NRG1在非小細胞肺癌中的表達及機制的研究

劉 靜，曹書華，趙 喜，楊云琳，寧方玲 (.濱州醫(yī)學院，山東 煙臺 56603；.德州市第二人民醫(yī)院，山東 德州 53005)

肺癌無論是發(fā)病率還是死亡率，歷年來都高居惡性腫瘤的首位。在肺癌的發(fā)病占比中，小細胞肺癌總體數(shù)量穩(wěn)定，但非小細胞肺癌的發(fā)病比例仍有上升趨勢，且疾病譜也不斷發(fā)生變化。相對于既往鱗癌占多數(shù)，最新的數(shù)據(jù)顯示腺癌所占比例呈快速上升[1]。雖然靶向治療為部分非小細胞肺癌的治療提供了新的治療選擇，但仍有很大一部分患者療效欠佳。 因此，明確非小細胞肺癌的發(fā)病機制，選擇新的治療靶點成為目前臨床的熱點和難點。

神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白 1 (Neureg-ulin-1, NRG-1)是NRG基因家族成員之一，又稱神經(jīng)膠質(zhì)細胞生長因子(GGF1)，它是從牛垂體中純化而得到的[2-4]。在結(jié)構(gòu)上從屬于表皮生長因子家族(EGFR)。最早發(fā)現(xiàn)分布于發(fā)育中的心室內(nèi)膜，不表達于大的動靜脈及主動脈，只在心內(nèi)膜和心肌微血管中表達[6]。近些年國外相關研究顯示， NRG-1與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，且其發(fā)生作用的過程中導致多種與腫瘤相關的信號通路分子改變[7]。但其在肺癌中是否也存在表達異常尚未得到很好的探索。在本研究中，筆者回顧性分析了我院在2013年1月1日～2014年12月31日行肺癌根治術的患者，探討NRG-1在肺癌中的表達及與下游信號通道蛋白PI3K的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料：在本研究中，收集2010年1月1日～2013年12月31日于德州市第二人民醫(yī)院行肺癌根治術的患者石蠟標本，總計132例，分析病變組織及癌旁組織免疫組化表達。納入標準：所有患者均經(jīng)病理證實為非小細胞肺癌，且術前未行新輔助放化療，隨訪資料完整。全組患者年齡32～76歲，平均(53.13±14.47)歲，根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟手術病理分期，全組分為Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期；其中腺癌70例，鱗癌62例。

1.2主要試劑及儀器：兔抗人NRG-1單克隆抗體、PI3K單克隆抗體及免疫組化試劑盒購自美國Abcam公司。

1.3免疫組化染色及結(jié)果判定標準：免疫組化具體過程參照試劑盒說明書進行。判定標準：陽性細胞百分率評分標準：0～10%為0分，>10%～25%為1分，>25%～50%為2分，50%～75%為3分，>75%為4分。陽性細胞染色強度評分標準：無著色為0分，微弱著色為1分，中等強度著色為2分，強著色為3分。將以上兩組結(jié)果相乘，得出評估范圍為0～12分，0分為(-)，1～2分為(+)，3～4分為(++)，5～12分為(+++)。(-)～(+)為低表達，(++～+++)為高表達。

1.4預后隨訪：主要采用電話隨訪方式，主要觀察指標為總存活時間(Overall Survival，OS)，隨訪截止日期2018年12月31日。

1.5統(tǒng)計學方法：采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料采用χ2檢驗，相關分析采用Spearman秩相關，Kaplan-Meier生存分析描繪生存曲線，Log-rank檢驗比較不同組之間生存差異；以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1NRG-1、PI3K在肺癌中的表達：經(jīng)免疫組化檢測，NRG-1和PI3K陽性表達主要著色于細胞漿，部分表達于細胞膜。NRG-1在癌組織中陰性表達46例，弱陽性43例，中度陽性26例，強陽性17例，高表達率32.6%(43/132)；癌旁組織陰性表達21例，弱陽性40例，中度陽性39例，強陽性32例，高表達率為53.8%(71/132)，經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=12.104，P=0.001)。PI3K在癌組織中陰性表達30例，弱陽性33例，中度陽性27例，強陽性42例，高表達率為52.3%(69/132)；癌旁組織陰性表達51例，弱陽性46例，中度陽性18例，強陽性17例，高表達率為26.5%(35/132)，經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=8.340，P<0.001)。見圖1。

A：NRG-1在非小細胞肺癌中陽性表達；B：PI3K在非小細胞肺癌中陽性表達

2.2NRG-1、PI3K與肺癌臨床病理因素的相關性：NRG-1表達在不同分期、病理分級之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，在不同年齡、性別、病理類型間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而PI3K表達僅在不同分期之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 NRG-1、PI3K和肺癌臨床病理特征的關系(例)

臨床特征NRG-1表達高表達低表達P值PI3K表達高表達低表達P值年齡≤60歲20390.77126330.090>60歲23504330性別男30610.88643480.085女13282615TNM分期Ⅰ期8120.0156140.018Ⅱ期22312528Ⅲ期13563821病理類型腺癌25420.23834330.721鱗癌18473530病理分級高分化790.0446100.437中分化25373329低分化11433024

2.3NRG-1與PI3K表達的相關性研究：為進一步明確NRG-1與PI3K表達之間的相關性，采用Spearman秩相關檢驗分析二者在132例肺癌患者的表達之間的相關性，結(jié)果顯示NRG-1與PI3K表達之間呈負相關，差異有統(tǒng)計學意義(r=-0.407，P=0.012)。見表2。

2.4NRG-1、PI3K表達與預后之間的關系：至隨訪截止，全組患者隨訪時間7～86個月，平均生存時間(41.3 ±17.4)個月， 1 年生存率為93.6 %， 3 年生存率為61.3 %，5年生存率31.6 %。根據(jù)NRG-1、PI3K表達將肺癌患者分為高表達組和低表達組，通過Log-Rank檢驗進行比較并繪制Kaplan-Meier曲線(見圖2、3)。結(jié)果顯示：NRG-1低表達組OS明顯差于高表達組，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=5.224,P=0.022)；PI3K低表達組OS明顯優(yōu)于高表達組，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=7.786,P=0.005)。

表2 NRG-1與PI3K之間的相關性(例)

NRG-1表達PI3K表達-++++++r值P值-4131019-0.4070.012+591019++13742+++8432

圖2 NRG-1表達與非小細胞肺癌患者OS的關系

圖3 PI3K表達與非小細胞肺癌患者OS的關系

3 討論

非小細胞肺癌的發(fā)生及發(fā)展是多病因、多步驟的過程，它的病因是極其復雜的， 受到多種基因的調(diào)控，其中抑癌基因的失活和癌基因的激活與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。NRG-1能夠誘導多功能干細胞分化的機制已經(jīng)開始研究，并且發(fā)現(xiàn)在誘導分化的過程中microRNA作為干細胞向細胞分化的中間介質(zhì)，在體外實驗發(fā)現(xiàn)不同劑量NRG-1在不同時間干預干細胞的分化后會產(chǎn)生不同的結(jié)果[8,9]，最早有報道說NRG-1可以增加鼠胚胎干細胞分化為心肌細胞，但不具有特異性[10]。除此之外，NRG-1還被發(fā)現(xiàn)參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。在人的食管癌中發(fā)現(xiàn)NRG-1的表達水平降低[11]。提示其可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮抑癌作用。

在本研究中，通過回顧性分析非小細胞肺癌患者病理標本的NRG-1表達，發(fā)現(xiàn)其在非小細胞肺癌中表達降低，并且和腫瘤的分期、組織分化有關，提示其參與了非小細胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展過程，并且與非小細胞肺癌的預后密切相關，與文獻報道一致。為進一步明確NRG-1發(fā)揮作用的機制，筆者同時研究了EGFR下游信號通路蛋白PI3K的表達，發(fā)現(xiàn)PI3K在肺癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，二者相關性分析顯示呈明顯負相關，提示NRG-1有可能通過PI3K途徑對非小細胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移的過程發(fā)揮作用。

綜上所述，本組實驗發(fā)現(xiàn)NRG-1在非細胞肺癌中表達降低，并可能通過PI3K途徑發(fā)揮作用，提示NRG-1可能是非小細胞肺癌的抑癌基因，可作為非小細胞肺癌的預后判斷的指標之一，有望成為新的治療靶點。