魚腥草素鈉及與紅霉素聯用對產膜表皮葡萄球菌lrgB的影響

官 妍, 許甘霏

(1. 安徽中醫(yī)藥大學 中西醫(yī)結合學院, 合肥 230012; 2. 安徽大學 生命科學學院, 合肥 230601)

表皮葡萄球菌已成為導致醫(yī)院內感染最主要的病原菌之一[1]。而表皮葡萄球菌致病與其易在人體內置的人工裝置(關節(jié)、隱形眼鏡、心臟瓣膜、留置導管等)表面形成生物膜密切相關。細菌生物膜(Biofilm，BF)是指細菌黏附于惰性或活性實體表面，被自身分泌的胞外黏質物所包裹，具有高度組織化的多細胞細菌群體結構[2]。由于細菌生物膜一旦形成，可導致相關感染的慢性、持續(xù)性、反復性和難控性，故而對臨床抗感染治療造成了諸多困難。

程序性細胞死亡(Programmed cell death，PCD)，是指由細胞內死亡程序介導的任何形式的細胞死亡，是個體發(fā)育中一個預定的，并受到嚴格控制的正常組成部分。其中的凋亡曾被認為是真核生物獨有的特征。Lewis[3]提出細菌的自溶或類似于PCD的過程，可以起到與真核生物PCD相似的作用。而與真核生物凋亡類似的Cid/Lrg[4]系統(tǒng)成為近年來研究的熱點。有關研究亦證實，cid、lrg操縱子調控的細菌細胞死亡和溶解對生物膜發(fā)展極為重要[5],其中l(wèi)rg突變株的生物膜溶解作用增強，大量死亡細胞堆積，說明lrg介導的對細菌死亡、溶解和生物膜的控制是十分重要的。

我們前期的研究[6]已證實，亞抑菌濃度的魚腥草素鈉及其與紅霉素聯用，對表皮葡萄球菌生物膜形成有顯著影響，對表皮葡萄球菌黏附和代謝均有抑制作用。因而，選擇魚腥草素鈉及其與紅霉素聯用，在不同時間段，觀察藥物對懸浮狀態(tài)下的產膜表皮葡萄球菌ATCC35984lrgB轉錄水平的影響，從分子水平評估魚腥草素鈉及其與紅霉素聯用抗產膜表皮葡萄球菌感染的效果。顯微鏡下觀察魚腥草素鈉及與紅霉素聯用對表皮葡萄球菌生物膜形態(tài)的影響，以檢驗藥物對表皮葡萄球菌生物膜的作用情況，為中藥及中西藥聯用治療由表皮葡萄球菌引起的相關臨床感染，提供相關依據和實踐參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗藥物

紅霉素標準品(中國食品藥品檢定研究院，批號130307-200716)；魚腥草素鈉標準品(中國食品藥品檢定研究院，批號100247-199601)；萬古霉素標準品(中國食品藥品檢定研究院，批號130360-201302)。

1.1.2 菌株

表皮葡萄球菌產膜標準菌株ATCC 35984 (復旦大學上海醫(yī)學院瞿滌教授饋贈)。

1.1.3 試劑

胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基TSB(杭州微生物試劑有限公司)；MH液體培養(yǎng)基(杭州微生物試劑有限公司)；二甲基亞砜(天津市光復精細化工研究所)；柱式細菌總RNA抽提純化試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；反轉錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司)；其余所用試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物合成

根據NCBI中 ATCC35984gryB和lrgB的基因序列，由上海生工生物有限公司設計和合成引物，引物擴增序列、片段大小見表1。

表1 實時熒光定量PCR相關基因引物序列

1.2.2 魚腥草素鈉、紅霉素、萬古霉素對ATCC35984最小抑菌濃度MIC的測定

以MH液體培養(yǎng)基采用連續(xù)稀釋法[7]，測定魚腥草素鈉、紅霉素及萬古霉素對ATCC35984的最低抑菌濃度(MIC)。

1.2.3 藥物對懸浮狀態(tài)下ATCC35984的干預

1)菌細胞制備。取2 mL 0.5 Mc的菌液于200 mL TSB液體培養(yǎng)基中(1%的接種量)，37 ℃ 150 r/min培養(yǎng)。分光光度計測OD600達到1.6時，4 ℃ 8000 r/min，離心30 min，棄上清。分別用新鮮的200 mL TSB培養(yǎng)基重懸細胞。

2)藥物處理。A：不添加藥物(陰性對照)；B：MIC萬古霉素(陽性對照)；C：1/2MIC萬古霉素(陽性對照)；D：MIC紅霉素；E：1/2MIC紅霉素；F：1/4MIC紅霉素；G：MIC魚腥草素鈉；H：1/2MIC魚腥草素鈉；I：1/4MIC魚腥草素鈉；J：1/2MIC魚腥草素鈉+1/2MIC紅霉素；K：1/4MIC魚腥草素鈉+1/4MIC紅霉素；L：1/8MIC魚腥草素鈉+1/8MIC紅霉素。

3)藥物處理后菌細胞的保存。陰性對照組及加入藥物的各組菌液，于37 ℃ 150 r/min培養(yǎng)。在1、6、12、24和48 h分別取樣10 mL于Ep管(經DEPC水處理并滅菌)中，4 ℃ 12 000 r/min離心8 min；棄上清后置-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 對ATCC35984 總RNA抽提

參照文獻[7]，取凍存于-70 ℃的菌體，抽提總RNA，置-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 目的基因表達的測定

參照文獻[7]，采用熒光定量 PCR 檢測ATCC35984菌株的lrgB轉錄水平。

1.2.6 藥物對生物膜作用情況的形態(tài)學觀察

參照文獻[8]，將預先滅菌的蓋玻片浸在濁度為0.5 Mc菌液的培養(yǎng)基中，分別培養(yǎng)6 h、1 d和3 d(每天換1次菌液)，使之成為未成熟或成熟的生物膜模型。為了觀察魚腥草素鈉和紅霉素聯用的效果，綜合以往研究結果[6]，實驗分別以1/4MIC 的紅霉素、1/4MIC 的魚腥草素鈉、 1/16MIC的魚腥草素鈉加1/4MIC的紅霉素為給藥濃度，對各模型分別作用6 h、1 d和3 d(每隔1天更換含藥培養(yǎng)基1次)。分別以結晶紫染色法[8]光鏡下觀察和鍍銀染色法[9]電鏡下觀察各模型形態(tài)的變化，根據其形態(tài)結構的變化情況判斷各藥物的作用效果。

1.2.7 數據分析

1)qRT-PCR結果計算。自動調節(jié)基線(Base line)至適合處，擴增曲線與閾值線的交叉點所對應的橫坐標，即為Ct值。根據標準曲線濃度與Ct值的對應關系，求出各待測標本的初始濃度。以gryB作內參基因，lrgB/gryB為衡量lrgB轉錄水平的指標。

2 結果與分析

2.1 魚腥草素鈉、紅霉素及萬古霉素對ATCC35984 MIC的結果

萬古霉素對ATCC35984 MIC為8 mg/L，紅霉素對ATCC35984 MIC為8 mg/L，魚腥草素鈉對ATCC35984 MIC為64 mg/L。

2.2 藥物干預后的目的基因表達

藥物作用1 h時，魚腥草素鈉及其與紅霉素聯用對lrgB的表達有明顯上調作用(P<0.05)，見圖1-A。而在6、12、24和48 h，亞抑菌濃度的魚腥草素鈉與紅霉素聯用，對lrgB的表達有明顯下調作用(P<0.05)，見圖1-B、C、D及E。

藥物干預時間(h)

*表示與陰性對照組比較 P ＜ 0. 05

2.3 藥物對生物膜作用的形態(tài)學觀察

隨著培養(yǎng)時間的增加，表皮葡萄球菌生物膜逐漸形成。在TSB中培養(yǎng)6 h時，放大1000倍觀察可見蓋玻片表面細菌均勻黏附分布，表明表皮葡萄球菌已經完成黏附(圖2-A)。與其對比，1/4MIC紅霉素對表皮葡萄球菌的黏附影響并不顯著，細菌黏附量未見明顯減少(圖2-B)。經魚腥草素鈉及與紅霉素聯合用藥后，蓋玻片表面細菌黏附量均有所減少(圖2-C、D)。培養(yǎng)1 d后，表皮葡萄球菌生物膜已經初步形成，可見細菌所分泌的黏性物質將細菌包裹其中，形成膜狀物(圖3-A)。而魚腥草素鈉、紅霉素及二者聯合用藥作用1 d后，生物膜結構均有明顯破壞(圖3-B、C和D)。

圖2 藥物對ATCC35984生物膜的影響(6 h, ×1000)

圖3 藥物對ATCC35984生物膜的影響(1 d, ×1000)

通過電鏡觀察培養(yǎng)3 d未加藥物干預的陰性對照，蓋玻片表面已形成了厚厚的生物膜(圖4-A)。與其比較，紅霉素作用3 d后，密集的生物膜結構被顯著破壞，但細菌細胞間尚存一些黏液質(圖4-B)。魚腥草素鈉作用3 d后，生物膜被嚴重破壞，只剩下分散的細菌，細菌間幾乎沒有了黏液質(圖4-C)。魚腥草素鈉和紅霉素聯合用藥3 d后，不僅生物膜被破壞，無黏液質，且細菌數量更少，細菌形態(tài)亦發(fā)生了改變(圖4-D)。

圖4 藥物對ATCC35984生物膜的影響(3 d, ×10 000)

3 討論與結論

目前已知細菌細胞裂解死亡的調控，主要由其自身的CidAB/LrgAB體系來完成；Brunskill等[10]在研究金黃色葡萄球菌中影響胞壁質水解酶活性和細菌自溶的一種新型雙組份調節(jié)系統(tǒng)——LytSR時發(fā)現了cid和lrg操縱子。兩種操縱子功能相反，它們通過控制胞壁質水解酶的釋放進而操縱細胞的命運。細菌的胞壁質水解酶參與細胞壁生長和肽聚糖再循環(huán)，在特定信號作用下可導致細胞壁破壞和細胞溶解，亦稱為“自溶素”。在表皮葡萄球菌中也存在與cid和lrg具有序列高度一致的基因，所以表皮葡萄球菌生物膜形成過程中可能存在與金黃色葡萄球菌相似的溶解調節(jié)機制[11]。

研究證實，一方面cid突變株導致胞壁質水解酶活性降低，lrg突變株可以引起胞壁質水解酶活性增強，說明cid、lrg操縱子編碼了“類穿孔素”和“類反穿孔素”[12]；另一方面，cid突變株溶解細菌能力缺失，產生的生物膜更加疏松，對表面物質黏附性下降，而lrg突變株的生物膜溶解作用增強，大量死亡細胞堆積，說明兩種突變對生物膜的形成都有不利影響[5]。由于lrgA、lrgB是受其上游lytSR調控的，是共轉錄的，而lytSR操縱子只表達于G+菌，且高度保守，lrgB又位于lrgA的下游，研究魚腥草素鈉及其與紅霉素聯用對lrgB的影響，就便于了解藥物對細胞溶解死亡和生物膜形成可能的作用。

本研究發(fā)現，魚腥草素鈉及其與紅霉素聯用在作用伊始(1 h)，對lrgB有顯著上調作用(圖1-A)。lrgB過量表達使細菌裂解死亡受阻，因此推測該階段藥物是通過抑制細菌分裂，降低細菌的黏附性發(fā)揮作用。在作用6、12、24和48 h時，亞抑菌濃度的魚腥草素鈉與紅霉素聯用，對lrgB表達亦有顯著下調作用(圖1-B、C、D及E)，表明在這幾個時間段，它們主要是通過引起細菌溶解死亡、破壞和溶解生物膜結構來發(fā)揮作用；形態(tài)學觀察亦證實了藥物作用效果的存在(圖2-4)。

目前，在治療感染性疾病方面，一般首選抗生素殺死細菌以控制感染。然而抗感染治療是一個漫長的過程，治療過程中抗生素的使用會導致病原菌對這些常規(guī)藥物逐漸產生耐藥性。院內感染分離株中，對萬古霉素中度耐藥的表皮葡萄球菌亦已出現并逐漸增多[13]。而中藥在抗細菌生物膜方面具有獨特的優(yōu)勢[14]。在人類面臨細菌耐藥性和抗生素不良反應不斷增加的嚴峻形勢下，對抗感染中藥的研究與探索就顯得更加重要與迫切[15]。

中藥及其有效成分對細菌耐藥具有逆轉作用并可減輕細菌選擇壓力，較少出現耐藥，在細菌細胞內作用途徑多樣化，能產生多方面的藥理效應。但由于中藥殺菌作用弱，起效慢等特點限制了其在臨床上的選用。鑒于細菌生物膜的結構與功能特點, 選擇中藥與抗生素聯合使用，一方面中藥發(fā)揮作用途徑多樣化、減緩和消除細菌耐藥性；另一方面抗生素發(fā)揮其殺菌作用強、起效快的特點，二者聯用可成為藥物減量增效的一種選擇。希望本研究以及本課題組的前期研究[16-20]能為中藥及中西藥聯用治療表皮葡萄球菌引起的相關感染提供實踐參考。