東方百合‘索邦’組蛋白去乙?；富? LoSorHDA1的克隆與表達(dá)分析

蒙 娟，楊 捷，彭夢(mèng)笛，賈桂霞，何恒斌

(花卉種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家花卉工程技術(shù)研究中心，城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實(shí)驗(yàn)室，教育部林木花卉育種實(shí)驗(yàn)室，北京林業(yè)大學(xué) 園林學(xué)院，北京100083)

乙?；亲钤绫谎芯康谋碛^遺傳修飾[1]。研究表明，組蛋白的乙?；且阴；D(zhuǎn)移酶(HATs)和去乙酰化酶(HDAC)共同協(xié)調(diào)控制的一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程，參與調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄[2-3]。去乙酰化酶基因(HD1)最早在人類中發(fā)現(xiàn)并克隆[4]，隨后HDACs在其他動(dòng)物以及植物中相繼被發(fā)現(xiàn)。根據(jù)酵母HDACs的分類，植物的HDACs家族被分為三大類：RPD3/HDA1-like，SIR2-like和HD2，其中HD2亞家族是植物所特有的，首次在玉米(Zeamays)中被鑒定出來(lái)[5-6]。

在模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)中，共鑒定出18個(gè)HDACs成員，目前與人類HDACs家族成員數(shù)量一致[7]，但亞組分類上有一定差異，其中HDA1-like 12個(gè)，HDT 4個(gè)，SIR 2個(gè)。研究表明，HDACs蛋白不直接與DNA結(jié)合發(fā)揮功能，而是與其他蛋白結(jié)合以轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的形式與DNA互作[8]，廣泛參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育以及脅迫響應(yīng)過(guò)程[5]。AtHDA1-like亞家族成員都含有一個(gè)組蛋白去乙?；附Y(jié)構(gòu)域，在該結(jié)構(gòu)域中含有一些與去乙?；δ苊芮邢嚓P(guān)的活躍結(jié)合位點(diǎn),包括鋅指結(jié)構(gòu)等，這些位點(diǎn)對(duì)去乙酰化修飾的發(fā)揮具有促進(jìn)作用[9]。擬南芥中，HDA1可以與SCL15、VAL2、TPL、AP2、LEUNIG等蛋白互作，參與調(diào)控?cái)M南芥的種子成熟、成花轉(zhuǎn)變及花器官發(fā)育等重要發(fā)育過(guò)程[10-14]，尤其是在花器官中，AtHDA1的表達(dá)量較高，并且其突變體植株花發(fā)育異常。此外，HDA1在植物防御反應(yīng)和脅迫反應(yīng)中也發(fā)揮重要功能：AtHDA1與AtHDA6具有功能冗余，兩者與AtSin3、AtERF4 和 AtERF7形成抑制復(fù)合物，通過(guò)去乙酰化修飾抑制ABA以及非生物脅迫的響應(yīng)[15]；AtHDA1與WRKY38/62、MSI1互作，參與了水楊酸、乙烯和茉莉酸等信號(hào)通路防御反應(yīng)的響應(yīng)[16-18]。

除擬南芥外，在水稻(Oryzasativa)、楊樹(shù)(Populustrichocarpa)、香蕉(Musanana)等其他植物中也有與HDA1功能相關(guān)的研究，但在觀賞植物中少有報(bào)道。百合是重要的鮮切花和園林花卉，由于其花大艷麗、花香等特點(diǎn)而被廣泛地使用，但關(guān)于百合乙酰化等表觀遺傳調(diào)控以及其HDAC基因家族功能等相關(guān)的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)以切花百合的一個(gè)主要品種‘索邦’(Liliumoriental hybrid‘Sorbonne’)為研究材料，克隆到LoSorHDA1基因全長(zhǎng)編碼序列，分析LoSorHDA1的蛋白序列和結(jié)構(gòu)、與其他植物的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、亞細(xì)胞定位以及在各個(gè)組織和不同花發(fā)育階段的表達(dá)情況，為后續(xù)的去乙酰化修飾以及在花發(fā)育中的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以2018年12月底在北京市懷柔基地種植的東方百合‘索邦’為試驗(yàn)材料，取莖生根、嫩莖、上部葉、下部葉、花被片、花藥、花絲、柱頭、花柱、子房10種組織用于半定量表達(dá)分析；取5、10、15、20、25 mm 5個(gè)不同花發(fā)育階段的雌蕊、雄蕊、內(nèi)花被、外花被用于熒光定量表達(dá)分析(圖1)。以上所有材料用液氮速凍法取材后，立即放于 -80 ℃冰箱，備用。

a. 花部組織的取材部位 Flower tissues sampled；B.不同發(fā)育階段花蕾的大小 Flower bud size at different developmental stages

圖1 不同花發(fā)育階段花蕾與取材部位
Fig.1 Flower tissues and sampled buds at different development stages

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取與cDNA的合成 總RNA提取按照艾德萊EASYspinPlus植物RNA快速提取試劑盒的方法標(biāo)準(zhǔn)操作。利用ThemoNanoDrop 2000分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度，且保證OD260(核甘酸的吸收峰)與OD280(蛋白質(zhì)的吸收峰)的比值為1.8～2.2。采用Quantitect Reverse Transcription Kit 試劑盒(QIAGEN)，對(duì)上述操作得到的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)合成cDNA,分別用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，后將RNA置于 -80 ℃冰箱保存，cDNA置于-20 ℃冰箱保存，備用。

1.2.2 RT-PCR 以‘索邦’不同組織材料的總RNA反轉(zhuǎn)所得的cDNA為模板，根據(jù)預(yù)期序列(CL10571.Contig1)設(shè)計(jì)半定量引物F1和R1(表1)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，內(nèi)參基因選擇TIP41[19]，正反向引物分別為F2和R2(表1)?？偡磻?yīng)體系20 μL，其中，2×TaqMix 10 μL,引物各0.4 μL，cDNA模板根據(jù)內(nèi)參調(diào)整后的量添加(一般為 0.8 μL),ddH2O補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 6 min；4 ℃保存。

表1 試驗(yàn)中所用引物序列Table 1 Primer sequences used in the experiments

1.2.3 基因編碼序列的克隆 根據(jù)半定量的表達(dá)情況，以‘索邦’花絲的cDNA為模板，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)得到的預(yù)期HDA1序列，設(shè)計(jì)克隆引物F3和R3(表1)，PCR擴(kuò)增編碼區(qū)序列?？偡磻?yīng)體系為50 μL，酶為高保真酶KOD(東洋坊生物公司)，其中10×PCR buffer 5 μL，dNTPS 5 μL，MgSO43 μL，引物F3和R3各1 μL，模板cDNA 2 μL，KOD-Plus-Neo 1 μL，ddH2O 32 μL，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性 5 min；98 ℃變性 10 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min，40 個(gè)循環(huán)；最后 68 ℃ 6 min；4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，拍照后切膠回收預(yù)期大小條帶，連接至pTOPO-B平末端克隆載體(艾德萊公司)，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)后送至睿博興科測(cè)序公司測(cè)序，結(jié)果采用EMBL-EBI在線網(wǎng)站Clustal Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)比對(duì)拼接，得到正確編碼序列，保存菌液。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 利用Primer3(http://biotools.umassmed. edu/bioapps/primer3_www.cgi)在線設(shè)計(jì)特異性引物；在NCBI和Phytozome 12.1上下載其他物種的HDA1基因的CDs序列和氨基酸序列；利用MAGE 7.0對(duì)所得其他物種編碼序列與克隆所得‘索邦’編碼序列比對(duì)，翻譯后構(gòu)建N-J系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，EvolView(https://www.evolgenius.info//evolview/)在線網(wǎng)站修飾進(jìn)化樹(shù)；利用ExPASy(https://web.expasy.org/translate/)翻譯得到可能的氨基酸序列，ProtParam tool (https://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白的理化性質(zhì)；利用PredictProtein(https://www.predictprotein.org/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用WoLF PSOR (https://wolfpsort.hgc.jp/)和Plant-mPLoc(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)；利用DNAMAN、NCBI中的保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)和Pfam(http://pfam.xfam.org)進(jìn)行蛋白保守結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的比對(duì)分析，GSDS2.0 (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php) 繪制蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)圖。

1.2.5 亞細(xì)胞定位瞬時(shí)表達(dá)載體構(gòu)建 將保存的克隆菌液大搖后提取pTOPO-B-HDA1重組質(zhì)粒，以此為模板進(jìn)行亞克隆的PCR 擴(kuò)增，根據(jù)酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)亞克隆引物F4,R4(表1)，總反應(yīng)體系為50 μL，酶為高保真酶KOD，其中10×PCR buffer 5 μL，dNTPS 5 μL，MgSO43 μL，引物F4和R4各1 μL，模板1 μL，KOD-Plus-Neo 1 μL，ddH2O 33 μL，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性 5 min；98 ℃變性 10 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min，40 個(gè)循環(huán)；最后68 ℃ 6 min；4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切膠回收預(yù)期大小條帶，infusion連接至pSuper1300-GFP表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化HST08感受態(tài)細(xì)胞，挑選菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)后送至睿博興科測(cè)序公司測(cè)序，結(jié)果采用EMBL-EBI在線網(wǎng)站ClustalOmega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)比對(duì)拼接，得到正確序列，提取重組質(zhì)粒，將表達(dá)載體pSuper1300-HDA1-GFP通過(guò)液氮轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入GV3101農(nóng)桿菌[20]，PCR檢測(cè)后挑選陽(yáng)性菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，重懸后注射侵染煙草葉背面，暗培養(yǎng) 48 h，采用激光共聚焦顯微鏡觀測(cè)定位結(jié)果。

1.2.6 qRT-PCR 以‘索邦’不同花發(fā)育階段(5、10、15、20、25 mm)的花部組織雌蕊、雄蕊、內(nèi)花被、外花被反轉(zhuǎn)得到的cDNA為模板，按照實(shí)時(shí)熒光定量的引物要求設(shè)計(jì)目的基因引物F5和R5(表1)，內(nèi)參基因選擇ACTIN,正反向引物為F6和R6(表1)，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR反應(yīng)，根據(jù)SYBRPremix ExTaqTMⅡ(TaKaRa)說(shuō)明書(shū)，配制PCR反應(yīng)液：體系為20 μL，稀釋10×后的模板8 μL，F(xiàn)5和R5混合稀釋10×后2 μL，酶10 μL。使用CFX Connect Real-Time PCR System(Bio-Rad)程序進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，每份樣品重復(fù)3次。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，59.4 ℃(ACTIN)/ 55 ℃(HDA1)退火5 s，72 ℃延伸15 s，40個(gè)循環(huán)；隨后以每5 s升溫0.5 ℃的速度從65 ℃升至 95 ℃，得到擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線。采用BioRadCFXManager和Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘索邦’組蛋白去乙?；富? HDA1編碼序列的克隆和分析

以‘索邦’花絲的cDNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增，得到清晰的擴(kuò)增片段條帶(圖2)，大小與預(yù)期相符，經(jīng)純化回收、連接轉(zhuǎn)化和測(cè)序，成功得到‘索邦’HDA1基因的編碼區(qū)序列長(zhǎng)度為1 518 bp，以此序列進(jìn)行Blastn檢索，發(fā)現(xiàn)與海棗(Phoenixdactylifera)、油棕(Elaeisguineensis)、小果野焦(Musaacuminata)、天門(mén)冬(Asparagusofficinalis)、鳳梨(Asparagusofficinalis)等單子葉植物的HDA1具有較高的的相似性 (>80%)，與AtHDA1相似性為70.2%，確定該基因?yàn)闁|方百合‘索邦’HDA1基因，并命名為L(zhǎng)oSorHDA1。

在擬南芥中，AtHDAC基因家族成員分為3個(gè)亞家族，其中最大的為RPD3/HDA1-like亞家族，挑選擬南芥所有HDA1-like亞家族成員和部分植物的HDA1基因(包括單子葉和雙子葉)，與LoSorHDA1進(jìn)行同源比對(duì)，構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)(圖3)。結(jié)果表明，所有植物的HDA1基因單獨(dú)聚為一支(Ⅰ)，可信度(100%)很高，擬南芥HDA1-like亞家族其他成員各自聚為一支，說(shuō)明HDA1分支在進(jìn)化過(guò)程中較為保守，其成員的出現(xiàn)可能發(fā)生在這些植物物種形成之前。在植物中，HDA1基因的同源性很高，分為單子葉和雙子葉兩大分支，這與植物的生物學(xué)分類一致，在雙子葉分支2中，茄科與菊科聚為一支，擬南芥與楊柳科、薔薇科、葡萄科以及亞麻科聚為一支；在單子葉植物分支1中，HDA1基因的也具有較高的保守性，其中禾本科與鳳梨科聚為一支，LoSorHDA1與芭蕉科和棕櫚科聚為一支，且與小果野焦(Musaacuminata)的同源性最高，其次是海棗(Phoenixdactylifera)和油棕(Elaeisguineensis)，與其他單子葉植物水稻、玉米等同源關(guān)系較遠(yuǎn)。

M.AL5000 marker ；1,2.擴(kuò)增條帶 Amplified target band

圖2LoSorHDA1基因編碼序列的PCR擴(kuò)增
Fig.2 PCR amplification of the coding sequence ofLoSorHDA1gene

LoSor.東方百合‘索邦’Liliumoriental hybrid‘Sorbonne’；Ac.鳳梨Ananascomosus；Ao.天門(mén)冬Asparagusofficinalis；Pd. 海棗Phoenixdactylifera；Eg.油棕Elaeisguineensis；Ma.小果野焦Musaacuminata；Os.水稻Oryzasativa；Bd.二穗短柄草Brachypodiumdistachyon；Zm.玉米Zeamays；At.擬南芥Arabidopsisthaliana；Sl. 番茄Solanumlycopersicum；Ha.向日葵Helianthusannuus；Pt.毛果楊Populustrichocarpa；Lu.亞麻L(zhǎng)inumusitatissimum；Pp.桃Prunuspersica；Vv. 葡萄Vitisvinifera

圖3 不同植物HDA1基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)
Fig.3 Phylogenetic tree of different plantsHDA1genes

2.2 LoSorHDA1氨基酸結(jié)構(gòu)分析

分析結(jié)果顯示，LoSorHDA1編碼的氨基酸序列長(zhǎng)度為505 aa，分子相對(duì)質(zhì)量為56 708.56，等電點(diǎn)(PI)為5.23，正電荷殘基數(shù)53，負(fù)電荷殘基數(shù)78，不穩(wěn)定系數(shù)為36.35(<40)，表明該蛋白質(zhì)穩(wěn)定，總平均疏水性-0.510，該蛋白為親水蛋白，脂肪系數(shù)73.74。蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示(圖4)，在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中，包含大量的螺旋、折疊和無(wú)規(guī)則卷曲，其中螺旋和折疊結(jié)構(gòu)主要集中在保守結(jié)構(gòu)域中，經(jīng)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，α螺旋(Helix)占23.71%，β股(Strand)占7.33%，無(wú)規(guī)則卷曲(Loop)最多，占65.54%。

圖4 LoSorHDA1蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)
Fig.4 Prediction of secondary structure of LoSorHDA1 protein

對(duì)其保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析(圖5)，發(fā)現(xiàn)在LoSorHDA1的N端包含一個(gè)組蛋白去乙?；附Y(jié)構(gòu)域(Histone deacetylase domain)，該結(jié)構(gòu)域位于37～328 aa，屬于精氨酸類/組蛋白類水解酶超家族(Arginase-like/histone-like hydrolase superfamily)中的組蛋白去乙?；讣易?HDAC)[21-22]，占氨基酸序列的大部分，是主要發(fā)揮去乙?；δ艿膮^(qū)域，這與毛果楊、番茄和菠蘿的研究結(jié)果一致[23-25]。與其他植物比對(duì)發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)域保守性很高，均存在一些關(guān)鍵的活躍位點(diǎn)，包括金屬(鋅、鐵)結(jié)合位點(diǎn)(Zn binding site)，親脂管和足口袋(lipophilic tube and foot pocket)，在蛋白質(zhì)賴氨酸的乙酰化、蛋白活性等功能中可能發(fā)揮著重要的作用(圖6)[26-29]。

圖5 LoSorHDA1蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)圖Fig.5 Predicted map of LoSorHDA1 protein conserved domain

2.3 LoSorHDA1蛋白亞細(xì)胞定位分析

WoLF PSORT亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，該蛋白最有可能定位在細(xì)胞核(5)中，其次是細(xì)胞質(zhì)(4), Plant-mPLoc預(yù)測(cè)顯示LoSorHDA1位于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)，但未找到明確的核定位位點(diǎn)。

為驗(yàn)證LoSorHDA1蛋白的定位情況，構(gòu)建了pSuper1300-HDA1-GFP表達(dá)載體，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草葉片表皮細(xì)胞，觀察GFP瞬時(shí)表達(dá)情況(圖7)，結(jié)果顯示：LoSorHDA1在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá)，可能在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中均發(fā)揮作用，結(jié)果與預(yù)測(cè)結(jié)果較為一致。

2.4 LoSorHDA1在不同組織中的表達(dá)分析

半定量表達(dá)的試驗(yàn)結(jié)果顯示(圖8)，LoSorHDA1在‘索邦’不同組織中均有表達(dá)，并未在某一個(gè)或某幾個(gè)組織中特異性表達(dá)。LoSorHDA1在莖生根、嫩莖、下部葉、花被片、花絲、柱頭、花柱和子房中表達(dá)量較高，在上部葉和花藥中表達(dá)稍低，說(shuō)明其可能廣泛地參與東方百合各階段的生長(zhǎng)發(fā)育，這與番茄SlHDA1的組織表達(dá)模式相似[24]。

Lo.東方百合Liliumoriental hybrid‘Sorbonne’；Ma.小果野焦Musaacuminata；Pd.海棗Phoenixdactylifera；Eg.油棕Elaeisguineensis；Ac.天門(mén)冬Asparagusofficinalis；Os.水稻Oryzasativa；Zm.玉米Zeamays；At.擬南芥Arabidopsisthaliana；Sl.番茄Solanumlycopersicum； Pt.毛果楊Populustrichocarpa；Pp.桃Prunuspersica；方框?yàn)橹饕幕钴S位點(diǎn)，其中綠色為金屬(鋅)結(jié)合位點(diǎn) The box is marked as the main active site, where green is the metal (zinc) binding site

圖6 不同植物HDA1氨基酸序列比對(duì)結(jié)果
Fig.6 Comparison of HDA1 amino acid sequence alignment of different plants

圖7 HDA1蛋白的亞細(xì)胞定位Fig.7 Subcellular localization of HDA1 protein

圖8 LoSorHDA1在不同組織中的表達(dá)Fig.8 The expression of LoSorHDA1 in different tissues

2.5 LoSorHDA1在不同花發(fā)育階段中的表達(dá)分析

半定量結(jié)果顯示LoSorHDA1在除花藥外的花被片、花絲、花柱、柱頭等花部組織中表達(dá)量均較高，為了進(jìn)一步探究LoSorHDA1在花發(fā)育階段的表達(dá)情況，利用5、10、15、20和25 mm花蕾中的雌雄蕊以及內(nèi)外花被片的cDNA進(jìn)行熒光定量表達(dá)分析，結(jié)果顯示LoSorHDA1在各個(gè)階段的花部組織中都有不同程度的表達(dá)(圖9)，在雌蕊中，早期5 mm中表達(dá)量最高，明顯高于10、15、20和25 mm，在25 mm時(shí)明顯下降，中間過(guò)程表達(dá)量無(wú)明顯的變化，說(shuō)明LoSorHDA1可能參與了雌蕊早期的發(fā)育；在雄蕊中，呈現(xiàn)與雌蕊相反的趨勢(shì)，花發(fā)育早期表達(dá)量較低，在15 mm中表達(dá)量最低，后逐漸上升，25 mm中表達(dá)量最高，說(shuō)明LoSorHDA1可能參與雄蕊后期的發(fā)育；在花被片中的表達(dá)趨勢(shì)較為一致，先上升后降低，呈現(xiàn)一定的波動(dòng)性：在內(nèi)花被中，各個(gè)發(fā)育階段的表達(dá)量差異不十分明顯，在花蕾15 mm時(shí)表達(dá)量最高；在外花被中，5～10 mm的表達(dá)量下降，后又升高，在花蕾20 mm時(shí)達(dá)到最高，到 25 mm又下降，呈現(xiàn)一個(gè)動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)。

3 討 論

LoSorHDA1的編碼區(qū)序列1 518 bp，與擬南芥等植物的HDA1的序列長(zhǎng)度相當(dāng)。已有的HDA1氨基酸序列比對(duì)結(jié)果(NCBI-Blast)顯示，LoSorHDA1與其他植物同源蛋白序列具有很高的保守性，其中與小果野焦同源性最高，從進(jìn)化關(guān)系來(lái)看，百合與小果野焦同為單子葉植物，親緣關(guān)系相對(duì)較近,基因的功能更為接近，從比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LoSorHDA1自身在保守結(jié)構(gòu)域內(nèi)外也有不同于其他植物的特異性位點(diǎn)，這可能導(dǎo)致百合HDA1功能的變化。在發(fā)揮去乙?；δ艿谋Ｊ亟Y(jié)構(gòu)域中，存在幾個(gè)與人類HDACs相同的活躍結(jié)合位點(diǎn)，這些位點(diǎn)對(duì)其正常功能發(fā)揮有重要作用。

*表示在0.05水平下的差異顯著性 * indicates the significant difference at the 0.05 level

進(jìn)化關(guān)系顯示，LoSorHDA1與單子葉植物HDA1的同源性更高；擬南芥HDA1-like亞家族成員系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，各成員在進(jìn)化過(guò)程中十分保守，在這些高等被子植物物種形成之前，可能已經(jīng)進(jìn)化完成，并具有一定同源性。比對(duì)3個(gè)亞家族的蛋白結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)：HDA1-like亞家族與HD和SIR亞家族在蛋白結(jié)構(gòu)域上差異較大，HD2、SIR2亞家族不含有組蛋白去乙酰化酶結(jié)構(gòu)域，存在甘氨酸、天冬氨酸和谷氨酸豐富區(qū)；EFWG保守區(qū)以及Sir2 domain，在功能機(jī)制上可能存在差異[9]。從蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位上來(lái)看：AtHDA1定位于細(xì)胞核，非核仁，但PtHDA1(毛果楊)定位于細(xì)胞質(zhì)，可能在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用[23]，研究表明HDA1-like亞家族主要定位于細(xì)胞核中，部分成員位于細(xì)胞質(zhì)，也有一些成員穿梭于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)之間，這與它的功能存在一定聯(lián)系[5]；亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示LoSorHDA1定位于細(xì)胞核中的可能性最大，其次位于細(xì)胞質(zhì)中，試驗(yàn)結(jié)果顯示LoSorHDA1定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，可能在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核中均發(fā)揮功能，說(shuō)明HDA1在不同植物中的定位存在一定差異。

LoSorHDA1在百合組織中廣泛表達(dá)，這說(shuō)明它與擬南芥、番茄等其他已研究的植物一樣，廣泛地參與百合生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)階段。LoSorHDA1、AtHDA1、FvHDA3(AtHDA1的同源基因)在花部組織、花發(fā)育過(guò)程中表達(dá)量尤為高，證明其與花發(fā)育過(guò)程密切相關(guān)[9,30]。開(kāi)花植物花器官發(fā)育的調(diào)控主要依靠ABCDE模型相關(guān)基因AP1、AP2、AP3、AG等，大部分屬于MADs-box轉(zhuǎn)錄因子家族，它們的異常表達(dá)直接影響花器官的正常發(fā)育，HDA1與花發(fā)育相關(guān)基因(AP2)直接互作影響開(kāi)花[11]，轉(zhuǎn)錄抑制因子LEUNIG，其靶基因涵蓋植物的各個(gè)發(fā)育階段，LEUNIG通過(guò)與HDACs家族成員HDA1等互作，實(shí)現(xiàn)對(duì)花發(fā)育相關(guān)基因的抑制[14]，HDA1還參與了A類基因AP1與C類基因AG間的相互抑制作用，保證花被片與生殖器官的正常。擬南芥hda19系列突變體具有花發(fā)育異常表型：花瓣融合，數(shù)量減少、雄蕊變短、雌雄蕊育性降低等[31-32]，在百合中，LoSorHDA1在雌雄蕊和花被片中都表達(dá)，值得注意的是LoSorHDA1在雌蕊的早期發(fā)育中(5 mm)表達(dá)量明顯高于其他階段，在雄蕊后期高于其他階段，其很可能參與了雌蕊的分化形成和早期發(fā)育、雄蕊后期的發(fā)育，進(jìn)一步推測(cè)LoSorHDA1在雌雄蕊的正常發(fā)育、維持花被片數(shù)量中發(fā)揮一定功能。不僅如此，AtHDA1功能的缺失，導(dǎo)致其他發(fā)育階段的異常，這些結(jié)果表明AtHDA1是一種在植物中通過(guò)DNA序列獨(dú)立或表觀遺傳機(jī)制控制發(fā)育過(guò)程中基因表達(dá)的全方位調(diào)節(jié)劑[32]，因此在百合中，HDA1基因如何影響花發(fā)育，突變是否會(huì)導(dǎo)致花瓣減少、雄蕊花絲變短等發(fā)育異常，需對(duì)其功能做進(jìn)一步研究，通過(guò)過(guò)表達(dá)或恢復(fù)突變體表型來(lái)確認(rèn)是否與AtHDA1具有相似的功能。然而番茄中研究表明SlHDA1在花中表達(dá)較低，在果實(shí)中高表達(dá)，與果實(shí)成熟密切相關(guān)[24]；在香蕉中，MaHDA1與乙烯信號(hào)通路轉(zhuǎn)錄因子MaERF11直接互作影響香蕉果實(shí)的成熟[33]；在擬南芥中，AtHDA1與HSL1/VAL2互作參與種子發(fā)育[12]，而非ERF，因此百合中HDA1是否與這些蛋白互作或存在新的蛋白，值得進(jìn)一步研究，也說(shuō)明HDA1在不同植物中可能與不同蛋白互作，在果實(shí)和種子成熟中發(fā)揮重要作用。

筆者從序列比對(duì)、系統(tǒng)進(jìn)化、亞細(xì)胞定位、組織表達(dá)模式和不同花發(fā)育階段花部組織表達(dá)格局初步推測(cè)，LoSorHDA1可能與擬南芥AtHDA1類似，在百合的成花與花發(fā)育中具有重要作用。但是其是否可以與VAL2、AP2、FLD、FVE等蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，共同作用于其他基因；是否與HDA6具有功能冗余，通過(guò)去乙酰化修飾參與調(diào)控百合種球發(fā)育、成花轉(zhuǎn)變和花的發(fā)育，還須進(jìn)一步的研究。此外對(duì)于LoSorHDA1在種子成熟、脅迫響應(yīng)以及防御反應(yīng)中是否與AtHDA1發(fā)揮相似的作用，還有待探究。