內(nèi)源性MHCⅠ類分子對海馬神經(jīng)元突起生長的影響

呂 丹， 周多奇

(安慶師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 皖西南生物多樣性研究與生態(tài)保護安徽省重點實驗室, 安慶 246133)

主要組織相容性復(fù)合體(Major histocompatibility complex，MHC)是編碼主要組織相容性蛋白的一組緊密連鎖且高度多態(tài)性的基因群，在人類稱為HLA(Human lymphocyte antigen)，在小鼠稱為H-2復(fù)合體(histocompatibility-2)[1]。MHC分子是重要的免疫蛋白，按其編碼基因結(jié)構(gòu)和功能的不同，可分為3類，其中MHCⅠ類分子是調(diào)節(jié)免疫細胞發(fā)育、調(diào)控T細胞應(yīng)答及NK細胞活性的關(guān)鍵分子。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)曾被認為是“免疫豁免”區(qū)，正常生理條件下神經(jīng)元不表達MHCⅠ類分子，僅在病毒感染等病理條件下才會被誘導(dǎo)表達[2]。但是，近二十年通過對小鼠、大鼠、貓、絨猴及人類的實驗研究逐漸表明，MHCⅠ類分子表達于正常神經(jīng)元，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中承擔(dān)一定的功能，主要參與突觸形成、精確突觸連接建立、突觸可塑性等事件[3-4]，進而影響運動、學(xué)習(xí)、記憶等活動[5]，并可能與一些神經(jīng)發(fā)育或神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，如孤獨癥、精神分裂癥、老年性癡呆、肌萎縮側(cè)索硬化等[6-8]。研究MHCⅠ類分子在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的功能及其工作機制具有重要的理論及臨床意義。

通過對人類及小鼠MHCⅠ類分子時空表達譜的檢測分析，在神經(jīng)元突起生長及突觸形成之前已可檢測到MHCⅠ類分子的表達，提示MHCⅠ類分子可能在神經(jīng)元突觸形成前已開始發(fā)揮一定的作用[9-10]。本研究以體外培養(yǎng)的小鼠海馬神經(jīng)元為研究對象，在神經(jīng)元突起生長之前可檢測到MHCⅠ類分子的表達，并且進一步獲得結(jié)果提示內(nèi)源性MHCⅠ類分子具有限制神經(jīng)元突起生長、分支的作用；同時，在免疫系統(tǒng)中作為MHCⅠ類分子配體發(fā)揮作用的PirB(paired immunoglobulin-like receptor B)分子具有類似功能。本研究為進一步探究MHCⅠ類分子在神經(jīng)系統(tǒng)的新功能及其作用機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本研究使用的野生型及經(jīng)典MHCⅠ類重鏈基因敲除(H-2Kb/Db-/-)小鼠均為C57BL/6J小鼠，H-2Kb/Db-/-小鼠由東南大學(xué)HLA實驗室惠贈。將性成熟的雌、雄鼠于下午16：00前合籠，取出生當天(P0)小鼠用于海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)。實驗動物的飼養(yǎng)及處理均遵循人道主義原則。

1.2 海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)

P0小鼠海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)參照Kaech和Banker報道的方法[11]。取24孔細胞培養(yǎng)板，加入100 μg/mL多聚-D-賴氨酸包被的蓋玻片，將經(jīng)過胰液消化過濾的海馬神經(jīng)細胞懸液種于24孔板中。種板30 min后，換含有B27(美國Invitrogen公司)、GlutMAX(美國Invitrogen公司)及D-葡萄糖(美國Sigma-Aldrich公司)的Neurobasal培養(yǎng)液(美國Gibco公司)。對于抗體阻斷實驗，在種板后30 min換培養(yǎng)液時加入相應(yīng)濃度的抗-MHC I類分子抗體(OX18，美國Abcam公司)、抗-PirB抗體(美國Santa Cruz公司)或同種型IgG對照抗體(美國Invitrogen公司)。

1.3 免疫染色

收集體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元，新鮮配制的 4%多聚甲醛室溫固定細胞20 min；加入0.25% Triton X-100處理細胞15 min并進行BSA封閉；去除封閉液，加入新鮮封閉液配置的抗β-III-tubulin 一抗(美國covance公司，1∶5000)，4 ℃孵育過夜；用新鮮封閉液配制的熒光二抗，室溫避光孵育1 h； DAPI襯染后封閉，熒光顯微鏡下觀察、拍照；利用Image J插件Sholl Analysis對圖片神經(jīng)元分支數(shù)進行分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實驗均重復(fù)3次以上；數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標準誤的形式表示，并利用配對t檢驗進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 神經(jīng)元突起生長前MHCⅠ類分子的表達

原位雜交及免疫組化的檢測結(jié)果顯示，在小鼠胚胎發(fā)育過程中，神經(jīng)元前體細胞可檢測到MHCⅠ類分子[10]。對體外培養(yǎng)0 d(div 0)的小鼠海馬神經(jīng)元進行檢測，結(jié)果顯示在神經(jīng)元突起未生出之前，可在細胞膜觀察到MHCⅠ類分子的表達(圖1)。

圖1 海馬神經(jīng)元表達MHCⅠ類分子

2.2 抗MHCⅠ類分子抗體促進神經(jīng)元突起生長

已有研究報道，外源性添加重組的MHCⅠ類分子可以抑制視網(wǎng)膜外植體[12]及背根節(jié)細胞神經(jīng)突的生長[13]。為了探究內(nèi)源性表達的MHCⅠ類分子對神經(jīng)元突起生長是否有影響，在海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)體系中加入抗MHCⅠ類分子的特異性抗體OX18，用以阻斷內(nèi)源性MHCⅠ類分子信號通路，并在48 h后對神經(jīng)元進行β-III tubulin熒光染色，觀察神經(jīng)元突起生長情況。染色結(jié)果顯示，相較于加入同源抗體的對照組，加入OX18抗體阻斷神經(jīng)元MHCⅠ類分子信號通路后，海馬神經(jīng)元突起分支數(shù)目顯著增加(圖2)。

2.3 經(jīng)典MHCⅠ類分子敲除小鼠海馬神經(jīng)元突起數(shù)目增多

為了進一步證實內(nèi)源性MHCⅠ類分子對神經(jīng)元突起生長、分支的影響，我們對野生型及經(jīng)典MHCⅠ類基因H-2Kb/Db敲除小鼠的海馬神經(jīng)元進行體外培養(yǎng)，48 h后進行β-III tubulin熒光染色。染色結(jié)果顯示：相比于野生型小鼠，來源于H-2Kb/Db敲除小鼠的海馬神經(jīng)元突起數(shù)目顯著增加(圖3)。該結(jié)果進一步提示內(nèi)源性MHCⅠ類分子具有限制海馬神經(jīng)元突起生長、分支的功能。

Control：同源抗體對照組；OX18抗體濃度為5.0 μg/mL；*表示差異顯著(P ＜ 0. 05)

圖2 抗體阻斷MHCⅠ類分子信號通路促進神經(jīng)突起生長

Figure 2 The branch number of neurons increased by anti- MHCⅠ antibody

WT：wild type，野生型；KO：knockout，H-2Kb/Db基因敲除型；**表示差異極顯著(P ＜ 0. 05)

圖3 缺乏MHCⅠ類分子表達神經(jīng)元突起數(shù)目增多

Figure 3 Increased branch number of H-2Kb/Dbknockout neurons

2.4 抗PirB抗體促進神經(jīng)元突起的生長

免疫系統(tǒng)中，MHCⅠ類分子可通過與PirB分子相互作用發(fā)揮免疫功能。已有研究結(jié)果證實神經(jīng)元表達PirB分子，且在神經(jīng)元突觸修正過程中發(fā)揮一定作用[14]。那么，MHCⅠ類分子是否可能通過PirB分子發(fā)揮抑制神經(jīng)元突起生長的功能？我們在海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)體系中加入抗PirB分子的抗體，48 h后β-III tubulin熒光染色結(jié)果顯示：加入抗PirB分子抗體阻斷其信號通路后，海馬神經(jīng)元突起數(shù)目增加(圖4)，類似于加入抗MHCⅠ類分子抗體的結(jié)果。

Control：同源抗體對照組；抗PirB抗體濃度為1.0 μg/mL

圖4 抗體阻斷PirB分子信號通路促進神經(jīng)突起生長

Figure 4 The increased branch growth of neurons by anti- PirB antibody

3 討論

免疫蛋白MHCⅠ類分子在神經(jīng)元中表達，并對突觸數(shù)目及功能有重要的影響。通過對MHCⅠ類分子的時空表達譜檢測分析發(fā)現(xiàn)，MHCⅠ類分子在神經(jīng)元突起生長之前已有表達，提示MHCⅠ類分子可能在神經(jīng)元突觸形成前已開始行使一定功能。有研究報道顯示：體外培養(yǎng)來源于神經(jīng)元特異性過表達H2-Db分子(NSE-Db)的小鼠海馬神經(jīng)元，其神經(jīng)突起的生長及極化速率顯著增強[15]；相較于來源于野生型小鼠的丘腦外植體，來自于NSE-Db小鼠的丘腦外植體的延伸受到抑制[16]；同時，H-2KbDb敲除小鼠大腦皮層2/3層的錐體神經(jīng)元樹突分支較野生型增多[17]。這些結(jié)果均提示MHCⅠ類分子可能參與神經(jīng)元突起生長、分支的過程。為了探究內(nèi)源性MHCⅠ類分子是否能夠影響神經(jīng)元突起生長，我們對小鼠海馬神經(jīng)元進行了體外培養(yǎng)，并在不同條件下檢測了海馬神經(jīng)元突起分支數(shù)目。

首先，利用MHCⅠ類分子特異性的抗體(OX18)來阻斷MHCⅠ類分子信號通路。在免疫系統(tǒng)的多個研究已證實抗體OX18可以阻斷MHCⅠ類分子信號通路，導(dǎo)致MHCⅠ類分子功能的缺失[18]。利用OX18抗體阻斷MHCⅠ類分子信號通路后，體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元突起數(shù)目顯著增加；進一步對經(jīng)典MHCⅠ類分子敲除小鼠的海馬神經(jīng)元進行體外培養(yǎng)，結(jié)果同樣顯示MHCⅠ類分子缺失導(dǎo)致海馬神經(jīng)突起數(shù)目的增加。上述結(jié)果均提示，在原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中，內(nèi)源性MHCⅠ類分子參與神經(jīng)元突起的生長過程，具有限制海馬神經(jīng)突起生長的作用。

在免疫系統(tǒng)中，MHCⅠ類分子具有控制細胞間相互識別及調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答強度的功能。在T細胞應(yīng)答過程中，T細胞通過其細胞表面受體(T cell receptor, TCR)能夠識別并結(jié)合抗原遞呈細胞表面的MHC分子-抗原肽復(fù)合體，并通過CD3分子向胞內(nèi)傳遞抗原信號，活化T細胞[19]。但是，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中并未檢測到神經(jīng)元表達功能性TCR[20]。另一方面，PirB分子也可作為經(jīng)典MHCⅠ類分子的配體在小鼠免疫系統(tǒng)中發(fā)揮作用。已有結(jié)果表明PirB mRNA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達， PirB基因敲除小鼠可模擬MHCⅠ類分子基因敲除小鼠的一些異常表型，如視皮層突觸密度增加等，外源性PirB分子能以MHCⅠ類分子依賴的方式與皮層神經(jīng)元結(jié)合，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及突觸重塑等過程中發(fā)揮重要作用，推測中樞神經(jīng)系統(tǒng)中PirB分子同樣可能與MHCⅠ類分子相互作用發(fā)揮功能[21-22]，故猜想PirB分子是否可能同樣參與海馬神經(jīng)元突起生長過程。在海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)體系中加入抗PirB分子的抗體，檢測結(jié)果表明在加入抗PirB分子抗體后，神經(jīng)元突起數(shù)目顯著增加，與加入抗MHCⅠ類分子抗體的結(jié)果類似，提示MHCⅠ分子可能與PirB分子共同作用參與調(diào)控海馬神經(jīng)元突起數(shù)目。

MHCⅠ類分子在正常的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有廣泛表達，不僅在突觸形成期，在胚胎期及老年期也有表達，其在神經(jīng)系統(tǒng)的新功能有待進一步挖掘。本研究的結(jié)果初步提示內(nèi)源性的MHCⅠ類分子具有限制海馬神經(jīng)元突起生長的功能，為深入研究神經(jīng)元MHCⅠ類分子的新功能及其機制提供了一些基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。