人胃內(nèi)因子在谷氨酸棒桿菌中的表達及活性研究

董貴彬， 潘穎越， 司雅楠， 王新月， 白仲虎， 劉秀霞， 楊艷坤

(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室 江南大學 生物工程學院， 無錫 214122)

人胃內(nèi)因子(Gastric intrinsic factor，gif，GIF)是一種由胃黏膜壁細胞產(chǎn)生的糖蛋白(NCBI Reference Sequence: NP_005133.2；GeneID:2694)，具有結(jié)合并保證維生素B12有效吸收的功能。有人通過該作用機制提出了一種口服給藥方式，可以保證藥物不被降解且被人體有效吸收[1]。在人體內(nèi)，GIF的缺乏將直接導致機體無法正常吸收維生素B12，進而引起機體患惡性貧血[2]。Mottram等人通過小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)GIF缺失會導致機體免疫力下降，易感染腸道沙門氏菌等病菌[3]。GIF由胃黏膜壁細胞產(chǎn)生，存在于人的胃腸道內(nèi)，與食物中的VB12結(jié)合后通過小腸吸收，在維持機體健康中扮演著重要角色，但是目前尚未有關(guān)于表達生產(chǎn)人胃內(nèi)因子的研究報道。

此前，C.glutamicum主要應用于各種氨基酸和醇等小分子的生產(chǎn)[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，其在蛋白表達上同樣具有優(yōu)勢。它不產(chǎn)內(nèi)毒素，胞外水解酶活性低，能夠產(chǎn)生正確折疊的外源蛋白[6]。目前已有用C.glutamicum表達scFv、EGFP、VHH和淀粉酶等外源蛋白報道[7-9]。C.glutamicum可以作為一種優(yōu)良的宿主用于各種蛋白的發(fā)酵生產(chǎn)[10-11]，尤其是一些對內(nèi)毒素等嚴格限制的藥用蛋白。本研究擬利用谷氨酸棒桿菌CGMCC1.15647(C.glutamicumCGMCC1.15647)進行藥用蛋白人胃內(nèi)因子的表達生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

E.coliDH5α和C．glutamicumCGMCC1.15647由本實驗室保藏。pXMJ19保藏于本實驗室；pUC57-kan由蘇州金唯智有限責任公司提供。

1.1.2 主要試劑與儀器

PrimeSTAR? Max DNA Polymerase，DNA Ligation Kit購自TAKARA公司；Hind III、BamH I購自Thermo公司；DNA凝膠回收、PCR純化和質(zhì)粒小量提取試劑盒均購自Axygen公司；人胃內(nèi)因子(GIF)ELISA檢測試劑盒購自ImmunoClone公司。

PCR儀購自LongGene公司；超聲破碎儀購自sonics公司；AKTA蛋白純化儀購自通用電氣公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB和LBB[LB添加1%(W/V)腦心浸出液]若用到固體，均補加1.8%(W/V)瓊脂粉，若用到氯霉素或卡那霉素抗生素，針對E.coli和C.glutamicum的工作濃度分別為30和10 μg/mL。

1.2 方法

1.2.1 基因合成

從NCBI獲取天然人胃內(nèi)因子的氨基酸序列，對其編碼序列進行密碼子優(yōu)化，由蘇州金唯智有限公司進行序列合成，獲取重組基因克隆載體pUC57-kan-rgif。

1.2.2 表達載體pXMJ19-rgif的構(gòu)建

以pUC57-kan-rgif為模板，以rgif-F和rgif-R為引物，PCR克隆rgif。引物序列如下：

rgif-F:5′-TTCGAAGCTTAAAGGAGGACAACCATGGCCTGGTTTGCCCTG-3′(直線為Hind III位點，曲線為RBS)；

rgif-R:5′-CCGGGGATCCTTAATGATGATGATGAT GATGATACTGGGTGAAATTGGCG-3′(直線為BamH I位點，曲線為His標簽)。

采用分子克隆技術(shù)將pXMJ19和rgif構(gòu)建表達載體pXMJ19-rgif(圖1)，經(jīng)氯化銣法轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，篩選得到陽性克隆菌。

1.2.3C．glutamicum/pXMJ19-rgif的構(gòu)建

采用文獻所述轉(zhuǎn)化方法[12]將構(gòu)建好的質(zhì)粒pXMJ19-rgif電擊轉(zhuǎn)化C．glutamicum獲得表達菌株C．glutamicum/pXMJ19-rgif，并通過菌落PCR進行陽性克隆菌的驗證。為了能夠更好地反映GIF的表達情況，同時構(gòu)建空質(zhì)?？寺．glutamicum/pXMJ19做對照。

圖1 rgif的基因合成和pXMJ19-rgif的構(gòu)建

1.2.4C．glutamicum/pXMJ19-rgif和C．glutamicum/pXMJ19的誘導表達

C．glutamicum/pXMJ19-rgif和C．glutamicum/pXMJ19分別接種于5 mL氯霉素抗性的LBB，于30 ℃ 220 r/min培養(yǎng)過夜，之后轉(zhuǎn)接到100 mL新鮮的氯霉素抗性LBB，培養(yǎng)10 h時分別添加100 μL濃度為100 mmol/L的IPTG，繼續(xù)發(fā)酵18 h后收獲菌體進行蛋白分析。

1.2.5C．glutamicum/pXMJ19-rgif的發(fā)酵條件優(yōu)化

根據(jù)預實驗以及查閱文獻[13]，研究誘導劑濃度，誘導時機，發(fā)酵時長和發(fā)酵溫度對C．glutamicum/pXMJ19-rgif發(fā)酵產(chǎn)GIF的影響。本優(yōu)化采用正交試驗設計，各因素的水平如表1所示，試驗安排如表2所示。

1.2.6 WB結(jié)果灰度分析

使用Image J對GIF的WB結(jié)果進行灰度分析，間接對GIF進行定量。

1.2.7 GIF蛋白純化及定量

表1 GIF發(fā)酵條件正交試驗因素與因素水平

取20 mL發(fā)酵液，收集菌體沉淀，用10 mL鎳柱純化溶液A重懸菌體，并進行超聲破碎，于12 000 r/min離心10 min收集上清，選用HisTrap FF進行目標蛋白純化，用溶液B洗脫目標蛋白。按照文獻[14]所述方法，進行蛋白定量。

1.2.8 GIF活性分析

取發(fā)酵表達GIF的菌體破碎液上清，用人胃內(nèi)因子(GIF)ELISA檢測試劑盒，嚴格按照說明書操作，進行GIF活性檢測。

2 結(jié)果

2.1 pXMJ19-rgif的構(gòu)建

rgif基因片段PCR克隆、pXMJ19空質(zhì)粒酶切以及pXMJ19-rgif表達載體構(gòu)建酶切驗證結(jié)果如圖2所示，rgif基因序列長度為1254 bp，與圖示大小相符。得到的表達載體pXMJ19-rgif經(jīng)酶切和測序驗證無誤。

1：PCR克隆rgif；2：pXMJ19空載體酶切；3：pXMJ19-rgif雙酶切驗證

1:rgifcloning by PCR; 2: enzyme digestion of empty pXMJ19 vector; 3: double enzyme digestion verification of pXMJ19-rgif

圖2 表達載體pXMJ19-rgif的構(gòu)建與驗證

Figure 2 Construction and verification of the expression vector pXMJ19-rgif

2.2 表達菌株C．glutamicum/pXMJ19-rgif的構(gòu)建

電轉(zhuǎn)獲取的表達菌株C．glutamicum/pXMJ19-rgif和C．glutamicum/pXMJ19經(jīng)PCR驗證均無誤。

2.3 C．glutamicum/pXMJ19-rgif和C．glutamicum/pXMJ19的誘導表達

C．glutamicum/pXMJ19-rgif和C．glutamicum/pXMJ19在相同的條件下進行了發(fā)酵試驗。GIF在C.glutamicum中的表達情況如圖3所示。結(jié)果顯示GIF可以在谷氨酸棒桿菌中大量表達，但是只有部分可溶。

2.4 正交試驗優(yōu)化C．glutamicum/pXMJ19-rgif發(fā)酵產(chǎn)GIF

使用ImageJ對正交試驗收獲菌體的WB結(jié)果進行灰度分析，比較各試驗組WB條帶的灰度值間接對比GIF的表達量差異，結(jié)果如表2所示。通過比較不同實驗組條帶的灰度值可知，在試驗組9 A3B3C2D1的試驗條件下，GIF的表達量最高。通過分析各因素的K值可知，GIF的產(chǎn)量在本次試驗中，隨著誘導劑濃度從50 μmol/L增加到100 μmol/L而增加，之后降低；隨著誘導時間從0推遲到10 h持續(xù)增加；隨著發(fā)酵時長從18 h增加到22 h而增加，之后降低，隨著發(fā)酵溫度從23 ℃增加到37 ℃持續(xù)降低。

A:WB 分析；B:SDS-PAGE分析；1：C．glutamicum/pXMJ19菌體可溶總蛋白；2：C．glutamicum/pXMJ19-rgif菌體可溶總蛋白；3：C．glutamicum/pXMJ19菌體破碎沉淀總蛋白；4：C．glutamicum/pXMJ19-rgif菌體破碎沉淀總蛋白

A: WB assay;B: SDS-PAGE assay;1: Soluble protein ofC.glutamicumBZH001/pXMJ19; 2:Soluble protein ofC.glutamicumBZH001/pXMJ19-rgif;3: Insoluble protein ofC.glutamicumBZH001/pXMJ19; 4: Insoluble protein of C.glutamicumBZH001/pXMJ19-rgif

圖3 GIF在C．glutamicum中的表達

Figure 3 Expression of GIF inC.glutamicumBZH001

2.5 GIF發(fā)酵表達及純化定量

以正交試驗推測的最佳發(fā)酵條件，在轉(zhuǎn)接后10 h添加終濃度100 μmol/L的誘導劑，在23 ℃條件下發(fā)酵22 h后收獲菌體進行蛋白提取純化，純化結(jié)果如圖4所示，成功獲取GIF純品。經(jīng)計算，GIF的產(chǎn)量約為47.15 mg/L。

表2 GIF發(fā)酵條件正交試驗優(yōu)化實驗組合表

1：總蛋白；2：流穿蛋白；3：洗脫蛋白

1: Total protein; 2: Loss protein; 3: Target protein

圖4 GIF表達純化

Figure 4 GIF purification

2.6 GIF活性分析

根據(jù)人胃內(nèi)因子(GIF)ELISA檢測試劑盒建立的方法繪制GIF標準品與VB12競爭抑制的標準曲線。隨著GIF標準品濃度的增大，吸光度隨之減弱。采用Logistic曲線擬合獲得擬合方程為：y=1.04/[1+(x/320.67)^1.43]+0.02。發(fā)酵表達GIF菌體破碎液樣品經(jīng)測量產(chǎn)量為42.3 mg/L。

3 討論

人胃內(nèi)因子對于人體健康非常重要，它的缺失會導致惡型貧血的發(fā)生，同時可以降低人體免疫力。谷氨酸棒桿菌在蛋白的表達上具有巨大的潛力，尤其是其具有不產(chǎn)內(nèi)毒素的特點，使該菌特別適合于藥用蛋白的生產(chǎn)。

用原核生物表達人源蛋白目前還存在很大的限制。例如，大腸桿菌在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生內(nèi)毒素，原核生物普遍缺少蛋白修飾能力等，這對蛋白的表達和利用是很不利的。但是，谷氨酸棒桿菌作為一種食品級的微生物具有不產(chǎn)內(nèi)毒素的優(yōu)點。與真核細胞相比，原核生物還具有發(fā)酵周期短，培養(yǎng)成本低，便于基因操作，效益高等優(yōu)點，有利于外源蛋白的發(fā)酵放大。

在可查閱的文獻范圍內(nèi)，本研究是第一篇在C.glutamicum中表達GIF的研究，雖然存在部分不可溶蛋白，但通過正交試驗對GIF發(fā)酵條件進行優(yōu)化后得到極大的改善。除了發(fā)酵溫度，同時優(yōu)化誘導劑濃度、誘導時機和發(fā)酵時長。分析正交試驗各因素R值可知，發(fā)酵溫度、誘導時機、發(fā)酵時間和誘導劑濃度對GIF表達的影響依次減弱。交互作用分析正交試驗誘導劑濃度和誘導時機時發(fā)現(xiàn)，誘導劑濃度發(fā)生變化時，GIF表達量隨著誘導時機的變化也發(fā)生變化，兩者存在交互作用。另外誘導劑濃度和發(fā)酵時長、誘導時機同發(fā)酵時長也同樣表現(xiàn)出交互作用。目前得到最優(yōu)發(fā)酵組合是：誘導劑濃度100 μmol/L，誘導時機10 h，發(fā)酵時長22 h，發(fā)酵溫度23 ℃。該發(fā)酵條件下，GIF的產(chǎn)量經(jīng)人胃內(nèi)因子(GIF)ELISA檢測試劑盒定量達到42.3 mg/L，與純化定量存在差異，推測與谷氨酸棒桿菌缺乏糖基化修飾有關(guān)[15]。本研究是目前第一個在C.glutamicum中表達GIF的研究，為GIF的原核表達提供了一種可能的選擇，并初步研究了GIF表達的主要限制因素。本研究發(fā)現(xiàn)優(yōu)化發(fā)酵溫度和誘導劑加入時機可以進一步有效提高GIF的可溶性表達，這可能是因為適當?shù)牡蜏睾驼T導時機的控制促進了GIF的正確折疊。為了更好地開發(fā)谷氨酸棒桿菌用于外源蛋白的表達，人為引入必要的蛋白修飾通路將是一個很有前景的研究方向。另外，對于修飾有嚴格要求的蛋白，在不考慮發(fā)酵成本的情況下也可以選擇酵母、哺乳動物細胞等具有修飾能力的生物進行糖蛋白的表達。