利用EST-SSR檢測(cè)闊短和狹長(zhǎng)被片型美洲蓮的遺傳變異

劉鳳欒，秦 密，劉青青，張大生，田代科

(上海辰山植物園，中國(guó)科學(xué)院上海辰山植物科學(xué)研究中心，上海市資源植物功能基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201602)

花被片形狀(被形)作為花型的主要組成部分之一，對(duì)觀花植物的觀賞性有重要影響。雖然荷花(NelumboAdans.)正式文獻(xiàn)記載的名稱全球已達(dá)2 080個(gè)[1]，但因受限于原種型色單調(diào)[2]、品種譜系不清、育種工作缺乏系統(tǒng)性與針對(duì)性、分子育種尚無(wú)突破等原因，現(xiàn)有荷花的被形變化小、多樣性低，多為卵形、匙形或?qū)捙樞蔚戎虚g形狀[3]，而極少見(jiàn)圓闊月季瓣類和狹長(zhǎng)菊瓣類。因此，與菊花和月季相比，在某種程度上荷花的花朵觀賞性偏低，不能滿足現(xiàn)代社會(huì)對(duì)新穎性、奇特性事物的追求[4]，從而制約了觀賞荷花產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。因此，以特殊花被片形狀(被形)為切入點(diǎn)，創(chuàng)制闊短或狹長(zhǎng)被形新種質(zhì)，是提高荷花觀賞性及其應(yīng)用價(jià)值的良好途徑之一。

進(jìn)入21世紀(jì)，荷花育種工作受到越來(lái)越多的國(guó)家和育種者重視。以人工有性雜交和自然雜交篩選為主[5-8]、人工射線輻射處理和太空輻射育種為輔[9-10]，獲得一批優(yōu)良的荷花品種。觀賞植物資源與創(chuàng)新利用課題組也正致力于奇異獨(dú)特觀賞荷花品種尤其是極端被形荷花良種的選育工作，研究期間，在位于上海辰山植物園的荷花資源圃偶然發(fā)現(xiàn)闊短和狹長(zhǎng)花被片美洲蓮(N.luteaWilld.)實(shí)生苗各1株，為選育菊瓣和月季瓣類型荷花品種提供了極佳的親本材料。兩者哪些形態(tài)學(xué)特征存在顯著不同，在DNA和RNA水平上是否存在差異，能否篩選到與被形發(fā)育相關(guān)的分子標(biāo)記或定位到其調(diào)控基因？通過(guò)研究這些問(wèn)題，將對(duì)利用分子標(biāo)記輔助選育獨(dú)特被形荷花新品種，以及探討荷花被形發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)理具有重要意義。

SSR(簡(jiǎn)單序列重復(fù))標(biāo)記又稱微衛(wèi)星DNA(Microsatellite DNA)，是指真核生物基因組中散在分布的由1～6個(gè)堿基對(duì)組成的簡(jiǎn)單重復(fù)序列，其多態(tài)性源于堿基基序重復(fù)次數(shù)的不同。根據(jù)開(kāi)發(fā)來(lái)源可分為基因組SSR(gSSR)和轉(zhuǎn)錄組SSR(EST-SSR)。EST-SSR作為一種與基因表達(dá)相關(guān)的SSR標(biāo)記，除具備傳統(tǒng)gSSR的共顯性、多態(tài)性高、重復(fù)性好等特點(diǎn)外，還有通用性高、性狀連鎖和開(kāi)發(fā)經(jīng)濟(jì)等優(yōu)勢(shì)。觀賞植物資源與創(chuàng)新利用課題組依據(jù)不同時(shí)期花蕾轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果自主開(kāi)發(fā)和篩選了217對(duì)EST-SSR引物[11]，并得到很好的應(yīng)用與檢驗(yàn)[12]，為本研究提供了可靠的參考。

本研究以闊短被形和狹長(zhǎng)被形的兩個(gè)美洲蓮特殊株系為材料，在比較兩者形態(tài)特征差異的基礎(chǔ)上，對(duì)課題組開(kāi)發(fā)的217個(gè)EST-SSR標(biāo)記進(jìn)行多態(tài)性篩選，通過(guò)比較多態(tài)性位點(diǎn)的生物學(xué)信息，初步確定，闊短被形和狹長(zhǎng)被形兩個(gè)株系在DNA水平是否存在差異，以評(píng)估分子標(biāo)記構(gòu)建連鎖圖譜的可行性，以及后續(xù)全基因組重測(cè)序和轉(zhuǎn)綠組水平比較的必要性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2015年課題組于上海辰山植物園“國(guó)際荷花資源圃”發(fā)現(xiàn)兩株花被片形狀(被形)差異顯著的美洲蓮(N.luteaWilld.)，為美國(guó)野生居群采集的蓮子播種培育而來(lái)。與常見(jiàn)的美洲蓮相比，一株被形較為闊短，栽培編號(hào)M512；另一株則明顯狹長(zhǎng)，栽培編號(hào)為DP23，兩者自交系的被形均可穩(wěn)定遺傳。利用種藕分株，分別將此兩種類型定植于3個(gè)塑料池中(長(zhǎng)×寬×深=100 cm× 80 cm×45 cm)栽培以供觀察研究。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 闊短被形和狹長(zhǎng)被形株系主要形態(tài)學(xué)性狀的比較測(cè)定 形態(tài)指標(biāo)以花朵和葉片的關(guān)鍵表型為主(表1)?；ǘ湫誀钣诨ㄩ_(kāi)第2天測(cè)量，其中花被片長(zhǎng)度以其基部至尖部為準(zhǔn)，寬度以花被片最寬處為準(zhǔn)，因其最外側(cè)5～6枚開(kāi)花時(shí)易失水變形，為減小測(cè)量誤差，自第6～7枚花被片開(kāi)始測(cè)量?；ū黄瑪?shù)和雄蕊數(shù)：為防止外層花被(萼片狀)過(guò)早脫落，將出水后的花蕾套入網(wǎng)兜內(nèi)，開(kāi)花前1～2 d采收統(tǒng)計(jì)；花柄/葉柄高度：自池底到花托基部/葉鼻處的長(zhǎng)度；花柄/葉柄粗度：花柄/葉柄在水面附近的粗度；葉脈數(shù)：每片葉的主葉脈數(shù)量；自交結(jié)實(shí)率：人工自花授粉結(jié)實(shí)后成熟花托內(nèi)飽滿果實(shí)數(shù)與其雌蕊數(shù)之比；果實(shí)單粒質(zhì)量：隨機(jī)取10粒果實(shí)稱取得到的粒均質(zhì)量。

1.2.2 多態(tài)性EST-SSR引物的篩選 于“國(guó)際荷花資源圃”采集M512和DP23心形拳卷狀態(tài)的幼嫩荷葉，每種類型3池各采1片等體積混合后液氮研磨。利用改良的CTAB法[13]提取基因組DNA，稀釋至50 ng/ μL。為檢測(cè)兩個(gè)自交系是否在功能基因上存在核苷酸序列差異，選擇217對(duì)基于荷花轉(zhuǎn)錄組開(kāi)發(fā)的EST-SSR引物[11]展開(kāi)多態(tài)性分析。PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積為10 μL：5 μL 2×ESTaqmix (北京康為)，DNA模板1.0 μL，引物0.5 μL (10 μmol/L)，3.5 μL ddH2O。反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；最終72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物加入6 μL變性劑，94 ℃變性5 min，置于冰上冷卻后，于6%聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染-NaOH顯色。根據(jù)電泳圖，確定呈現(xiàn)多態(tài)性的EST-SSR引物。

1.2.3 特異條帶的生物信息學(xué)分析 將具有多態(tài)性的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序，以最大程度保證其核苷酸序列信息的真實(shí)性。將所得的差異序列片段，在NCBI網(wǎng)站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中Blast比對(duì)查找序列相同或高相似度的基因或片段Gene-x，再根據(jù)已有研究報(bào)道，明確Gene-x的基因功能。若無(wú)法在NCBI中直接比對(duì)得到高相似度Gene-X，則于荷花基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/genomes/14095)中搜索高相似度的基因或片段Gene-y，然后再于NCBI網(wǎng)站中利用Gene-y進(jìn)行Blast，查詢Gene-x及其功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 M512和DP23主要形態(tài)指標(biāo)差異

在測(cè)定的20個(gè)形態(tài)指標(biāo)中，花被片寬長(zhǎng)比、花被片寬長(zhǎng)均值及果實(shí)單粒質(zhì)量等12個(gè)指標(biāo)在兩個(gè)自交系之間存在顯著差異，其中花朵為差異最直觀、顯著的器官(圖1，表1)。M512花被片表現(xiàn)為較寬較短，其寬長(zhǎng)比均值為0.68，花被片寬度×長(zhǎng)度變幅為4.3～7.7 × 6.7～10.2 cm；DP23花被片偏窄偏長(zhǎng)，其寬長(zhǎng)比均值為 0.35，花被片寬度×長(zhǎng)度變幅為3.1～5.2×10.0～14.8cm(表1)。除花朵外，每池立葉密度、立葉葉脈數(shù)和柄孔數(shù)等3個(gè)葉片指標(biāo)也存在顯著差異(表1)。由此可見(jiàn)，兩個(gè)自交系的主要形態(tài)特征在個(gè)體水平上存在明顯區(qū)別。

圖1 闊短被形M512和狹長(zhǎng)被形DP23的花蕾及花朵Fig.1 Buds and flowers of M512 and DP23

2.2 多態(tài)性EST-SSR引物的特征及其擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性

與形態(tài)差異相應(yīng)，217對(duì)備選的EST-SSR引物中，26對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物在M512和DP23之間也表現(xiàn)出條帶多態(tài)性(圖2，表2)，多態(tài)性比率為12.0%。其中，24對(duì)引物擴(kuò)增得到2個(gè)等位基因，剩余2對(duì)引物擴(kuò)增得到3個(gè)等位基因。將這些多態(tài)性引物的PCR產(chǎn)物測(cè)序，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)自交系在各個(gè)位點(diǎn)存在不同重復(fù)基序的差異，并與PAGE凝膠電泳圖展現(xiàn)很高的匹配度(圖2)。

表1 闊短被形M512和狹長(zhǎng)被形DP23主要表型差異Table 1 Major phenotypic differences between M512 and DP23

注：*.每組數(shù)據(jù)由均值及其變化幅度(括號(hào)內(nèi)數(shù)字)組成；字母a，b表示M512和DP23在該指標(biāo)均值存在顯著差異(P<0.05)。

Note:*.Each data consist of mean value and range (data in the bracket)，a，b indicate significant difference in mean value (P<0.05).

電泳圖中每對(duì)引物包含2個(gè)重復(fù)PCR的產(chǎn)物，序列比對(duì)結(jié)果中第3列為目標(biāo)序列在NCBI網(wǎng)站中Blast所得的高相似度序列 Each pair of primers inelectrophoretogram contains two duplicated PCR fragments.The third column in the alignment map is the best identified DNA sequence obtained by NCBI blast

圖2 部分多態(tài)性引物的PCR產(chǎn)物電泳圖和測(cè)序比對(duì)結(jié)果
Fig.2 PCR products of some polymorphic primers and blast results

2.3 差異條帶序列信息的比對(duì)與分析

測(cè)序數(shù)據(jù)顯示，26個(gè)多態(tài)性EST-SSR位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的條帶大小為150～405 bp，共含有8種重復(fù)基序，包含二核苷酸5種，三核苷酸3種，其中TC種類比率最大，占31%(表2)。將26對(duì)多態(tài)性引物擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后，在NCBI網(wǎng)站中Blast，其中21對(duì)得到相似度高(Ident=75%～99%)、功能已有驗(yàn)證的基因或蛋白，剩余5對(duì)引物D67、J41、J43、V34和V35則未能搜索得到具有高相似度的功能基因。

M512和DP23的表型差異主要集中在花被片形狀、花托形狀和花柄粗度等特征，在DNA水平，兩者展現(xiàn)更豐富的區(qū)別。在兩者已明確功能的21個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)中，包含轉(zhuǎn)錄因子、酶類、蛋白復(fù)合體組分甚至RNA等類型，主要涉及植物器官發(fā)生發(fā)育(D70、E82、F03、K52、L01、L04)、植物激素合成和各種信號(hào)傳導(dǎo)(B23、E82、T23、V28)、基礎(chǔ)代謝和逆境調(diào)節(jié)(B29、D65、F03、L09)等諸多方面，暗示M512和DP23兩個(gè)自交系在基因組上甚至轉(zhuǎn)錄組上存在差異。

3 討 論

花朵作為觀賞荷花主要的觀賞點(diǎn)，其形態(tài)、色澤和氣味等決定了觀賞價(jià)值。自20世紀(jì)60年起，經(jīng)過(guò)中國(guó)、日本、美國(guó)及泰越等國(guó)家育種者的努力，已培育出大量?jī)?yōu)良的觀賞荷花品種，包含單瓣、半重瓣、重瓣(重臺(tái))和千瓣等花型，以及粉色、紅色、復(fù)色及黃色等[1,54]，即通過(guò)改良荷花花朵的形與色提升現(xiàn)代觀賞荷花品種的觀賞性。然而，隨著現(xiàn)代社會(huì)越來(lái)越追求個(gè)性化、多元化，人工定向選育具有獨(dú)特性、新穎性的觀賞荷花品種已成為市場(chǎng)重要需求之一[4]。本研究中的美洲蓮M512和DP23為定向培育類似極端瓣形月季和菊花的觀賞荷花品種提供了合適的親本材料：其一，兩者被形分別呈現(xiàn)不同于多數(shù)美洲蓮的闊短和狹長(zhǎng)；其二，兩者花色為其獨(dú)有的黃色(圖1)，即M512和DP23同時(shí)具備形、色兩個(gè)重要觀賞性狀。同時(shí)，在20個(gè)重要形態(tài)指標(biāo)中，兩者差異主要表現(xiàn)在花朵器官上(表1)，被形(寬長(zhǎng)比)即為其中之一。那么，在細(xì)胞水平以及分子水平，闊短被形M512和狹長(zhǎng)被形DP23是否存在不同，其中調(diào)控被形發(fā)生發(fā)育的過(guò)程是什么？解釋這些問(wèn)題有助理解荷花花朵發(fā)育尤其是被形的形態(tài)建成的過(guò)程，以便后續(xù)開(kāi)發(fā)和利用植物被形調(diào)控技術(shù)與方法。

針對(duì)植物特定性狀分子水平的研究，可采用全基因組重測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組分析以及構(gòu)建遺傳圖譜進(jìn)行QTL定位等技術(shù)與方法。M512和DP23為野生型美洲蓮的兩棵實(shí)生苗，而美洲蓮一直以野生態(tài)存在，遺傳變異小[2,55]，因此，在展開(kāi)DNA和mRNA水平研究前，利用分子標(biāo)記粗略評(píng)估兩者之間的遺傳差異是必要的。對(duì)M512和DP23進(jìn)行EST-SSR標(biāo)記篩選，217對(duì)引物中26對(duì)呈現(xiàn)條帶大小多態(tài)性，涉及多個(gè)代謝途徑(表2)。事實(shí)上，這26個(gè)由電泳條帶可視差異篩選而來(lái)的差異位點(diǎn)屬于一種InDel變異，而SNP變異因?yàn)闊o(wú)法通過(guò)電泳條帶反映，所以，M512和DP23基因組之間的真實(shí)差異位點(diǎn)應(yīng)多于26個(gè)。同時(shí)，由于EST-SSR自身設(shè)計(jì)的特點(diǎn)，上述多態(tài)位點(diǎn)的差異也暗示了一定程度上的轉(zhuǎn)錄組水平的不同。因此，基于上述數(shù)據(jù)，本研究認(rèn)為，下一步應(yīng)在M512和DP23之間進(jìn)行被形QTL定位、全基因組重測(cè)序和轉(zhuǎn)錄組分析等深度探究。