煙曲霉多糖合成酶Cps1敲除菌株的構(gòu)建及其鑒定

徐寧潔， 王凱杰， 周哲倫， 楊馬炯， 王 莎

(湖州師范學(xué)院 醫(yī)學(xué)院， 浙江 湖州 313000)

0 引 言

侵襲性曲霉病是一種臨床上常見的肺部侵襲性感染性疾病，主要以曲霉菌侵入肺組織并引起深部真菌感染為特征[1].近年來由于廣譜抗生素、糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑等藥物的廣泛使用，器官移植的開展，以及免疫缺陷病如艾滋病病人增多等，曲霉病患者的數(shù)量急劇上升[2].煙曲霉是侵襲性曲霉病的主要致病原，其產(chǎn)孢數(shù)量大，被吸入肺部后常定植在局部，對(duì)于免疫功能健全的個(gè)體而言，可通過自身的免疫細(xì)胞清除被吸入的孢子，但當(dāng)機(jī)體免疫力低下或免疫功能受損時(shí)即可引起感染，并隨血液循環(huán)到達(dá)全身其他器官引起嚴(yán)重的疾病，甚至死亡.

煙曲霉作為一種重要的人類致病性絲狀真菌，其細(xì)胞壁發(fā)揮著關(guān)鍵而復(fù)雜的作用，以維持其細(xì)胞形狀來適應(yīng)惡劣環(huán)境.煙曲霉的細(xì)胞壁主要由多糖骨架和多種糖蛋白構(gòu)成，其中多糖含量達(dá)90%以上，包括幾丁質(zhì)和β-葡聚糖兩種主要成分[3].此外，細(xì)胞壁可介導(dǎo)宿主細(xì)胞對(duì)真菌的識(shí)別和攝取，刺激宿主免疫應(yīng)答并調(diào)節(jié)宿主代謝途徑.煙曲霉的細(xì)胞壁對(duì)維持菌體本身生長和入侵宿主細(xì)胞都具有重要作用，是一種重要的毒力因子，并且參與細(xì)胞壁整合途徑的蛋白在哺乳動(dòng)物中很少有同源蛋白或同源性很低，因此對(duì)真菌細(xì)胞壁及其重要組分功能的研究具有重要意義.研究報(bào)道，在一些真菌和細(xì)菌中，cps基因參與了細(xì)胞壁完整性的合成途徑，在莢膜多糖的合成中起關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用[4].該基因作為煙曲霉的新基因，被預(yù)測為多糖合成酶(capsule polysaccharide synthase Cps1,putative)，其在煙曲霉中的功能并沒有被研究.本實(shí)驗(yàn)采用Fusion PCR方法敲除cps1基因來探究該基因在煙曲霉中的功能.

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

轉(zhuǎn)化受體菌株是煙曲霉A1160(ΔKu80;pyrG)，該菌具有尿苷、尿嘧啶營養(yǎng)缺陷，并已去除非同源重組nku基因，有利于進(jìn)行外源片段的同源重組.質(zhì)粒pAL5購買于真菌保藏中心FGSC，以此質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增出pyr4營養(yǎng)篩選片段，作為篩選轉(zhuǎn)化子時(shí)所需的營養(yǎng)標(biāo)記，以彌補(bǔ)轉(zhuǎn)化受體菌株尿苷、尿嘧啶營養(yǎng)缺陷.

1.1.2 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基有YAG培養(yǎng)基(含2%葡萄糖、0.5%酵母膏提取物、1 mL/L Trace elements、2% Agar)和YUU培養(yǎng)基(YAG培養(yǎng)基中添加5 mM尿嘧啶和10 mM尿苷)，其中YAG培養(yǎng)基用于篩選轉(zhuǎn)化子.

1.1.3 儀器與試劑

Bio-Rad T100 PCR儀由Thermo Scientific生產(chǎn)；全自動(dòng)CCD凝膠成像分析儀由上海培清科技有限公司生產(chǎn)；DYY-7C型電泳儀由北京市六一儀器廠生產(chǎn).

高保真DNA聚合酶購自南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司；切膠回收試劑盒購自上海生工生物工程有限公司；相關(guān)細(xì)胞壁酶購自Sigma公司.

1.2 方法

1.2.1 融合PCR引物的設(shè)計(jì)

用于構(gòu)建融合片段的引物與一般引物有所區(qū)別，其引物的設(shè)計(jì)是融合PCR順利進(jìn)行的一個(gè)關(guān)鍵步驟.其中，引物cps1 P1、cps1 P3和cps1 P4、cps1 P6分別用來擴(kuò)增cps1基因的上游和下游同源臂，引物cps P2和cps P5用于融合PCR，將3個(gè)片段連成用于轉(zhuǎn)化的線性片段.融合PCR引物設(shè)計(jì)原理見圖1(cps1 P3、cps1 P4引物下劃線部分為與pyr4片段重疊的接頭部分).

引物具體序列如下：

cps1 P1 TATTTTTGTTCCATTTGATT;

cps1 P2 ACCGCTGCCAATCCTGTCTC;

cps1 P3 GGCTTGTCTGCTCCCGCAACGAAGTTTCCTTGCTAT;

cps1 P4 ACGCCAGGGTTTTCCCCCCCAACTTCATAACTCAAT;

cps1 P5 CGACGAAAGCAATGAACAAG;

cps1 P6 AAATCAACCATGGATCAGAC;

pyr4 F TGGCGTTACCCAACTTAATCG;

pyr4 R GCTTTCGGGAACTGGCTACTTAT;

Diag-cps1 AGTTCGTCACCACATCCCTC;

Diag-pyr4R TGTCAACATCAAGGGCAC.

1.2.2 左右同源臂和營養(yǎng)篩選片段的合成

PCR反應(yīng)體系：以野生型的基因組DNA為模板，上游引物cps1 P1和下游引物cps1 P3擴(kuò)增煙曲霉cps1基因編碼區(qū)上游側(cè)翼片段，上游引物cps1 P4和下游引物cps1 P6擴(kuò)增煙曲霉cps1基因編碼區(qū)下游側(cè)翼片段，上游引物pyr4 F和下游引物pyr4 R擴(kuò)增營養(yǎng)篩選片段pyr4.PCR 使用的DNA聚合酶為高保真酶，擴(kuò)增后的產(chǎn)物片段再用切膠回收試劑盒進(jìn)行純化.

擴(kuò)增左右同源臂和營養(yǎng)篩選片段的PCR步驟：①95 ℃ 2 min；②95 ℃ 25 s；③ 56 ℃ 25 s；④ 72 ℃ 40 s；⑤go to step 2 for 36 times；⑥72 ℃ 10 min；⑦ 4 ℃ for ever.

1.2.3 采用融合PCR獲得同源轉(zhuǎn)化片段

PCR反應(yīng)體系：模板包括3部分，即cps1的左右同源臂和中間的營養(yǎng)篩選片段pyr4，擴(kuò)增引物是nested primers(cps1 P2 + cps1 P5)，將上述3個(gè)片段融合成一條線性片段，沒有選用cps1 P1和cps1 P6進(jìn)行擴(kuò)增主要是為避免非特異性擴(kuò)增，并提高擴(kuò)增的質(zhì)量.另外，為使3個(gè)片段順利融合成一個(gè)長的整合片段，本文在設(shè)計(jì)P3和P4引物時(shí)，各自攜帶了pyr4片段接頭處的序列，以便在融合PCR運(yùn)行過程中將3個(gè)片段的序列依次連接進(jìn)行擴(kuò)增.

PCR步驟：①94 ℃ 2 min；②94 ℃ 20 s；③ 70 ℃ 1 s；④ramp to 55 ℃ at 0.1 ℃/s；⑤55 ℃ 30 s；⑥r(nóng)amp to 68 ℃ at 0.2 ℃/s；⑦68 ℃ 4 min；⑧go to step 2 for 10 times；⑨94 ℃ 20 s；70 ℃ 1 s；ramp to 55 ℃ at 0.1 ℃/s；55 ℃ 30 s；ramp to 68 ℃ at 0.2 ℃/s；68 ℃ 4 min incredement 5 s/cycle；go to step 9 for 5 times；94 ℃ 20 s；70 ℃ 1 s；ramp to 55 ℃ at 0.1 ℃/s；55 ℃ 30 s；ramp to 68 ℃ at 0.2 ℃/s；68 ℃ 4 min incredement 20 s/cycle；go to step 16 for 10 times；4 ℃ for ever.

1.2.4 轉(zhuǎn)化

煙曲霉A1160菌株為轉(zhuǎn)化的受體菌株，使用細(xì)胞壁酶水解已萌發(fā)出短芽管的孢子，酶解3 h后得到原生質(zhì)體，再將之前獲得的融合PCR產(chǎn)物片段轉(zhuǎn)化到原生質(zhì)體中，混合均勻后倒入篩選培養(yǎng)基YAG中進(jìn)行培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)2天左右可長出相關(guān)菌落，即為轉(zhuǎn)化子.

1.2.5 純化并篩選基因敲除菌株

用牙簽將轉(zhuǎn)化子在YAG培養(yǎng)基上劃線分離單菌落，培養(yǎng)2天，取與野生型有明顯差別的菌落再次做劃線分離，純化3次得到的單一菌落為敲除菌株的候選者.

1.2.6 診斷PCR進(jìn)行菌株鑒定

提取野生型菌株A1160和轉(zhuǎn)化子的基因組DNA為診斷PCR的模板，設(shè)野生型菌株DNA作為對(duì)照樣本.診斷PCR引物為兩對(duì)，其中上游引物cps1-P1和下游引物Diag-cps1可以擴(kuò)增cps1基因的自身?xiàng)l帶，引物cps1-P1和Diag-pyr4用于鑒定轉(zhuǎn)化子中cps1自身片段是否已被pyr4所替換.若Δcps1轉(zhuǎn)化子中，用cps1-P1和Diag-pyr4能擴(kuò)增出特異性片段，同時(shí)并不能擴(kuò)增出自身?xiàng)l帶，即可鑒定該菌株為cps1基因敲除菌株.

1.2.7 產(chǎn)孢計(jì)算

將野生型A1160和Δcps1菌株分別接種在兩個(gè)獨(dú)立的YUU平板上，37 ℃培養(yǎng)2天后，用0.02% Tween80收集固體培養(yǎng)基上的孢子，用無菌水沖洗2遍，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，得到相應(yīng)孢子的總數(shù)量，再除以之前測得的菌落面積，即得到對(duì)應(yīng)的產(chǎn)孢量.

2 結(jié) 果

2.1 左右同源臂及中間片段擴(kuò)增結(jié)果的檢測

以野生型菌株DNA為模板，在高保真DNA聚合酶的作用下，通過引物cps1 P1/P3和cps1 P4/P6擴(kuò)增敲除基因cps1的左同源臂和右同源臂片段，電泳結(jié)果顯示片段大小分別為864 bp和907 bp，與預(yù)計(jì)長度一致，如圖2所示.另外，使用引物pyr4F/pyr4R從質(zhì)粒pAL5中擴(kuò)增用作營養(yǎng)篩選標(biāo)記的中間片段pyr4，電泳結(jié)果顯示與預(yù)期大小一致，片段長度為2 272 bp.

2.2 融合片段擴(kuò)增結(jié)果的檢測及其轉(zhuǎn)化

以cps1基因的左同源臂、右同源臂以及pyr4營養(yǎng)篩選片段為融合PCR的模板，使用引物cps1 P2/ P5，通過高保真DNA聚合酶的擴(kuò)增作用將上述3個(gè)片段進(jìn)行連接融合.融合PCR結(jié)束后將獲得的融合片段產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收，后經(jīng)電泳鑒定，結(jié)果顯示該融合片段大小為3 868 bp(圖3)，與預(yù)計(jì)大小一致，表明融合片段構(gòu)建成功.之后，再將切膠回收后約5 μg的融合片段通過轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入煙曲霉A1160的原生質(zhì)體中.

2.3 Δcps1敲除菌株診斷PCR驗(yàn)證結(jié)果

對(duì)于后期篩選出來的轉(zhuǎn)化子，為了確定菌株中的cps1基因片段是否被pyr4片段取代，本文采用診斷PCR對(duì)菌株進(jìn)行鑒定.首先分別提取野生型菌株和Δcps1轉(zhuǎn)化子菌株的DNA作為模板，其中野生型菌株為對(duì)照樣本，并使用兩對(duì)診斷引物進(jìn)行鑒定，如圖4所示.泳道1和3：PCR擴(kuò)增引物為cps1-p1和Diag-cps1，上游引物cps1-p1結(jié)合于cps基因起始密碼子上游區(qū)域，下游引物Diag-cps1結(jié)合于cps1基因編碼區(qū)域，用于檢測cps1是否仍然存在于基因組中，擴(kuò)增片段預(yù)期大小為1 129 bp；泳道2和4：PCR擴(kuò)增引物是cps1-p1和Diag-pyr4，下游引物Diag-pyr4結(jié)合于營養(yǎng)篩選標(biāo)記pyr4片段的中間區(qū)域，用于檢測營養(yǎng)篩選片段pyr4是否替換了cps1基因.由診斷PCR結(jié)果可知，野生型菌株已成功擴(kuò)增出1 129 bp的cps1基因自身片段，而Δcps1菌株并沒有擴(kuò)增出自身片段，但已擴(kuò)增出1 496 bp的鑒定片段，說明該轉(zhuǎn)化子已經(jīng)成功敲除了cps1基因的編碼區(qū)域，即煙曲霉cps1敲除菌株構(gòu)建成功.

2.4 菌株的表型特征

為了確定cps1基因敲除后是否會(huì)影響菌株的表型，將野生型菌株(A1160)和Δcps1菌株接種于YUU培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)2天后觀察，如圖5A所示，野生型菌落直徑大，且菌落較為舒展，中間出現(xiàn)大量綠色的孢子，而Δcps1菌落直徑變小，顯示出緊密而褶皺的表型，肉眼幾乎看不到綠色的孢子.為進(jìn)一步確定cps1基因?qū)Ξa(chǎn)孢功能的影響，本文分別對(duì)菌落中產(chǎn)生的孢子數(shù)量進(jìn)行定量計(jì)數(shù)檢測，結(jié)果如圖6B所示，野生型菌株的產(chǎn)孢量為(1.47×108±6.1×106)/ cm2，而Δcps1菌株的產(chǎn)孢量是野生型的2.9%，只有(4.28×106±4.36×105)/ cm2，表明其產(chǎn)生分生孢子的能力幾乎完全缺失.該計(jì)數(shù)值是3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±SD(P<0.01)，敲除株與對(duì)照組(WT)的產(chǎn)孢量相比差異非常顯著.

3 討 論

對(duì)于存在于自然界的各種真菌而言，無性孢子的產(chǎn)生是它們最普遍的繁殖方式.由于真菌主要通過產(chǎn)生分生孢子進(jìn)行繁殖，因此，控制它們產(chǎn)孢可以有效地降低真菌的危害性.煙曲霉的孢子產(chǎn)量非常大，在環(huán)境中無處不在，由于其體積小，生長速度快，對(duì)外界不良環(huán)境有很大的耐受性，且吸附能力強(qiáng)，容易通過呼吸道發(fā)生侵入性感染.而侵襲性曲霉病的發(fā)病機(jī)制主要是由散布在空氣中的孢子通過呼吸道吸附定植在肺中，后期通過菌絲侵襲性生長侵入肺實(shí)質(zhì)引起肺部感染[5].一般來說，曲霉侵襲力的強(qiáng)弱在一定程度上是由孢子的擴(kuò)散和侵襲能力等決定的.

細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的完整性是絲狀真菌形態(tài)建成的重要環(huán)節(jié)，并對(duì)菌絲的生長、分生孢子的產(chǎn)生及其毒力起到至關(guān)重要的作用.本實(shí)驗(yàn)研究的Cps1同源蛋白存在于大多數(shù)真菌和一些細(xì)菌中，并在體內(nèi)發(fā)揮重要作用.研究表明，新生隱球菌的cps1基因編碼透明質(zhì)酸合成酶，負(fù)責(zé)合成莢膜的主要成分透明質(zhì)酸.進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，cps1敲除后在菌株中檢測不到莢膜HA，且對(duì)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附率和侵襲率有明顯降低的趨勢[6]，表明該蛋白在新生隱球菌的侵襲過程中起到了關(guān)鍵作用，也是重要的毒力因子.而在粗糙脈孢菌的同源蛋白研究中發(fā)現(xiàn)其與細(xì)胞壁整合和蛋白鑲嵌有關(guān)，缺失菌株細(xì)胞壁不完整且細(xì)胞壁蛋白大量丟失[4].此外，cps1基因在小鼠腦、心臟、脾臟、肝臟、腎、小腸、睪丸等組織器官都有表達(dá)，Cps1是尿素循環(huán)的第一個(gè)限速酶[7]，在機(jī)體解毒氨中起著重要作用，在肝細(xì)胞癌中發(fā)生了下調(diào)，同時(shí)通過干擾cps1的表達(dá)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的增殖活性受到抑制，細(xì)胞出現(xiàn)了凋亡，說明cps1基因在細(xì)胞中的作用也尤為重要.

本研究通過對(duì)菌株的鑒定成功構(gòu)建了煙曲霉cps1敲除菌株，這是研究多糖合成酶Cps1在煙曲霉中功能的第一步，同時(shí)通過對(duì)表型初步的觀察發(fā)現(xiàn),cps1基因的缺失后導(dǎo)致其菌落面積變小，形態(tài)呈褶皺狀，孢子形成嚴(yán)重缺陷(圖6).而菌落面積的減小說明cps1基因的缺失影響了菌絲生長的速度，同時(shí)分生孢子的嚴(yán)重缺失也使其毒力大大下降.總之，相比野生型菌株，cps1基因敲除后，影響了煙曲霉的生長和產(chǎn)孢功能，使其致病性在一定程度上減弱，這為臨床上控制曲霉病的感染及改進(jìn)現(xiàn)有治療策略提供了新思路.

據(jù)報(bào)道，幾丁質(zhì)水平的降低會(huì)使分生孢子的產(chǎn)生受到抑制[8]，同時(shí)考慮到真菌細(xì)胞壁及其相關(guān)重要組分功能的研究對(duì)于認(rèn)識(shí)微生物的生理代謝過程、與宿主的互作以及作為潛在靶點(diǎn)設(shè)計(jì)藥物都具有重要意義，而多糖合成酶Cps1敲除后，又將如何影響煙曲霉細(xì)胞壁組分的構(gòu)成情況，這是一個(gè)比較有意義的研究方向.后期我們擬檢測多糖合成酶Cps1對(duì)煙曲霉細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和組分的影響及其在活細(xì)胞體內(nèi)的定位，重點(diǎn)檢測細(xì)胞壁組分如幾丁質(zhì)和葡聚糖含量的變化情況，從而詳細(xì)闡明Cps1在煙曲霉細(xì)胞壁多糖合成及其整合中的作用.