拉薩地區(qū)青稞種植土壤中細(xì)菌多樣性高通量分析

劉青海, 潘 虎, 達(dá)娃卓瑪, 田 云, 劉虎虎, 王 翀, 盧向陽, 白軍平

(1. 西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院 農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測研究所， 拉薩 850032； 2. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 長沙 410128)

土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和組成多樣性有助于維持土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定與協(xié)調(diào)，同時(shí)能提高緩沖能力，防止土壤微生態(tài)環(huán)境的惡化[1]。土壤微生物群落的動態(tài)平衡是確保土壤健康的重要標(biāo)準(zhǔn)，有健康良好的土壤環(huán)境才能保證植物的健康生長[2-5]。青藏高原是地球上最高的高原板塊，是最早的高原，面積約為253×104km2，占中國領(lǐng)土面積的26%，它也是地球陸地生態(tài)系統(tǒng)中的重要一部分，它的平均海拔高度在4000 m以上，具有高寒、缺氧、降水少、日照長、輻射強(qiáng)等特點(diǎn)，其獨(dú)特的自然環(huán)境為微生物的生長提供了獨(dú)特條件[6-10]。植物、土壤和微生物的相互作用構(gòu)成植物、土壤和微生物的有機(jī)整體，土壤微生物在各個(gè)方面影響植物的生長和發(fā)育，土壤微生物降解有機(jī)物質(zhì)，合成次生代謝物，調(diào)節(jié)營養(yǎng)供應(yīng)，并影響植物生長、資源分配和多樣性[11-13]，因此，土壤微生物多樣性在植物生長發(fā)育和群落結(jié)構(gòu)演替中起著重要作用。本研究以高原特色農(nóng)作物青稞為研究對象，以青稞種植土壤為試驗(yàn)材料，通過Illumina高通量測序技術(shù)[14]分析青稞種植土壤中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)及多樣性，該研究不僅可增強(qiáng)對拉薩地區(qū)青稞農(nóng)田土壤細(xì)菌多樣性的認(rèn)識，為拉薩乃至青藏高原不同生境中細(xì)菌多樣性或資源的保護(hù)奠定基礎(chǔ)，而且為進(jìn)一步研究我國高寒地區(qū)微生物生態(tài)系統(tǒng)和開發(fā)利用有益的微生物資源提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品采集

根據(jù)西藏青稞生育期選擇3月25日(播種前期)、7月8日(灌漿期)、9月28日(收獲后期)在拉薩河谷地區(qū)選擇9塊大面積青稞種植農(nóng)田采集土壤樣品。土壤樣品采集采用五點(diǎn)取樣法，樣品混勻后用無菌塑封袋封裝，-18 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 土壤樣品基因組DNA的提取

采用TIANGEN公司土壤基因組DNA提取試劑盒(DP336)提取青稞種植農(nóng)田土壤樣品中細(xì)菌的總DNA，具體步驟按說明書操作。所提取的總DNA于-20 ℃保藏備用。

表1 拉薩地區(qū)土壤樣品采集信息

1.2.2 細(xì)菌16S rDNA-V3區(qū)的PCR擴(kuò)增及測序

用提取的總DNA為模板，采用細(xì)菌V3區(qū)通用引物 338F/518R(表2)擴(kuò)增目的片段，PCR擴(kuò)增體系(50 μL)如下：10×Buffer 5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)4 μL，引物各1 μL，TakaRaTaq(5 U/μL) 0.25 μL，模板1 μL，無菌水37.75 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。取2 μL PCR產(chǎn)物，2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至杭州晶佰生物科技有限公司進(jìn)行測序，測序平臺為Illumina Miseq。

表2 擴(kuò)增所用PCR引物

1.2.3 生物信息學(xué)分析

采用CASAVA(v1.8.2)軟件對原始測序結(jié)果圖像進(jìn)行圖像堿基識別，原始數(shù)據(jù)經(jīng)過預(yù)處理去除低質(zhì)量的序列后應(yīng)用Pandaseq(v2.7)和Trimmomatic(v0.33)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)優(yōu)化分析，獲得高質(zhì)量序列數(shù)據(jù)。計(jì)算在 97%的相似水平上每個(gè)樣本的操作分類單元(OTU)數(shù)量，并繪制稀疏曲線。利用Qiime(v1.9)軟件計(jì)算樣品包括Chaol指數(shù)和Shannon指數(shù)的α多樣性值，其Chaol指數(shù)值越高，表明群落物種的豐富度越高，Shannon指數(shù)值越高，表明群落物種的多樣性越高。

2 結(jié)果與分析

2.1 拉薩河谷地區(qū)土壤細(xì)菌多樣性分析

圖1 9個(gè)樣品的稀釋曲線

由圖1可知，所有土壤樣品的稀釋曲線最終均趨于平緩，說明此次測序深度全面地覆蓋了土壤絕大多數(shù)的細(xì)菌信息，數(shù)據(jù)能夠較好地反映土壤樣品中細(xì)菌群落區(qū)系組成；各個(gè)樣品及組的Chao豐度估計(jì)量、Shannon指數(shù)、測序深度指數(shù)、有效序列數(shù)及OUT數(shù)量見表3，所有樣品的測序深度指數(shù)均在0.85以上，表明隨著測序數(shù)量的增加發(fā)現(xiàn)新的細(xì)菌種類的概率較??；其中，Group 2組(7月8日、灌漿期)各樣品的Chao指數(shù)均低于Group 1組(3月25日、播種前期)和Group 3組(9月28日、收獲后期)，說明該階段的土壤細(xì)菌群落豐富度與其他兩個(gè)時(shí)期存在差異性變化；各樣品的Shannon指數(shù)均值大小為Group 1(3月25日、播種前期)

表3各個(gè)樣品的細(xì)菌群落多樣性

2.2 OTU分析和物種注釋

對OTUs的代表序列進(jìn)行物種注釋后，各個(gè)樣品中在屬(Genus)水平上豐度排名前15的物種見圖2，其中酸桿菌門(Acidobacteria)的Gp6、Gp4、Gp7和Gp16，芽單胞菌門(Gemmatimonas)的鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)和芽生球菌屬(Blastococcus)，放線菌門的Gaiella、節(jié)細(xì)菌屬(Arthrobacter)和類諾卡氏菌屬(Nocardioides)等成為該區(qū)域細(xì)菌中的優(yōu)勢種群。

圖2 屬水平上前15名細(xì)菌的相對豐度

2.3 組內(nèi)多樣品的物種差異性分析

對各組樣品的細(xì)菌群落進(jìn)行了主成分分析PCoA(principal coordinates analysis)。結(jié)果表明，各組的樣品間群落組成差異性不相同，且各組所表現(xiàn)的差異點(diǎn)也不一致(圖3)。

在Group 1中，2-1樣品和8-1樣品之間距離較近，說明微生物群落組成差異并不明顯，9-1樣品和6-1樣品與其他樣品之間距離較遠(yuǎn)，說明這兩個(gè)樣品與組內(nèi)其他樣品的群落組成差異最大；進(jìn)一步通過屬水平的Top15群落比較發(fā)現(xiàn)：9-1和6-1樣品中細(xì)菌群落分別缺少Spartobacteria_genera_incertae_sedis和Ilumatobacter，同時(shí)含有的Ohtaekwangia是同組其他樣品中所沒有的，而6-1中獨(dú)有的節(jié)細(xì)菌屬(Arthrobacter)也是引起群落組成差異顯著的重要原因。

在Group 2中，各樣品的群落組成相對均衡，而1-2、7-2和9-2的群落組成最相近，通過PCoA分析難以區(qū)分；在Group 3中，7-3、8-3和9-3的群落組成相近，通過PCoA分析難以區(qū)分；而3-3與4-3分別與組內(nèi)其他樣品的群落組成差異最大。進(jìn)一步通過屬水平的Top15群落比較發(fā)現(xiàn)：3-3和4-3樣品中細(xì)菌群落分別含有的Opitutus和假諾卡氏菌屬(Pseudonocardia)是其他樣品中所缺少的，這可能是引起群落組成差異顯著的重要表現(xiàn)。

圖3 各組樣品的主成分(PCoA)分析

2.4 組間多樣品的物種差異性分析

根據(jù)Group 1中屬層次上Top15群落序列數(shù)的統(tǒng)計(jì)信息，分析了Group 1中各樣品與Group 2、Group 3中對應(yīng)點(diǎn)樣品的差異物種，結(jié)果(表4)顯示，2號、3號、4號和8號樣品在不同時(shí)期群落組成相比，在Gp16、Gaiella、Ilumatobacter和Nocardioides數(shù)量上存在顯著差異。其中2-1號與2-2、2-3組成相比具有較多的Gp16(P<0.05)；8-1號與8-2、8-3組成相比具有較多的Gp16和Gaiella(P<0.05)；3-1號與3-2、3-3組成相比具有較少的Nocardioides和Ilumatobacter(P<0.05)；4-1號與4-2、4-3組成相比具有較少的Gaiella和Ilumatobacter(P<0.05)。

采用LSD多重比較，對不同時(shí)期的同一采樣點(diǎn)組間進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果(表5)顯示9個(gè)采樣點(diǎn)中除了7號樣點(diǎn)的群落組成未見顯著差異細(xì)菌，1號、2號、3號和8號組成具有1個(gè)顯著差異屬種；4號組成具有2個(gè)顯著差異屬種，而5號、6號和9號組成達(dá)到了3個(gè)顯著差異屬種。

表4 不同時(shí)期同一地點(diǎn)屬水平上前15名細(xì)菌的比較

表5 屬水平上組間各樣品差異物種

3 討論與結(jié)論

放線菌門和酸桿菌門是高寒地區(qū)土壤細(xì)菌群落的主要門[15-18]，如青藏高原草原[19]、青藏高原的Chaka湖和Athalassohaline湖[20]和其他20個(gè)湖泊[21]。本文首次采用Illumina高通量測序技術(shù)對青藏高原拉薩河谷地區(qū)9處不同青稞種植農(nóng)田土壤進(jìn)行了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)解析，研究發(fā)現(xiàn)農(nóng)田土壤中細(xì)菌的優(yōu)勢種群為酸桿菌門(Acidobacteria)的Gp6、Gp4、Gp7及Gp16，芽單胞菌門(Gemmatimonas)的鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)和芽生球菌屬(Blastococcus)，放線菌門的Gaiella、節(jié)細(xì)菌屬(Arthrobacter)和類諾卡氏菌屬(Nocardioides)，這與劉敏等[22]發(fā)現(xiàn)類似。西藏不同海拔高度的常見優(yōu)勢細(xì)菌群落是放線菌門、變形菌門和酸桿菌門，這也與大部分土壤中優(yōu)勢細(xì)菌群落特征類似[23]。Manoj等[24]使用高通量測序技術(shù)研究了北極圈土壤微生物多樣性，結(jié)果表明北極圈高寒地區(qū)土壤細(xì)菌與其他地區(qū)土壤細(xì)菌組成沒有本質(zhì)差別。本研究間接證明了這一觀點(diǎn)，青藏高原農(nóng)田土壤細(xì)菌種群與其他地區(qū)土壤細(xì)菌種群也無本質(zhì)差別。

農(nóng)田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)已有很多研究。劉振東等[25]利用高通量測序技術(shù)，對西藏主栽品種青稞根系和根系內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，研究發(fā)現(xiàn)青稞根際內(nèi)生細(xì)菌主要是變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似。羅建峰與曲東[26]研究發(fā)現(xiàn)西藏高原4個(gè)土樣的細(xì)菌主要體現(xiàn)在厚壁菌門和變形菌門中， XZ02和XZ12主要是芽孢桿菌和假單胞菌為主，不同采樣點(diǎn)土樣中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性和分布上都有差異。Liu等[27]對我國東北黑土農(nóng)田細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)酸桿菌的相對豐度平均為24.11%，是黑土農(nóng)田中第二大細(xì)菌群，僅次于變形菌(29.93%)。褚海燕[28]研究了小麥田間微生物群落的組成、多樣性和分布，結(jié)果表明放線菌、酸桿菌和變形菌是華北平原小麥細(xì)菌群落的優(yōu)勢菌群。不同地區(qū)農(nóng)田土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有一定差異，拉薩地區(qū)農(nóng)田土壤細(xì)菌中變形菌門和厚壁菌門數(shù)量較小，與其他一些研究[29-31]形成差異。

本研究發(fā)現(xiàn)不同時(shí)期各樣品的Shannon指數(shù)和OTU數(shù)量均值大小為Group 1(播種前期)

本研究發(fā)現(xiàn)拉薩河谷地區(qū)農(nóng)田土壤優(yōu)勢種群的酸桿菌、放線菌、芽單胞菌，還有很多細(xì)菌菌群未命名，其功能仍不清楚，還須進(jìn)行更深入的研究。