鳥類SLC2A4基因及其編碼蛋白GLUT4分子進化分析

劉 剛， 李清月， 汪 沖， 劉曉穎

(安徽醫(yī)科大學 生命科學學院， 合肥 230032)

動物的生命活動都需要大量的能量，不同動物雖然食物來源不同，但在體內都需要先轉化為葡萄糖來提供能量[1-2]。細胞對葡萄糖的攝入需要借助細胞膜上的葡萄糖轉運蛋白(Glucose transporters，GLUT)才能得以實現(xiàn)[3-5]。迄今，被鑒定出來的GLUT共6種，即GLUT1～5和GLUT7，葡萄糖轉運蛋白-4(glucose transporter type 4，GLUT4)是骨骼肌吸收和利用葡萄糖的關鍵蛋白，也是目前研究較多的葡萄糖轉運體蛋白家族成員之一。GLUT4 主要分布于骨骼肌細胞中，是骨骼肌吸收和利用葡萄糖的關鍵蛋白，與骨骼肌的收縮密切相關，該蛋白能夠在信號通路的調控下轉移到細胞膜表面，參與骨骼肌細胞跨膜主動吸收葡萄糖[5-10]。GLUT4是由包含11個外顯子的SLC2A4基因進行編碼，研究表明，SLC2A4基因敲除的小鼠會出現(xiàn)嚴重的胰島素抵抗以及葡萄糖耐受等不良癥狀，表明GLUT4在動物的骨骼肌葡萄糖吸收、血糖穩(wěn)態(tài)維持以及骨骼肌運動等方面發(fā)揮極其重要的作用[11-14]。

鳥類飛翔時需要消耗骨骼肌產生的大量能量，因此，鳥類不但需要高效的血糖調節(jié)機制，而且還需要一個能夠快速將葡萄糖轉運到骨骼肌細胞內的重要介導蛋白[15-16]。大量的生理學研究表明，GLUT 4是鳥類骨骼肌細胞吸收葡萄糖的最主要轉運蛋白，從而為鳥類的飛行活動提供能量[17-18]。因此，鳥類在飛翔中的高耗能活動，能夠促使GLUT 4更加活躍的轉運葡萄糖。研究表明，SLC2A4基因及其表達產物GLUT4在哺乳動物中發(fā)生了強烈的進化選擇，與其他動物相比，鳥類飛翔需要高的能耗，我們推測該基因在鳥類中極可能發(fā)生了適應性進化，同時我們推測SLC2A4基因及其表達產物GLUT4在善于飛翔的鳥類和不善于飛翔的鳥類中可能發(fā)生不同的適應性進化[19-20]。本文選取了NCBI上已經公開發(fā)表且注釋較完善的17種鳥類SL2A4基因及其編碼的GLUT4作為研究對象，通過生物信息學的方法對該基因的結構、特征、基因進化速率及系統(tǒng)發(fā)育關系進行分析，探討該基因在不同鳥類類群中是否發(fā)生了適應性進化，為鳥類SL2A4基因和GLUT4的進一步研究提供有用的信息。

1 材料與方法

1.1 研究對象的選取及數(shù)據(jù)來源

為了研究SLC2A4基因及其表達產物GLUT4在鳥類中的適應性進化，同時結合GenBank上已經釋放的注釋完整的數(shù)據(jù)，選取了今鳥亞綱(Neornithes)中的突胸總目(Carinatae)和平胸總目(Ratitae)鳥類為研究對象(表 1)。研究中的突胸總目主要包括Anseriformes、Columbiformes、Passeriformes和Galliformes等4目14種鳥類，推測該類群鳥類具有較為高效的GLUT4轉運效率。該類鳥類的主要特征為善于飛翔，具有與飛行相關的生理結構特征：具充氣性骨骼(氣質骨)，最后4～6枚尾椎骨愈合成一塊尾綜骨，胸骨具有龍骨突起結構，具有適宜于飛行的發(fā)達的骨骼肌，肋骨上有鉤狀突起；翼發(fā)達、正羽發(fā)達、羽小枝上具小鉤，構成羽片。本研究中的突胸總目主要包括Apterygiformes、Struthioniformes和Tinamiformes等3目3種鳥類，推測該類群鳥類的GLUT4轉運效率較低。該類鳥類主要特征不善于飛翔，生理結構特征主要為翼退化、胸骨不具龍骨突起，不具尾綜骨，羽毛均勻分布、羽枝不具羽小鉤，不形成羽片。平胸總目的著名代表為Apteryxrowi、Dromaiusnovaehollandiae和Nothoproctaperdicaria。本研究中所有物種拉丁名參照整合分類信息系統(tǒng) ITIS(Integrated Taxonomic Information System，www.itis.gov)。下載GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)迄今為止已釋放且注釋較完善的17種鳥類SLC2A4基因序列及其編碼的GLUT4(表 1)。由于SLC2A4基因及其表達產物GLUT4在模式生物小鼠(Musmusculus)內研究較為透徹，另下載小鼠相應序列(NM_009204)作為參考進行比較研究。

表1本研究物種來源及SLC2A4基因序列的GenBank登錄號Table 1 Species examined and GenBank Accession No. of SLC2A4 in this study

1.2 SLC2A4基因序列和GLUT4分析

對從GenBank中下載的SLC2A4基因全長mRNA使用MEGA 7.0分析其堿基組成；GLUT4的理化性質主要利用ExPASy在線軟件(http://web.expasy.org/protparam/)進行分析，通過SignalP4.1 Server軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測信號肽位點；GLUT4的疏水性/親水性通過ExPASy服務器的ProtScale程序中的K-D法(http://web.expasy.org/protscale)進行分析；通過GORIV在線分析平臺(https://npsa-prabi.ibcp.fr)預測其二級結構，蛋白質糖基化位點利用在線分析平臺(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)進行分析。

1.3 進化速率分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

采用PAML軟件包對SLC2A4基因進行選擇壓力分析。使用PAML4軟件中的CODEML程序，采用基于密碼子(codon-based)的分析方法計算非同義替換率(nonsynonymous substitution，dN)和同義替換率(synonymous substitution，dS)的比率(ω，dN/dS)。ω值是檢測自然選擇的重要參數(shù)，如果ω=1，基因則受中性進化(neutral selection)，ω<1時基因受純化選擇purifying selection)，ω>1則認為基因受正選擇(positive selection)。模型的估算輸入的物種樹參考相關鳥類系統(tǒng)關系資料，我們選用了以下幾種模型進行選擇壓力分析：1)用free-ratio模型估算進化樹上每一枝的ω值；2)用two-ratio模型估算前景枝Gallusgallus的ω值(ω1)和背景枝除Gallusgallus外的所有枝的ω值(ω0)。最后對兩種模型進行似然率(Likelihood Ratio Test，LRT)檢驗用以判定該模型的統(tǒng)計方法是否具有顯著性。LRT需要用free-ratio與one-ratio模型、two-ratio與one-ratio模型的似然值之差的二倍去查詢卡平方表來判定是否推翻零假設(null)而接受備則假設(alternative)。

為了更好地分析SLC2A4基因在鳥類中的分子進化，以小鼠作為外群，以SLC2A4基因編碼的GLUT4作為分子標記構建17種鳥類的系統(tǒng)發(fā)育樹。具體方法如下：把所有GLUT4序列用CLUSTALX 2.1進行比對，用MEGA 7.0軟件轉變成進行修剪并轉換成“.nex”格式文件進行數(shù)據(jù)模型選擇，最終選取AIC模式下的模型應用于系統(tǒng)樹的構建。采用PAUP 4.10軟件構建最大似然法(ML樹)系統(tǒng)樹，建樹前先使用Modeltest v 3.7選擇最優(yōu)模型，然后將所得最優(yōu)模型寫入PAUP 4.10軟件命令行中，建樹執(zhí)行快速支持度分析并在一次單獨的程序運行中搜索最佳分值的ML樹的方法，自舉檢驗100次。貝葉斯推論法構建系統(tǒng)樹(BI樹)用MrBayes 3.1.2軟件建立，建樹前先使用Modeltest v3.7選擇最優(yōu)模型，運行4個馬爾可夫鏈，每100代抽樣1次，運行100萬代，去除老化樣本。

2 結果與分析

2.1 SLC2A4基因的核苷酸序列分析

17種鳥類SLC2A4基因序列長度在990～1719 bp之間，平均長度為1446 bp，其中最短的為Parusmajor，最長的為Coturnixjaponica(表2)。SLC2A4基因的AT含量在26.0%～53.3%之間，GC 含量在46.7%～74.0%之間(表2)。

2.2 GLUT4分析

17種鳥類的SLC2A4基因編碼的GLUT4進行分析，其長度在329～572 AA之間，平均長度為481 AA，其中最短的是Parusmajor，最長的為Coturnixjaponica。GLUT4序列信號肽剪切位點在氨基酸序列的第11位與21位之間，Gallusgallus位于第48位，而Parusmajor位于第57位。在17種鳥類中，GLUT4分子質量在 35 424.4～59 310.9之間，平均分子量為52 550.89；等電點在5.09～9.58之間，平均等電點為6.53；不穩(wěn)定指數(shù)在38.52～79.99之間。在鳥類中所有GLUT4分子為親水性蛋白，總平均疏水性-0.54～-0.285之間(表3)。通過對GLUT4蛋白分子糖基化位點分析表明，N-糖基化個數(shù)在1～2之間，而O-糖基化個數(shù)在29～50之間(表4)。通過對GLUT4二級結構預測，發(fā)現(xiàn)17種鳥類蛋白質分子均不存在跨膜結構(圖1)。

表2 17種鳥類SLC2A4基因堿基含量分析Table 2 Nucleotide composition (%) of SLC2A4 among 17 birds

藍色為α螺旋結構，紅色為β片層結構，紫色為無規(guī)則卷曲結構(以Anasplatyrhynchos為例)

圖1 GLUT4二級結構
Figure 1 Secondary structure of GLUT4

2.3 進化速率和系統(tǒng)發(fā)育分析

通過對編碼GLUT4的SLC2A4基因的進化壓力分析發(fā)現(xiàn)，14種突胸總目(Carinatae)鳥類ω值1.195，具有明顯的正選擇效應；而3種平胸總目(Ratitae)鳥類ω值0.433，有純化選擇作用；17種鳥類的ω值為0.685；使用PAML程序包對選擇壓力進行分析，均未檢測到正選擇位點。使用Datamonkey的SLAC算法，17種鳥類GLUT4找到4個正選擇位點，46個負選擇位點(P=0.01)。

研究中系統(tǒng)發(fā)育樹圖的枝長和拓撲結構源于貝葉斯推斷法樹圖，通過構建GLUT4系統(tǒng)發(fā)育樹。結果顯示系統(tǒng)發(fā)育樹分為兩枝：Ratitae分為第一枝，包括Struthioniformes、Apterygiformes和Tinamiformes 3個目； Carinatae構成第二枝，即Galliformes、Anseriformes、Columbiformes和Passeriformes(圖2)。

表3 GLUT4的氨基酸理化性質分析Table 3 Physicochemical property of GLUT4

表4 GLUT4的糖基化分析Table 4 Glycosylation analysis of GLUT4

3 討論

SLC2A4基因及其編碼蛋白GLUT4是細胞轉運葡萄糖的主要轉運體，是維持機體葡萄糖穩(wěn)態(tài)的關鍵因素，該蛋白質是細胞在胰島素刺激的情況下發(fā)生的急性反應，主要表達在脂肪、心肌和骨骼肌等對胰島素相對敏感的組織中，與骨骼肌細胞的能量產生具有重要作用[3,22]。研究表明，敲除小鼠的SLC2A4基因會出現(xiàn)嚴重的胰島素抵抗和葡萄糖耐受不良等癥狀，表明該基因在動物血糖穩(wěn)態(tài)維持等方面發(fā)揮極其重要的作用[11-12,21]。通過對SLC2A4基因的長度、堿基變異分析，發(fā)現(xiàn)在鳥類中該基因具有較高的變異率。本研究的結果發(fā)現(xiàn)該基因在平胸總目和突胸總目鳥類中發(fā)生了明顯的適應性進化，平胸總目鳥類中該基因選擇壓力ω<1，表明該基因選擇壓力為純化選擇作用，可能是由于與該總目的鳥類不善于飛翔，骨骼肌耗能較小，因此只需要較少的葡萄糖相關。在對突胸總目鳥類中，該基因在進化過程中發(fā)生了顯著的選擇壓力的變化，即ω>1，表明該基因經歷明顯的正選擇作用，這可能與該總目鳥類普遍善于飛翔，需要大量的能量，因此骨骼肌細胞需要吸收大量的葡萄糖來維持能量的需求。研究結果表明，在不同的物種中GLUT4均具有明顯的糖基化修飾，通過改變其空間結構增加蛋白質的穩(wěn)定性[23-24]，本研究對鳥類的GLUT4研究發(fā)現(xiàn)，尤其是在突胸總目鳥類中均具有大量的糖基化位點，這些糖基化位點為能夠加速葡萄糖的轉運，推測可能與鳥類飛翔時需要大量的能量有關。通過對GLUT4蛋白分子二級結構預測，發(fā)現(xiàn)17種鳥類蛋白質分子均不存在跨膜結構，與小鼠蛋白存在明顯區(qū)別[25-26]。

圖2 基于GLUT4序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

ML和BI系統(tǒng)發(fā)生樹分為Ratitae和 Carinatae兩枝，且獲得了較高的支持率，與形態(tài)學分類結果相吻合，表明該系統(tǒng)樹均能夠很好地反映物種進化的歷史[27-28]，這說明SLC2A4 基因編碼的GLUT4蛋白具有較強的系統(tǒng)發(fā)育意義，可以作為研究鳥類進化的理想分子標記。