變性處理后8%聚丙烯酰胺凝膠電泳,250 mA電流半干轉(zhuǎn)至NC膜。室溫下5%脫脂奶粉封閉30min。用小鼠抗PAIP1的一抗(1:1 000)4℃過夜,PBST洗膜,用羊抗小鼠二抗 (1∶2000)孵育 2h,PBST洗膜,ECL發(fā)光顯影檢測(cè)PAIP1在蛋白水平的表達(dá)情況。

    表1 PCR引物序列

    1.3 組織芯片PAIP1免疫組化檢測(cè) PAIP1抗體稀釋比例為 1:6000,以 PBS做陰性對(duì)照,免疫組織化學(xué)采用SP法進(jìn)行免疫組化檢測(cè),使用肝細(xì)胞癌組織芯片進(jìn)行實(shí)驗(yàn),對(duì)癌組織和癌旁組織(上皮)分別進(jìn)行產(chǎn)生的所有PAIP1抗體胞漿表達(dá)的原始實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行判讀,判讀PAIP1胞漿染色的染色強(qiáng)度(0/1+/2+/3+)和染色陽性率。

    1.4 PAIP1預(yù)后在線數(shù)據(jù)分析 基于在線數(shù)據(jù)庫分析PAIP1與HCC預(yù)后的關(guān)系。登陸數(shù)據(jù)庫首頁:(http://kmplot.com/analysis/index.php p=service&cancer=liver_rnaseq),輸入基因PAIP1,設(shè)定參數(shù),對(duì)應(yīng)的隨訪數(shù)據(jù)納入病例322例。

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism6.0版軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。定量數(shù)據(jù)用t檢驗(yàn),定性數(shù)據(jù)用Wilcoxon檢驗(yàn),生存分析用Kaplan-Meier法,Logrank檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 癌組織中PAIP1mRNA的表達(dá)水平高于癌旁組織 與癌旁組織相比,22例病例中癌組織中PAIP1表達(dá)上調(diào)的有17例,變化不明顯的有3例,表達(dá)下調(diào)的有2例,配對(duì)t檢驗(yàn),P=0.0002,癌組織表達(dá)水平高于癌旁組織,見圖1。

    圖1 PAIP1在癌及癌旁組織中的表述水平

    2.2 PAIP1在肝癌細(xì)胞中表達(dá)水平增高 與正常肝細(xì)胞LO2相比,常見肝癌細(xì)胞系中,PAIP1在肝癌細(xì)胞系 SMMC7721、HepG2、Huh-7中的表達(dá)水平增高,結(jié)果見圖2。

    圖2 PAIP1蛋白在常見肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況

    2.3 組織芯片中癌組織PAIP1表達(dá)水平較癌旁組織增高 PAIP1蛋白在癌組織和癌旁組織的比較,癌組織中蛋白表達(dá)水平高于癌旁組織 (配對(duì)等級(jí)資料Wilcoxon檢驗(yàn),P=0.03),組織芯片免疫組化的典型圖片見圖3。

    圖3 組織芯片PAIP1的免疫組化典型圖片

    2.4 PAIP1表達(dá)水平與肝癌預(yù)后相關(guān) Kaplan-Meier Plotter在線預(yù)后分析顯示,PAIP1表達(dá)水平與患者OS(HR=1.79)相關(guān)(P=0.0013),見圖4。

    圖4 不同PAIP1表達(dá)水平的肝癌患者生存曲線

    3 討論

    HCC發(fā)生過程中的一個(gè)重要特征是蛋白質(zhì)翻譯過程的異常,表現(xiàn)為調(diào)控蛋白質(zhì)翻譯的重要信號(hào)途徑mTOR信號(hào)通路的異常及蛋白質(zhì)翻譯過程的重編程[12,13]。在蛋白質(zhì)翻譯起始過程中,翻譯起始過程是限速步驟,影響起始過程的因素對(duì)蛋白質(zhì)翻譯過程有重要作用。除翻譯起始因子外,Poly(A)結(jié)合蛋白相互作用蛋白1(Poly(A)binding protein interacting protein 1,PAIP1)的作用比較特殊,PAIP1 可與eIF3和eIF4A互作,形成Paip1-eIF3-eF4G和Paip1-PABP-eIF4G復(fù)合物,促進(jìn)了mRNA環(huán)形結(jié)構(gòu)的形成,迄今為止,人類中只發(fā)現(xiàn)PAIP1參與mR NA環(huán)化銜接,因此,PAIP1是蛋白翻譯起始必須因子[14,15]。已有研究發(fā)現(xiàn)PAIP1參與乳腺癌[7]、胰腺癌[8]、胃癌[9]等腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程,本研究發(fā)現(xiàn),PAIP1具有結(jié)合RNA的作用,可能在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用[16]。但PAIP1在肝癌中的作用目前尚不明了,因此,明確PAIP1在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程的作用及分子機(jī)制,可能為肝癌治療及預(yù)防提供新思路。

    本研究發(fā)現(xiàn),組織芯片中PAIP1蛋白在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織,生存分析表明,PAIP1低表達(dá)組的生存率高于PAIP1高表達(dá)組的生存率,提示PAIP1表達(dá)水平與病人預(yù)后相關(guān),PAIP1可能在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用。新鮮肝細(xì)胞癌組織PAIP1的mRNA表達(dá)水平高于在癌旁組織,肝細(xì)胞癌細(xì)胞系中PAIP1的蛋白表達(dá)水平也較正常肝細(xì)胞表達(dá)水平高。Real-time PCR檢測(cè)PAIP1 mRNA水平及免疫組化檢測(cè)PAIP1蛋白水平,結(jié)果均表明PAIP1在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織,提示PAIP1可能為肝細(xì)胞癌相關(guān)基因。

    本研究應(yīng)用免疫組化染色和RT-PCR方法,結(jié)合在線數(shù)據(jù)庫分析患者臨床資料及生存情況,發(fā)現(xiàn)PAIP1高表達(dá)是HCC一個(gè)不良預(yù)后因素,提示PAIP1可能成為一種新的分子治療靶點(diǎn)。為了進(jìn)一步揭示PAIP1在肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用及機(jī)制,下一步將在其他患者人群或擴(kuò)大樣本量加以驗(yàn)證。

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