胡靜平, 姜羽婷, 齊興梅
(蘇州大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究院, 蘇州 215123)
全球有55.8萬人患有耐利福平結(jié)核病(RR-TB),而這些人中有82%為多重耐藥結(jié)核病(MDR-TB)。由于治療選擇有限、藥物耐受性差(與頻繁的不良事件相關(guān))以及治療失敗率和死亡率高[1],治療廣泛性肺結(jié)核具有極大的挑戰(zhàn)性。而在眾多的抗菌藥中,可用于治療結(jié)核病的僅有幾種,因此尋找新的抗結(jié)核藥物迫在眉睫。
蛋白質(zhì)內(nèi)含子(intein)是存在于前體蛋白質(zhì)中的一段插入序列,其兩側(cè)的氨基酸序列稱為蛋白質(zhì)外顯子(extein)。在蛋白質(zhì)翻譯后加工成熟過程中,蛋白質(zhì)內(nèi)含子從前體蛋白質(zhì)中自我剪切,并將兩側(cè)的蛋白質(zhì)外顯子以天然肽鍵連接形成成熟的有功能的蛋白,這一過程稱為蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導(dǎo)的蛋白質(zhì)剪接[2]。蛋白剪接只發(fā)生于細(xì)菌、古細(xì)菌和單細(xì)胞真核細(xì)胞中,不發(fā)生于高等的真核生物,而分枝桿菌是真細(xì)菌類中唯一發(fā)生蛋白剪接的病原菌。研究發(fā)現(xiàn),結(jié)核分枝桿菌中有3個基因即recA(Rv2732)、dnaB(Rv0058)和sufB(Rv1461)分別受到intein的調(diào)控,RecA、DnaB和SufB 這3個蛋白必須通過蛋白剪接才能成為有活性的蛋白,它們對結(jié)核桿菌的生長繁殖有重要作用[3-4]。根據(jù)所插入宿主基因的不同,這3個蛋白所含的蛋白質(zhì)內(nèi)含子分別稱為Mtu RecA intein、 Mtu DnaB intein和Mtu SufB intein。由于蛋白內(nèi)含子的氨基酸序列具有高度保守性,因此能夠抑制其中任何一個intein的剪接也將會作用于其余兩個intein。這一重大發(fā)現(xiàn)提示人們,針對intein的蛋白剪接抑制劑可以成為抗結(jié)核藥物的新的作用靶點(diǎn),并能最小化耐藥突變株的發(fā)生。而且針對蛋白剪接的抑制劑屬于特異性作用于分枝桿菌,故對人體應(yīng)該不存在任何不良反應(yīng)。
因此,建立一個簡單可靠的蛋白質(zhì)內(nèi)含子抑制劑的篩選系統(tǒng)對于尋找新的抗結(jié)核藥物勢在必行。已經(jīng)報道的蛋白內(nèi)含子抑制劑的篩選系統(tǒng)[5-6],如依賴于熒光蛋白的體外篩選系統(tǒng)[7-8],依賴于細(xì)菌胸苷酸合酶、細(xì)菌CcdB毒素以及細(xì)菌DNA解旋酶亞單位A的體內(nèi)篩選系統(tǒng)[9-10]。由于RecA intein的結(jié)構(gòu)和功能研究得最為清楚,因此本研究以RecA intein為模型,成功構(gòu)建了一個依賴卡那霉素抗性的蛋白質(zhì)內(nèi)含子剪接抑制劑篩選系統(tǒng),該系統(tǒng)不包含任何原始蛋白外顯子序列,直接以卡那霉素抗性作為蛋白剪接活性的指標(biāo),從而可快速直觀地篩選針對intein的剪接抑制劑,為篩選新的抗結(jié)核藥物提供便利。
質(zhì)粒pKH由Paul Xiang-Qin Liu教授(Dalhousie University,Canada)提供,載體上自帶氨芐青霉素抗性(AmpR)和卡那霉素抗性(KanR),并在KanR的N端插入一段組氨酸標(biāo)簽(His-tag)。GFP-RecAmini由劉揚(yáng)中教授(中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)化學(xué)系)提供。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,蛋白Marker,dNTP購于TaKaRa公司;PfuDNA聚合酶(Thermo);質(zhì)粒抽提試劑盒,膠回收試劑盒(Axygen);必克隆試劑盒(abm);鼠anti-His 抗體(GST);熒光二抗anti-mouse IgG(Jackon);順鉑(Sigma);引物合成和質(zhì)粒測序由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。核酸電泳儀,蛋白電泳槽,轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad);PCR擴(kuò)增儀,核酸蛋白分析儀,離心機(jī)(Eppendorf)。
1.2.1RecA-miniintein和RecAintein基因的擴(kuò)增
根據(jù)GenBank中RecAintein的基因序列,設(shè)計上下游引物,即RecA1 F:5′-tgcctcgcagagggcactcg-3′; RecA2 R:5′-GTTGTGCACGACAACCCCTTCG-3′。序列比對結(jié)果表明M.tb和BCG中含有完全相同的RecAintein的基因序列,因此從BCG中抽取基因組DNA為模板,擴(kuò)增得到RecAintein基因,以GFP-RecAmini為模板擴(kuò)增得到RecA-miniintein基因。
1.2.2 將RecA-miniintein和RecAintein基因序列插入pKH載體中
根據(jù)文獻(xiàn)[11]報道,在pKH載體的KanR基因序列中選擇3個位點(diǎn)插入MtuRecAintein序列,分別命名為40S,64S和200S。應(yīng)用必克隆試劑盒采用無縫克隆將intein序列分別插入3個位點(diǎn),具體步驟為:1)通過PCR將pKH載體線性化;2)通過嵌合引物擴(kuò)增intein片段;3)根據(jù)試劑盒說明進(jìn)行同源重組;4)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,挑選陽性克隆,抽質(zhì)粒測序。PCR引物如表1所示。
1.2.3 篩選有卡那霉素抗性的克隆
在pKH的3個位點(diǎn)中成功插入RecA-miniintein,克隆分別命名為pKH-40S-RecAmini,pKH-64S-RecAmini和pKH-200S-RecAmini。分別將含有正確質(zhì)粒的單菌落在含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB中培養(yǎng)過夜,等體積稀釋后分別涂布于含有100 μg/mL氨芐青霉素,100 μg/mL氨芐青霉素和25 μg/mL卡那霉素平板以及100 μg/mL氨芐青霉素和50 μg/mL卡那霉素平板上,過夜培養(yǎng)后,計數(shù)平板上菌落個數(shù)。
1.2.4 Western Blot驗證剪接活性
分別從單抗和雙抗平板上挑取單克隆,過夜培養(yǎng)后加Loading buffer,100 ℃煮10 min裂解菌體,離心后上清進(jìn)行SDS-PAGE,然后轉(zhuǎn)膜以5%的脫脂奶粉封閉2 h,anti-His一抗 (1∶2000)4 ℃孵育過夜,PBST洗滌3次,每次10 min, 二抗(1∶5000)室溫孵育2 h, 以雙色紅外激光成像系統(tǒng)(ODYSSEY)進(jìn)行曝光掃描。
1.2.5 順鉑配合物(DDP)驗證篩選系統(tǒng)的可行性
文獻(xiàn)報道DDP可以抑制RecA intein的剪接[12],以pKH為對照,分別將在含氨芐青霉素的LB中過夜培養(yǎng)的菌液以1∶1000轉(zhuǎn)接到含有100 μg/mL氨芐青霉素,100 μg/mL氨芐青霉素和25 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中,加入不同濃度的DDP過夜培養(yǎng),通過測定菌液OD600檢測DDP對RecA intein的剪接抑制,從而驗證此篩選系統(tǒng)的可行性。
表1 PCR引物
將蛋白內(nèi)含子序列插入到pKH質(zhì)粒的卡那霉素抗性基因中破壞其卡那霉素抗性,若蛋白內(nèi)含子成功剪接則含有該質(zhì)粒的大腸桿菌可在含有卡納霉素的LB平板上生長,反之則不能生長。蛋白內(nèi)含子的剪接除了需要自身保守的氨基酸之外,對其下游外顯子的第一個氨基酸(+1)要求非常嚴(yán)格,通常是保守的Cys、Ser和Thr。RecA intein 1/+1位為C/C組合,根據(jù)文獻(xiàn)[13]報道,C/C組合突變?yōu)镃/S組合通常不影響其剪接活性,因此本研究在不引入任何蛋白外顯子序列的前提下選取了3個插入位點(diǎn),分別為40S, 64S和200S,成功插入RecA-miniintein,克隆分別命名為pKH-40S-RecAmini, pKH-64S-RecAmin和 pKH-200S-RecAmini。RecA intein的全長是440個氨基酸,RecA-mini intein是將RecA intein全長序列中的歸巢核酸內(nèi)切酶去掉,只含有intein剪接必須的結(jié)構(gòu)域,長度為168個氨基酸。將分別含有3個重組質(zhì)粒的大腸桿菌10 μL涂布于氨芐平板以及氨芐和卡納雙抗平板后,平板計數(shù)。結(jié)果(表2)表明,只有64S位點(diǎn)插入RecA-miniintein具有卡納抗性,即可以發(fā)生蛋白剪接,而40S和200S位點(diǎn)處都不能發(fā)生剪接。鑒于其雙抗平板上的陽性克隆數(shù)相對較少,我們又嘗試將RecAintein的全長序列插入到64S的位點(diǎn)(pKH-64S-RecA),結(jié)果表明RecAintein全長比RecA-miniintein的剪接效率高。為了便于計數(shù)將1 μL過夜培養(yǎng)的菌液涂布3個平板,以雙抗平板菌落數(shù)與單抗平板菌落數(shù)相比計算,25 μg和50 μg卡那霉素濃度的平板上的菌落數(shù)比分別為105/305和32/305。
為了確認(rèn)雙抗平板上的陽性克隆是由于蛋白內(nèi)含子發(fā)生剪接恢復(fù)了pKH的卡那霉素抗性,分別從3個平板上挑取克隆采用Western Blot來驗證,使用anti-His抗體。根據(jù)基因序列預(yù)測融合蛋白RecA+KanR為77 ku,RecA為47 ku,M為Marker,結(jié)果如圖1所示。Western Blot結(jié)果與平板培養(yǎng)結(jié)果基本一致,剪接效率大約在30%,說明基于卡那霉素抗性的蛋白剪接抑制劑篩選系統(tǒng)的可行性。
表2 不同位點(diǎn)的卡那霉素抗性
圖1 pKH-64S-RecA的Western Blot結(jié)果
Figure 1 Western Blot analysis of the splicing activity of pKH-64S-RecA
圖2 DDP 對RecA intein的剪接抑制作用
為了進(jìn)一步驗證此篩選系統(tǒng)的可行性,將不同濃度的順鉑加入LB液體培養(yǎng)基中,通過檢測菌液的OD600直接反映順鉑對intein剪接活性的抑制作用。結(jié)果(圖2)顯示,以pKH為對照首先排除順鉑對大腸桿菌本身生長的影響,DDP濃度達(dá)到20 μmol/L時對大腸桿菌的生長產(chǎn)生較大影響,因此DDP的濃度控制在20 μmol/L以內(nèi)。結(jié)果表明隨著DDP濃度的升高,含有pKH-64S-RecA質(zhì)粒的大腸桿菌的生長受到嚴(yán)重抑制。由此表明依賴卡那霉素抗性的蛋白剪接抑制劑的體內(nèi)篩選系統(tǒng)是可行的,可直觀地通過大腸桿菌生長情況篩選蛋白剪接抑制劑,從而可以篩選抗結(jié)核藥物。
本研究將結(jié)核桿菌RecAintein插入卡那霉素抗性基因的多個位點(diǎn),篩選得到一個依賴蛋白剪接的卡那霉素抗性的蛋白剪接抑制劑篩選系統(tǒng),通過直觀地觀察大腸桿菌的卡那霉素抗性,可高通量地篩選針對蛋白質(zhì)內(nèi)含子的抗結(jié)核藥物,為結(jié)核病的治療開發(fā)新的藥物。本研究通過抗性平板菌落生長結(jié)果并結(jié)合Western Blot 驗證了RecAintein在pKH載體64S位點(diǎn)的剪接活性,充分證明了卡那霉素的抗性是依賴于intein的剪接。同時我們?yōu)榱诉M(jìn)一步驗證此系統(tǒng)的可行性,將文獻(xiàn)報道的可以作用于RecA intein剪接抑制的藥物DDP試用于該篩選系統(tǒng),結(jié)果表明含有pKH-64S-RecA質(zhì)粒的大腸桿菌對DDP非常敏感,這也充分證明了此系統(tǒng)可以成功應(yīng)用于針對intein的抗結(jié)核藥物的篩選。