在乳腺癌細胞中構建CRISPR多基因編輯系統(tǒng)

梅義， 王真， 戴曉峰

(1. 江南大學 生物工程學院， 無錫 214122； 2. 江南大學 醫(yī)學院， 無錫 214122)

CRISPR技術作為一種常見的基因編輯手段被使用于在各個領域中，其中對于沒有剪切活性的CRISPR-dCas9編輯系統(tǒng)的應用同樣越來越廣泛[1-5]。例如在微生物中，有團隊利用CRISPR-dCas9基因編輯系統(tǒng)在鏈霉菌中實現(xiàn)了多基因的抑制[4]；在植物中，基于CRISPR-dCas9系統(tǒng)實現(xiàn)了多重轉錄激活或者抑制效果[6]。但是在乳腺癌研究中，關于CRISPR-dCas9多基因編輯系統(tǒng)的應用卻鮮有報道。乳腺癌是嚴重威脅女性健康的腫瘤疾病之一，也是全球女性中發(fā)病率最高的腫瘤疾病[7-8]，如果在乳腺癌研究中構建一套簡單、高效、精確、可靠的基因編輯技術，將有利于腫瘤基礎研究。

2006年，Takahashi等[9]首次發(fā)現(xiàn)導入特定的轉錄因子OCT4、KLF4、MYC和SOX2，可以將已經(jīng)分化的細胞重新編程，使已分化的細胞回歸到胚胎細胞狀態(tài)，得到了具有重新分化潛力與自我更新能力的多能干細胞，這4個基因誘導形成的多能干細胞也成了科研人員所常用的細胞模型[10-11]。在本研究中，作者通過將tRNA與sgRNA串聯(lián)組合，構建了一套CRISPR-dCas9多基因編輯系統(tǒng)，并在MCF7、SUM149PT細胞系中對OCT4、KLF4、MYC和SOX2 4個轉錄因子進行調控，進一步在基因表達、蛋白表達以及功能改變3個層次進行檢測，以此驗證系統(tǒng)的穩(wěn)定與可靠性。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗所用細胞系MCF7、SUM149PT來源于美國模式菌種收集中心(American Type Tissue Culture Collection，ATCC)；DMEM、F12培養(yǎng)基購于HyClone公司，胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS)購于Lonsera公司；CRISPR相關編輯質粒購于愛必夢生物科技有限公司；CCK-8檢測試劑盒購于東仁化學公司；ALDEFLUORTM試劑盒購于STEMCELL Technologies公司；超純RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒以及熒光定量PCR試劑盒購于Takara公司；GAPDH、OCT4、KLF4、MYC及SOX2抗體購于Proteintech公司。

1.2 方法

1.2.1 多基因串聯(lián)質粒的構建

利用內(nèi)源性tRNA自剪切系統(tǒng)的原理來改造構建多串聯(lián)sgRNA (single guide RNA)，將構建好的多基因多sgRNA片段用BbsI單酶雙切處理后同載體質粒進行酶切連接，得到4基因串聯(lián)好的目的質粒。4基因的sgRNA序列如下：

基因sgRNA1sgRNA2OCT4GGAAAACCGGGAGACACAACGGATGTTTGCCTAATGGTGGKLF4CTCTTTCCGCCTGTTCCCGGCAGTTCACGCTGCACAGTGSOX2AAACAGCACTAAGACTACGTGCCCCCTTTCATGCAAAACCMYCAGCTAGAGTGCTCGGCTGCCGAACCCGGGAGGGGCGCTTA

1.2.2 細胞培養(yǎng)與轉染

細胞系MCF7用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，細胞系SUM149PT用含有5%FBS的F12培養(yǎng)基，置于37 ℃，5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。將構建好的CRISPR質粒與LipofectamineTM2000按1∶3轉入到細胞中，轉染4 h后換新鮮培養(yǎng)基，24 h后添加200 mg/mL的G418與0.1 mg/mL的puromycin抗生素篩選。

1.2.3 實時定量qPCR

將6孔板內(nèi)轉染好的細胞用Trazol消化下來后，使用RNA提取試劑盒按步驟提取總的RNA，取1 μg提取的RNA使用反轉試劑盒進行操作即得到cDNA，將cDNA稀釋成終濃度為10 ng/μL，按反應布局向96孔板或八孔條中加入8 μL PCR反應混合液，再加入2 μL模板cDNA溶液，用透明膠膜封好96孔板或用8孔條蓋封好8孔條，用Vortex震蕩混勻后離心收集溶液到管底，按PCR程序用ABI 7500運行PCR反應。各基因的qPCR引物如下：

基因正向引物(5′-3′)反向引物(5′-3′)OCT4GGGAGATTGATAACTGGTGTGTTGTGTATATCCCAGGGTGATCCTCKLF4CGGACATCAACGACGTGAGGACGCCTTCAGCACGAACTSOX2GCTTAGCCTCGTCGATGAACAACCCCAAGATGCACAACTCMYCGGCTCCTGGCAAAAGGTCACTGCGTAGTTGTGCTGATGTERCAGGCATTCGGTTTGATGAGTTTGGACGAAGTACAGTTCCCGHER2TGTGACTGCCTGTCCCTACAACCAGACCATAGCACACTCGGGAPDHCCCACTCCTCCACCTTTGACATGAGGTCCACCACCCTGTT

1.2.4 Western Blot檢測

胰酶消化細胞離心后用預冷的磷酸鹽緩沖液重懸洗滌,加入100 μL細胞裂解液(加入1%的PMSF)吹吸混勻后放置于冰上裂解10 s左右，10 000 r/min 4 ℃離心5 min，得到上清液后加入5×loading buffer，煮沸5 min，冷卻后即可上樣跑膠，結束后轉膜，200 mA恒流轉膜90 min，轉膜結束后，用TBST洗滌3遍后用封閉液(TBST加5%BSA配制)室溫封閉120 min，再洗滌3遍膜，置于一抗稀釋液中過夜，再洗滌3次后置于二抗稀釋液中120 min，隨后添加顯色液上機檢測。

1.2.5 細胞遷移實驗

將細胞鋪板于6孔板待其長滿后，吸取培養(yǎng)基，用槍頭在孔中劃直線，用PBS清洗3遍后加入含1%血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)。分別在0、8、16和24 h拍照記錄。

1.2.6 細胞增殖實驗

將細胞鋪板于96孔板，每孔細胞數(shù)為4000個，分別在24、48及72 h后重新?lián)Q液后添加5 μL的CCK8試劑，并于37 ℃孵育2 h后置于450 nm處測定吸光度。

1.2.7 干細胞比例檢測

將細胞鋪板于6孔板中，每孔接種3×105個，待其處理后放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸去培養(yǎng)基，用PBS清洗2次后用無EDTA的胰酶消化，1000 r/min，離心5 min后棄掉上清液，用PBS重懸；1000 r/min離心5 min后棄上清，添加分析緩沖液重懸細胞，制5×105cells/mL的細胞懸液，每500 μL懸液作為一個細胞樣品；分別取500 μL細胞懸液加入到兩個管子中，其中一個管子要先加入10 μL二乙氨基苯甲醛(DEAB)，然后再分別加入2.5 μL活化的氟硼二吡咯-氨基乙醛-乙酸氨基丙二酸二乙酯(BAAA)，混勻，37 ℃避光孵育30～40 min，1000 r/min，離心5 min后棄掉上清液，每個管子用500 μL分析緩沖液重懸細胞，制備好細胞樣品；將流式管低溫，避光放置使用流式細胞儀檢測干細胞比例。

2 結果與分析

2.1 CRISPR-dCas9多基因編輯系統(tǒng)的構建

內(nèi)切酶RNaseP與RNaseZ兩種酶可以特異性識別tRNA[12]兩端序列從而達到剪切的作用。通過設計，將OCT4、KLF4、MYC及SOX2 4個轉錄因子的sgRNA與tRNA相連接構建成串聯(lián)的sgRNA質粒，再配合沒有酶切活性的C端修飾有協(xié)同激活介質(SAM)的dCas9-SAM質粒轉染進乳腺癌細胞內(nèi)，就可以實現(xiàn)同時調控多個基因的目的，其后通過抗生素篩選并進行單細胞培養(yǎng)即可得到基因編輯后細胞。實驗結果顯示，通過CRISPR-dCas9系統(tǒng)調控，MCF7細胞形態(tài)明顯變化，顯示出了外部形態(tài)上的差異，出現(xiàn)了多能性干細胞外部特征(圖1)。將其命名KMSO。以上結果初步揭示，CRISPR-dCas9多基因編輯系統(tǒng)構建成功并正常工作。

圖1 串聯(lián)質粒的構建與表達

2.2qPCR與Western Blot結果分析

將MCF7、SUM149PT細胞通過CRISPR-dCas9基因編輯技術高表達OCT4、KLF4、MYC和SOX2 4個基因后進行轉錄水平檢測。qPCR實驗結果(如圖2-A和圖2-B)顯示，在MCF7細胞中，4個轉錄因子的表達量相對于對照組都提高至少2倍以上，其中KLF4基因的表達量更是達到16倍(P<0.001)，在SUM149PT細胞中，4個基因的表達量在基因編輯前后也發(fā)生了明顯的變化(P<0.001)。qPCR實驗結果在轉錄水平驗證了CRISPR-dCas9基因編輯系統(tǒng)的成功構建。選擇MCF7細胞系進行Western Blot實驗檢測，結果顯示其蛋白表達層次與基因表達層次一致(圖2-C)，將蛋白檢測結果通過灰度值量化分析軟件統(tǒng)計后得到圖2-D，結果顯示各基因蛋白表達至少提高了2.62倍，Western Blot實驗結果在蛋白表達水平證明了CRISPR-dCas9多基因編輯技術在乳腺癌細胞MCF7中可以同時調控多達4個基因，實現(xiàn)了多基因編輯的目的。

2.3MCF7細胞在基因編輯后增殖、遷移和干細胞比例的變化

MCF7細胞在CRISPR-dCas9多基因編輯技術下使得OCT4、KLF4、MYC和SOX2 4個基因高表達。通過細胞劃痕實驗發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)8、16及24 h后，其遷移能力明顯的增強(圖3)。通過CCK8試劑測定后發(fā)現(xiàn)KMSO細胞的增殖能力顯著增強，細胞的存活率提高50%(圖4-A)，同時通過流式細胞儀測定被熒光標記的乙醛脫氫酶(ALDH)的活性底物BAA(BodipyTM-aminoacetate)，結果顯示KMSO細胞的干細胞比例明顯增大，干細胞比例由2.57%增加到18.5%(圖4-B)。以上結果進一步表明CRISPR-dCas9多基因編輯技術在乳腺癌細胞中實現(xiàn)了編輯目的，使得MCF7細胞惡性程度增大。

A：MCF7細胞轉錄水平的檢測；B：SUM149PT細胞轉錄水平的檢測；C：MCF7細胞蛋白水平檢測；D：MCF7細胞蛋白表達量化圖。* P ＜ 0. 05; ＊＊P ＜ 0. 01; ＊＊＊P ＜ 0. 001

圖2 重編程細胞的轉錄水平與蛋白水平表達

Figure 2 Transcription level and protein level expression in reprogrammed cells

A: MCF7與KMSO細胞劃痕實驗圖；B：劃痕實驗量化圖。* P ＜ 0. 05; ＊＊P ＜ 0. 01; ＊＊＊P ＜ 0. 001

圖3 細胞重編程對MCF7遷移能力的影響

Figure 3 Effect of cell reprogramming on MCF7 cell migration

3 討論與結論

本研究中采用了被廣泛使用的CRISPR編輯技術[1,3,5,12-13]，此項技術被不斷的優(yōu)化與改進[14]并被應用在不同的物種中。例如，Xie等利用內(nèi)源性tRNA剪切系統(tǒng)可以準確地切割tRNA前體的兩端，將其設計成一個簡單、通用的平臺，提高了CRISPR/Cas9系統(tǒng)的靶向性和多重編輯能力，并且在水稻中成功的證明了該系統(tǒng)可以指導Cas9編輯多個染色體靶點[15]。亦有報道稱將dCas9系統(tǒng)優(yōu)化后，可以在體內(nèi)精確地轉錄激活神經(jīng)系統(tǒng)中的多個基因和長鏈非編碼RNA，此技術在轉基因小鼠上得到驗證，為科研工作提供了一個靈活、快速的篩選平臺[16]。而在乳腺癌的研究領域中，使用CRISPR多基因編輯系統(tǒng)的報道相對較少[17-18]，本實驗則提供了一套標準、精確、可復制、高效的基因編輯工具，可以實現(xiàn)在乳腺癌細胞中多個基因的同時調控，為接下來的科研工作提供了基礎且強大的基因編輯平臺。

A: MCF7與KMSO對細胞增殖的影響； B：流式細胞術檢測MCF7與KMSO的干細胞比例

圖4 細胞重編程對MCF7與KMSO細胞增殖和干細胞比例的影響

Figure 4 Effect of cell reprogramming on MCF7 and KMSO cell proliferation and stem cell ratio

Takaishi等人報道通過重編程OCT4、KLF4、MYC和SOX2 4個轉錄因子使得鱗狀細胞癌發(fā)生了上皮間質轉化，并且發(fā)現(xiàn)了這種重編程降低了腫瘤的惡性程度[19]。而在本研究中，通過CRISPR/dCas9多基因編輯系統(tǒng)，成功在MCF7、SUM149PT細胞系中實現(xiàn)了4個轉錄因子的調控，并且使得MCF7細胞發(fā)生了分化[20]改變程度，得到了一株高分裂、高增殖及高干性的新細胞系KMSO。初步說明了不同分化程度的乳腺癌亞型之間與OCT4、KLF4、MYC及SOX2存在著一定的調控關系。這為低分化、高干性乳腺癌尋求轉化成高分化，低干性的乳腺癌而獲得有效治療提供了一個治療策略。

綜上所述，本研究通過在乳腺癌細胞系MCF7、SUM149PT中高表達OCT4、KLF4、MYC和SOX2 4個細胞重編程轉錄因子，并且在基因表達、蛋白表達以及功能改變3個層次進行驗證，揭示了CRISPR/dCas9多基因編輯系統(tǒng)的成功構建，為后續(xù)乳腺癌研究工作提供了基本的實驗工具。