碎米薺蛋白制備工藝及抗氧化活性

杜朝東 ，于 添 ，叢 欣 ，陳尚衛(wèi) ，朱 松 *

（1. 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇無錫 214122；2. 恩施德源健康科技發(fā)展有限公司，湖北 恩施445000）

硒是一種人類必須的微量元素，具有抗氧化［1～2］、抗腫瘤［3］、抗疲勞［4～5］和拮抗有害金屬［6］等生物活性。中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)將硒列為每日膳食營(yíng)養(yǎng)素，建議成人每日適宜攝入量應(yīng)在 50～250 μg，2014 年將最低攝入量提升至60 μg。 我國(guó)約有70%的區(qū)域處于低硒地帶，所以適當(dāng)補(bǔ)充硒是必要的。 硒分為有機(jī)硒和無機(jī)硒。由于吸收方式不同，有機(jī)硒的生物利用度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于無機(jī)硒，其中硒代蛋氨酸（Se-Met）的生物利用度更是在90%以上，因此正確的補(bǔ)硒方式為適當(dāng)補(bǔ)充富含有機(jī)硒的食物，有機(jī)硒主要以硒蛋白和硒多糖的形式存在，其中以硒蛋白為主［7］。硒蛋白的提取是研究硒蛋白性質(zhì)的前提，常用的提取方法為溶劑提取法，同時(shí)輔以攪拌、超聲或凍融等，但超聲或凍融處理會(huì)破壞硒蛋白結(jié)構(gòu)，甚至降低硒代氨基酸含量，使有機(jī)硒含量降低，不利于硒蛋白的提取。 提取溶劑通常選用水、堿、醇、鹽等，根據(jù)根據(jù)蛋白種類選用適宜的溶劑，或采用不同溶劑多次提取以提高硒蛋白提取率，高林［8］對(duì)采用堿提法提取富硒花生中的硒蛋白，蛋白得率高達(dá)87%。

恩施碎米薺是一種超富硒植物，硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá) 1 400 mg/kg［9-10］，劉坤媛等［11］研究發(fā)現(xiàn)碎米薺蛋白中有機(jī)硒的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于富硒酵母、 富硒花生等，其中有機(jī)硒以硒蛋白為主［12］。 硒蛋白中硒的形態(tài)主要以硒代半胱氨酸（Se-Cys）和Se-Met 為主，這使得碎米薺硒蛋白中硒更易于被人體吸收利用。 當(dāng)前人們對(duì)碎米薺硒蛋白有一定研究，國(guó)外對(duì)碎米薺硒蛋白的研究主要集中在碎米薺硒蛋白的生物利用度、結(jié)構(gòu)與功能上［13］，而國(guó)內(nèi)主要集中在碎米薺硒蛋白的結(jié)構(gòu)特性、抗疲勞［11］和體內(nèi)抗氧化上［14］，但對(duì)碎米薺堿提蛋白的研究較少。

作者以恩施碎米薺為原料，首先優(yōu)化碎米薺硒蛋白提取工藝，初步探討碎米薺蛋白抗氧化活性，為開發(fā)高附加值的碎米薺硒蛋白提供數(shù)據(jù)支持，拓展其在功能性食品方面的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蓳葉碎米薺：由恩施德源健康科技發(fā)展有限公司提供。

牛血清蛋白 BR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑限公司；福林酚、碳酸鈉、硼氫化鉀、鐵氰化鉀、氫氧化鉀、氫氧化鈉、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸、福林酚試劑、五水合硫酸銅、四水合酒石酸鈉 AR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硒代蛋氨酸、硒代胱氨酸 北京百靈威科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SCIENTZ-10N 冷凍干燥機(jī)：寧波生物科技有限公司產(chǎn)品；SHA-B 雙功能水浴振蕩器：天津賽得利斯實(shí)驗(yàn)分析儀器制造廠產(chǎn)品；721N 型可見光分光光度計(jì)：上海儀電分析儀器有限公司產(chǎn)品；TD6 臺(tái)式低速離心機(jī)：湖南赫西儀器裝備有限公司產(chǎn)品；AF-600 原子熒光光譜儀：北京瑞利分析儀器有限公司產(chǎn)品；Waters1525 高效液相色譜儀（配2487 紫外檢測(cè)器和Empower 工作站GPC 軟件）：美國(guó)沃特世公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 總蛋白質(zhì)含量測(cè)定 凱氏定氮法，參考國(guó)標(biāo)GB/T 5009.5-2016 進(jìn)行。

1.3.2 提取溶劑的選擇 參考陳雪青［15］的方法確定碎米薺蛋白種類：將干燥好的碎米薺打粉，過80目篩，稱取4 份碎米薺粉末各20 g，按1 g:40 mL，分別加入去離子水、NaCl 溶液（1 mol/L）、乙醇溶液（體積分?jǐn)?shù) 80%）、堿液（0.1 mol/L 的 NaOH 溶液），在 50 ℃下攪拌 8 h，2 810 g 離心 15 min，收集上清液，測(cè)定蛋白含量，比較各溶劑的得率，從而確定提取溶劑。

1.3.3 蛋白質(zhì)得率的計(jì)算 溶液中蛋白質(zhì)的測(cè)定參考胡宇航等［16］的方法（Folin-酚法）。 繪制牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.002 3X+0.0262，Y 為反應(yīng)液的吸光度；X 為溶液中蛋白質(zhì)的濃度，μg/mL； 相關(guān)系數(shù)為 R2=0.999 3，線性范圍為 0～340 μg/mL。

蛋白質(zhì)得率計(jì)算公式為：

蛋白質(zhì)得率 （%）=提取液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量（g）/恩施碎米薺質(zhì)量（g）×100

1.3.4 蛋白提取工藝研究

1） 碎米薺蛋白提取工藝單因素實(shí)驗(yàn) 參考李寶瑞等［17］的方法，考察提取溫度、提取時(shí)間、料液質(zhì)量體積比和堿液濃度對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響，研究碎米薺硒蛋白提取工藝。

2）兩次提取對(duì)提取率的影響 稱取4 g 碎米薺粉末按料液質(zhì)量體積比1 g:40 mL，加入去離子水，在50 ℃下攪拌 8 h，2 810 g 離心 15 min，收集上清液，測(cè)定蛋白含量，再次向殘?jiān)邪? g:40 mL 加入去離子水，在 50 ℃下攪拌 8 h，2 810 g 離心 15 min，收集上清液，測(cè)定蛋白含量，得出兩次水提?。ㄋ┑牡鞍踪|(zhì)得率。 參考上述方法測(cè)定現(xiàn)水提后堿提（水—NaOH 溶液）和兩次堿提（NaOH 溶液—NaOH溶液）的蛋白得率。

1.3.5 碎米薺蛋白相對(duì)分子質(zhì)量分布 稱取0.5 g蛋白樣品溶于2 mL 流動(dòng)相，2 810 g 離心15 min，上清液經(jīng)0.22 μm 水相過濾膜過濾，裝入液相小瓶中，樣品制備完成后在以下色譜條件下進(jìn)樣：色譜柱為 TSKgel 4000 SWXL 300 mm×7.8 mm，流動(dòng)相為水，流量為0.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，柱溫為 30 ℃。

1.3.6 碎米薺蛋白純化 將水提蛋白經(jīng)超濾膜超濾濃縮，收集截留液，凍干；將堿提蛋白旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮 4 倍，調(diào)節(jié) pH 至等電點(diǎn)（pH=2.9），4℃靜置過液，離心15 min，收集沉淀，凍干，測(cè)定兩種產(chǎn)物中的蛋白和硒含量。

1.3.7 硒含量的測(cè)定 總硒含量的測(cè)定參考GB 5009.93-2010。硒代蛋氨酸和硒代胱氨酸的測(cè)定采用HPLC-AFS 法［18、19］，檢測(cè)條件為：載 氣 流 量為 800 mL/min，燈電流為90/0 mA，負(fù)高壓為320 V。 流動(dòng)相為0.015 mol/L 的 KH2PO4和 0.01 mol/L 的 KCl 溶液。色譜柱PRP-X100 液相色譜柱。

1.3.8 碎米薺堿提蛋白和水提蛋白自由基清除性能檢測(cè) 碎米薺硒蛋白對(duì)·OH 清除率的測(cè)定參考任堯［20］的方法；碎米薺硒蛋白對(duì)DPPH·清除率的測(cè)定參考 Zhao 等［21］的方法。

1.3.9 堿提蛋白的純化及其自由基清除活性 將適量的Sephadex G-100 凝膠用超純水浸泡24 h，用1 mol/L NaOH 溶液浸泡1 h，然后用純水洗滌凝膠至中性，減壓抽濾1 h，立即裝入玻璃層析柱（規(guī)格），用 0.5 mol/L pH8.0 Tris-HCl 洗脫液平衡 2 h，保持流速為0.5 mL/min，上樣3 mL（1.2.7 中最優(yōu)提取條件下得到的堿提蛋白溶液），每10 min 接收1管，在波長(zhǎng)220 nm 處檢測(cè)，將各組份收集，凍干，測(cè)定各組份的自由基清除率及硒含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 23 處理，采用Excel 2013、Origin 9.0 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 碎米薺蛋白提取溶劑的選擇

碎米薺原料蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14.4%。 由圖1所示，樣品經(jīng)去離子水，1 mol/L NaCl 溶液，0.1 mol/L NaOH 溶液和體積分?jǐn)?shù)80%乙醇溶液提取，得率分別為39.0%、32.7%、53.4%和5.2%。由上述可知碎米薺中堿提蛋白含量最高，其次為水提蛋白，然后依次為鹽提蛋白和醇提蛋白，各種蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間存在著顯著性差異（P＜0.05）。 為了獲得較高的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，所以首先研究以堿液為提取劑時(shí)不同提取條件對(duì)碎米薺蛋白質(zhì)得率的影響。

圖1 提取溶劑對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響Fig. 1 Effect of extraction solvent on extraction yield of cardamine protein

2.2 碎米薺蛋白提取單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 堿液濃度對(duì)碎米薺蛋白得率的影響 堿液濃度是影響碎米薺蛋白提取的主要因素。 由圖2 可知，隨著堿液濃度的增加得率逐漸增加，在P＜0.05時(shí)，具有顯著性差異。 可能是由于蛋白被水解末端羧基與末端氨基增多，增加蛋白的親水性，當(dāng)堿液濃度達(dá)到0.1 mol/L 后，得率增加相對(duì)變緩，當(dāng)堿液濃度在0.15 mol/L 后，得率增加緩慢，有研究表明堿性太強(qiáng)會(huì)造成 Lys、Cys、Ser、Thr 降解，甚至?xí)a(chǎn)生賴氨酰丙氨酸［22］。而且由于Cys 被破壞，導(dǎo)致有機(jī)硒含量降低。 綜合上述因素與經(jīng)濟(jì)因素選用0.1 mol/L為提取最佳堿液濃度。

圖2 堿液濃度對(duì)蛋白得率的影響Fig. 2 Effect of alkali concentration on extraction yield of protein

2.2.2 提取溫度對(duì)碎米薺蛋白質(zhì)得率的影響 由圖3 可看出，得率隨溫度的增加而增加。 當(dāng)溫度達(dá)到50 ℃后，得率不再增加，甚至有所降低，這與李大鵬等［23］提取豆粕中大豆分離蛋白現(xiàn)象一致。 可能是由于隨著溫度的升高，分子的熱運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)，蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生改變，有利于蛋白質(zhì)的溶解；但是溫度過高可能使蛋白質(zhì)變性而沉淀，而且隨著溫度的升高，提取物中多酚、色素的含量也會(huì)隨之升高，降低蛋白樣品中蛋白含量和品質(zhì)。 所以綜合考慮選取50℃為最佳提取溫度。

圖3 提取溫度對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響Fig. 3 Effect of temperature on extraction yield of protein

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)碎米薺蛋白得率的影響 由圖4看出隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，得率逐漸增加，當(dāng)達(dá)到8 h 時(shí)，得率達(dá)到最高，后逐漸下降，可能是由于提取時(shí)間過長(zhǎng)蛋白變性而沉淀，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，原料中的多酚及色素等物質(zhì)也會(huì)被大量提取進(jìn)溶劑中，降低蛋白品質(zhì)，甚至部分多酚與蛋白結(jié)合使蛋白沉淀，造成蛋白損失，且對(duì)不利于后續(xù)純化過程。 所以從得率、經(jīng)濟(jì)和蛋白保存方面來看，8 h 為最佳提取時(shí)間。

圖4 提取時(shí)間對(duì)蛋白得率的影響Fig. 4 Effect of time on extraction yield of protein

2.2.4 料液質(zhì)量體積比對(duì)碎米薺蛋白質(zhì)得率的影響 由圖5 得出得率隨料液質(zhì)量體積比的增大而增大，且存在顯著性差異（P＜0.05）。當(dāng)料液質(zhì)量體積比為1 g:40 mL 以后，得率增加速率降低，可能是由于當(dāng)料液質(zhì)量體積比較低時(shí)如1 g:20 mL，溶液的粘度大，蛋白濃度大，固相和液相濃度差較小，推動(dòng)力小，得率小，同時(shí)由于固相中吸附較多的提取液，導(dǎo)致蛋白得率較低；當(dāng)料液比大于1 g:40 mL 后得率增速變緩，但料液體積增大，旋蒸濃縮所需時(shí)間過長(zhǎng)，且蛋白顏色過深，由棕色變?yōu)楹谏?，所以選擇1 g:40 mL為最佳提取料液質(zhì)量體積比。

圖5 料液質(zhì)量體積比對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響Fig. 5 Effect of ratios of water to material on extraction yield of protein

圖6 兩次提取時(shí)提取溶劑的選擇Fig. 6 Selection of extraction solvents for two extractions

2.2.5 兩次提取對(duì)碎米薺蛋白得率的影響 為了提高碎米薺蛋白得率，采用兩步提取法提取蛋白。由圖 6 可知，水—水、水—NaOH 溶液（0.1 mol/L）和NaOH 溶液—NaOH 溶液提取的得率分別為36.5%，75.4%和67.8%。 其中采取水—NaOH 溶液 組合時(shí)得率最高，可能是由于水溶蛋白和堿溶蛋白分別占碎米薺總蛋白的30.0%和53.4%，若只采用一種提取劑僅能將對(duì)應(yīng)的蛋白提取出來而其他種類的蛋白則溶出較少。 且因?yàn)榇既艿鞍缀望}溶蛋白含量較低，提取價(jià)值不大，所以提取蛋白時(shí)采用水—NaOH溶液組合。

綜上所述提取溫度50 ℃，料液質(zhì)量體積比為1 g:40 mL，先水提8 h 后堿提8 h 為最佳提取工藝。得到的水提蛋白經(jīng)超濾凍干后得到的樣品蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為26.5%，硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 748 μg/g，堿提蛋白經(jīng)酸沉后蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為52.3%，硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 1 513 μg/g。

2.2.6 碎米薺蛋白相對(duì)分子質(zhì)量分布 分別測(cè)定2.2.5 中提取得到的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量分布，得圖7 和圖8。 水提蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量主要為87 694、9 928、5 997，堿提蛋白相對(duì)分子質(zhì)量主要為84 992和5 800，二者蛋白相對(duì)分子質(zhì)量均小于100 000，證明碎米薺蛋白相對(duì)分子質(zhì)量小于100 000。

圖7 水提蛋白相對(duì)分子質(zhì)量分布Fig. 7 Water extract protein molecular weight distribution

圖8 堿提蛋白相對(duì)分子質(zhì)量分布Fig. 8 Alkaline extraction protein molecular weight distribution

2.3 碎米薺蛋白對(duì)·OH 和DPPH 自由基清除能力的測(cè)定

由圖 9 可知，維生素 C 清除·OH 能力最強(qiáng)。 碎米薺水提蛋白對(duì)·OH 的清除能力大于堿提蛋白，且二者的·OH 的清除能力均比大豆蛋白強(qiáng)（P＜0.05）。同時(shí)三者的硒含量也是碎米薺水提蛋白最高，碎米薺堿提蛋白次之，大豆蛋白最低（P＜0.05），說明蛋白硒含量越高，其.OH 的清除能力越大，這與 Zhao 等［21］的結(jié)論相同。

圖9 碎米薺蛋白對(duì)·OH 的清除率Fig. 9 Clearance rate of·OH in cardamine protein

由圖10 可知維生素C 清除DPPH 自由基能力最強(qiáng)，其次為碎米薺水提蛋白，其在1 mg/mL 時(shí)清除率為82.5%，碎米薺堿提蛋白為64.4%，大豆蛋白對(duì)DPPH 自由基清除率最低，為 56.8%，其中 IC50大豆蛋白（1.542 mg/mL）＞ IC50堿提蛋白（1.345 mg/mL）＞ IC50水提蛋白（0.4490 mg/mL）三者的硒含量從高至低為碎米薺水提蛋白、碎米薺堿提蛋白和大豆蛋白。 說明蛋白對(duì)DPPH 自由基的清除能力與硒的含量有關(guān)，硒含量越高，清除DPPH 自由基的能力越強(qiáng)。 綜上所述，水提蛋白抗氧化能力最強(qiáng)其次為堿提蛋白，Du等［24］和岳念晶等［25］分別對(duì)富硒靈芝和富硒大蒜研究發(fā)現(xiàn)相似結(jié)果。

圖10 碎米薺蛋白對(duì)DPPH·的清除率Fig. 10 DPPH·clearance rate of cardamine protein

2.4 堿提蛋白的純化及其自由基清除能力

由于碎米薺蛋白中堿提蛋白含量最高，且對(duì)其研究較少，所以對(duì)水—NaOH 溶液提取得到的堿提蛋白進(jìn)行分離純化，將1.2.5 中水—NaOH 溶液提取得到的碎米薺堿提蛋白經(jīng)Sephadex G-100 凝膠分離，在紫外280 nm 下測(cè)得兩個(gè)峰，分別為80～160 min（峰 1），160～310 min（峰 2）結(jié)果見圖 11。 參考2.2.6 中堿提蛋白相對(duì)分子質(zhì)量分布可知，峰1 的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為8.5×104，峰2 的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為 5.8×104，上述峰1、峰2 兩組分的硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 668、650 mg/kg。

圖11 碎米薺堿提蛋白Sephadex G-100 分離圖譜Fig. 11 Elution profile of cardamine alkali extract protein separated in Sephadex G-100 column

碎米薺堿提硒蛋白兩組分氨基酸組成分析結(jié)果如表 1 所示。 峰1 蛋白中氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為38.8%。 峰2 的氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為32.4%。 2 種蛋白中各氨基酸占各自總氨基酸的比例相差不大，其中峰1 和峰2 中7 種必需氨基酸占總氨基酸的41.0%、38.1%，主要區(qū)別在于 Tyr（峰 1：4.36%、峰 2：2.63%）Met （2.06% 、1.54% ）、Lys （6.88% 、5.49% ）、Pro（4.15%、5.81%）和 Cys（0.01%、0.07%），且峰 1 中硒代蛋氨酸和硒代胱氨酸含量皆高于峰2。

表1 碎米薺堿提蛋白兩組分氨基酸組成Table 1 Composition of amino acid from two components of cardamine alkali

分別對(duì)2 個(gè)峰進(jìn)行·OH 和DPPH 自由基清除能力檢測(cè)得到圖12～13。 由圖12 可知峰1 與峰2的·OH 清除能力相同，且都大于大豆蛋白對(duì)·OH 的清除能力，與堿提蛋白相近且弱于水提蛋白。 由層析圖（圖11）可知，峰1 的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于峰2 的含量，所以從得率的角度來說峰1 優(yōu)于峰2。 由圖13可知維生素C 對(duì)DPPH 自由基清除率最大，其次為峰1，清除率為65.7%，峰2 與大豆蛋白對(duì)DPPH 自由基的清除能力相差不大，分別為36.3%和39.6%，峰1 清除DPPH 自由基能力強(qiáng)于峰2，可能是由于峰1 的總硒和硒代氨基酸含量比峰2 高，而硒含量的增加有助于蛋白對(duì)自由基的清除［26］，由圖14 可知峰1 蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為88 257。

圖12 碎米薺純化蛋白對(duì)·OH 的清除率Fig.12 Clearanceof·OHbypurifiedproteinfromcardamine

圖13 碎米薺純化蛋白對(duì)DPPH·的清除率Fig. 13 DPPH·clearance rate of purified protein from cardamine

圖14 堿提蛋白相對(duì)分子質(zhì)量分布Fig. 14 Alkaline extraction protein molecular weight distribution

3 結(jié) 語

以恩施碎米薺為原料，比較不同提取方法對(duì)碎米薺蛋白得率的影響，采用單因素法得到最佳工藝為：提取溫度50 ℃，料液質(zhì)量體積比為1 g:40 mL，先后用水和0.1 mol/L NaOH 溶液分別提取4 h。 在此工藝條件下蛋白得率最高，為75.4%，其中水提蛋白的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為26.5%，硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 748 μg/g，堿提蛋白的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為52.3%，硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 1 513 μg/g。 采用 Sephadex G-100 凝膠層析對(duì)碎米薺堿提蛋白進(jìn)行純化得到兩個(gè)組分。 通過研究4 種恩施碎米薺蛋白對(duì)DPPH 自由基和羥自由基的清除能力，發(fā)現(xiàn)碎米薺蛋白均具有一定的抗氧化活性。