陸地棉小GTP結(jié)合蛋白基因GhRop4的克隆及其表達分析

李月，吾尕力汗·阿不都維力，周垚均，劉超，任艷萍，郭旺珍，劉曉東*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)/ 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，烏魯木齊830052；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)/ 作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室，南京210095）

作為1 類分子量為20～30 kD 的結(jié)合蛋白，小 GTP（Guanosine triphosphate，三磷酸鳥苷）結(jié)合蛋白是許多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的中心調(diào)節(jié)器，廣泛存在于真核生物中[1-2]。 根據(jù)小GTP 結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)和功能分為 Ras、Ran、Rab、Rho 和 Arf 5 個超家族[1-3]。 在真核生物中，Ras 和 Rho 家族蛋白是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)開關(guān)，而其它3 個家族蛋白的功能主要參與囊泡和大分子運動的調(diào)節(jié)[1-2]。 然而，高等植物有1 個獨特的Rho 亞家族的小GTP 結(jié)合蛋白稱為 Rop 蛋白[4-5]。 Rop 蛋白具有 GTP 酶活性，與 GTP 結(jié)合可以催化 GTP 水解， 而與 GDP（Guanosine diphosphate，二磷酸鳥苷）結(jié)合無催化活性，通過與GTP/GDP 循環(huán)結(jié)合，在植物信號傳導(dǎo)中作為分子開關(guān)調(diào)控相關(guān)代謝活動[6]。 它由N末端催化結(jié)構(gòu)域G 結(jié)構(gòu)域 （Catalytic G-domain）和 C 末端高變區(qū) （Hyper-variable domain,HVR）組成， 其中G 結(jié)構(gòu)域負責(zé)與核苷酸及效應(yīng)子結(jié)合，HVR 負責(zé)亞細胞靶向。 G 結(jié)構(gòu)域含有5 個保守序列基序稱為 G-box 基序（Ⅰ-Ⅴ），這5 個基序是核苷酸結(jié)合、GTP 水解和Mg2＋結(jié)合的功能區(qū)域。 Ⅰ、Ⅲ是GTP 酶結(jié)構(gòu)域，Ⅱ和Ⅲ基序也被稱為開關(guān)Ⅰ（SwitchⅠ）和開關(guān)Ⅱ（SwitchⅡ），Ⅲ～Ⅴ是GTP 或GDP 的結(jié)合區(qū)域這些區(qū)域在與GDP 和GTP 結(jié)合狀態(tài)下具有不同的構(gòu)象， 對與效應(yīng)蛋白和調(diào)節(jié)蛋白的短暫相互作用至關(guān)重要。G 結(jié)構(gòu)域內(nèi)還包含1 個Rho 族獨有的螺旋域，稱為插入域[5]。 Winge 等[7]根據(jù) Rop 蛋白 C 端氨基酸序列差異， 將Rop 家族蛋白分為2 種類型，即Ⅰ型和Ⅱ型。 Ⅰ型 Rop 蛋白 C 端以典型的CaaL 盒基序終止，其中 C 為半胱氨酸（Cys），a 為脂肪族氨基酸殘基，L 為亮氨酸 （Leu），Cys 殘基被C20 異戊二烯基脂香葉基香葉基修飾。 Ⅱ型Rop 以 GC-CG 盒終止 （其中 G 為甘氨酸 Gly，C是 Cys），其中 2 個 Cys 殘基是由 5 或 6 個脂肪族殘基隔開并經(jīng)C16 棕櫚酸酯或C18 硬脂酸酯脂肪酸 S ?；痆5]。

自從第1 個Rop基因在豌豆中被鑒定出來，目前已經(jīng)在多種植物中鑒定出Rop基因，其中擬南芥中有 11 個、玉米 9 個、油菜 11 個、葡萄 7個、水稻7 個、苜蓿7 個、煙草6 個、巴西橡膠樹5個、番茄 9 個[8-9]。 根據(jù)對Rop基因的功能研究，Rop 家族蛋白具有多種功能，包括調(diào)控花粉管尖生長、植物細胞生長、信號傳導(dǎo)、核遷移和細胞骨架形成等[10-12]。 除此之外，還廣泛參與環(huán)境應(yīng)激反應(yīng)和宿主- 病原體相互作用等過程[13]。 在寒冷條件下，蘋果的Rop基因轉(zhuǎn)錄表達增加，導(dǎo)致果實中乙烯和活性氧含量降低[14]。 擬南芥AtRop11 的表達影響種子萌發(fā)、幼苗生長、氣孔關(guān)閉、脫落酸介導(dǎo)響應(yīng)和干旱脅迫響應(yīng)[15]。 在煙草中過量表達NtRop1 基因，轉(zhuǎn)基因植株產(chǎn)生較多的H2O2，對鹽脅迫的耐受能力降低[16]。將苜蓿Rop基因MfARL1轉(zhuǎn)入擬南芥， 轉(zhuǎn)基因植株的Na＋/K＋比低于對照株，并增強了鹽脅迫的耐受性[17]。 擬南芥Rop 效應(yīng)蛋白（RIC1）敲除植株在鹽脅迫下的存活率增加[18]。 在水稻中發(fā)現(xiàn)7 個功能各異的Rop基因，OsRac1 通過調(diào)控活性氧爆發(fā)和細胞死亡， 正調(diào)控水稻對稻瘟病的抗性；OsRac4 和OsRac5 負調(diào)控水稻稻瘟病抗性，其它基因可能與水稻稻瘟病無關(guān)[19]。 煙草NtRac5 通過調(diào)控?zé)煵菁毎趸竻⑴c煙草抗病反應(yīng)中的活性氧爆發(fā)[20]。MtRop9參與植物受病原菌侵染的早期抗性反應(yīng)[21]。HvRacB參與大麥對白粉病菌的基礎(chǔ)防衛(wèi)反應(yīng)[22]。棉花中Rop家族基因的研究報道主要和棉花纖維發(fā)育和陸地棉黃萎病菌侵染反應(yīng)有關(guān)。 李先碧等[23]從陸地棉克隆了2 個棉花纖維起始和伸長時期優(yōu)勢表達的GhRacA和GhRacB，推測可能調(diào)控棉花纖維早期發(fā)育。 Deborah 等[24]克隆的GhRac9、GhRac13 基因，在棉纖維發(fā)育過程中初生和次生壁合成的過渡時期的優(yōu)勢表達，推測它們可能是通過產(chǎn)生H2O2介導(dǎo)棉花次生壁的合成。 GhRac1調(diào)控細胞骨架的構(gòu)建是纖維伸長的潛在調(diào)節(jié)因子[25]。 王鈺靜[26]利用病毒誘導(dǎo)基因沉默（Virusinduced gene silencing, VIGS） 技 術(shù) 抑 制 棉 花GhRop6 基因的表達， 沉默植株的木質(zhì)素含量較對照組低，并產(chǎn)生較多的H2O2，推測GhRop6 基因正調(diào)控棉花對黃萎病的抗性。 而關(guān)于棉花中Rop基因在高鹽、干旱、低溫等逆境條件下的表達譜鮮有報道。

棉花是重要的纖維和油料作物，具有重要的經(jīng)濟作用，因此被廣泛種植。 但是棉花在生長過程中往往受到各種生物脅迫和環(huán)境因素如害蟲、病原體、鹽、冷和干旱等的影響。 這些不利因素對棉花的生長、產(chǎn)量以及纖維品質(zhì)影響很大，造成巨大的經(jīng)濟損失。植物特有的Rop 家族蛋白作為上游信號傳遞的分子開關(guān)，參與植物抗逆反應(yīng)和對病原菌的基礎(chǔ)防衛(wèi)調(diào)控。 本文利用生物信息學(xué)的方法，從陸地棉中克隆1 個Rop基因GhRop4，對其蛋白序列特征、逆境和組織表達特性進行研究，為進一步揭示棉花GhRop4 基因的生物學(xué)功能提供重要信息。

1 材料與方法

1.1 材料

陸地棉抗旱材料KK1543 和黃萎病菌菌株V991 均由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1播種、生長條件和脅迫處理。將KK1543種子均勻播種于黑土和蛭石2∶1 混合的營養(yǎng)土中，在溫度（28±2）℃、濕度 65%、光照 / 黑暗周期為16 h/8 h 條件下連續(xù)培養(yǎng)15 d。 選取生長一致的棉花，置于吸水紙上吸干水，分別進行高鹽（200 mol·L－1NaCl）、干旱、4 ℃低溫處理，具體處理參照李月等[27]已報道的方法進行。 分別于處理后 0 h、1 h、3 h、6 h 和 12 h 采集葉片，同時采集未處理材料的根、真葉、子葉、下胚軸和莖用于組織特異性表達檢測。 將以上各時間點采集的不同組織的材料迅速置于液氮速凍，用于總RNA 提取，進行目的基因表達分析。

將 KK1543 種子在 30% H2O2溶液中浸泡2 h，無菌水沖洗3 次，最后在無菌水中避光浸泡12 h， 將露白的棉種平鋪在發(fā)芽紙上發(fā)芽2 d，選取萌發(fā)一致的種子播種于黑土和蛭石2∶1 混合的營養(yǎng)土中，生長條件同1.2.1。 待2 片真葉展平時，采取傷根蘸菌法[26]，進行黃萎病菌V991 侵染。 在接菌 0 h、4 h、8 h、12 h、24 h 和 48 h 后取棉苗的幼根，迅速置于液氮冷凍，用于總RNA 提取及基因的表達分析。

1.2.2總RNA 的提取和cDNA 的制備。采用杭州博日科技公司的BSC65S1 Biospin 多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒提取棉花RNA， 賽默飛（Thermo fisher Scientific）DNase I 去除 RNA 中殘存 的 DNA， 利 用 Thermo Scientific（NanoDrop 1000） 核酸分析儀和1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 質(zhì)量和完整性，質(zhì)量檢測合格的RNA 按照北京全式金生物技術(shù)有限公司 TransScript○RII First-Strand cDNA Synthesis SuperMix 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，用于基因表達分析。

1.2.3棉花GhRop4 基因的克隆。以擬南芥TAIR （http://www.arabidopsis.org/index.jsp）的AtRac1 基因（AT2G17800）的序列作為 BlastP 查詢序列， 在棉花EST 數(shù)據(jù)庫（http://www.leonxie.com），棉花基因組數(shù)據(jù)庫（http://www.phytozome.net/）中比對，獲得了 1 個 cDNA 序列，然后根據(jù)此序列的ORF（Open reading frame）序列設(shè)計引物GhRop4F：5’-ATGAGCGCCTCGAGATTCATA-3’和 GhRop4R：5’-TCATAATATTGAGCAACCACC-3’。 以陸地棉 KK1543 的 cDNA 為模板，以高保真聚合酶TransStar KD Plus（北京全式金）進行PCR 擴增。將擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測，回收目的片段連接至peasy-Blunt Zero 克隆載體，進行質(zhì)粒酶切鑒定，將陽性克隆質(zhì)粒送昆泰銳生物技術(shù)有限公司測序驗證。 參照李月等[27]方法進行試驗所用的PCR 程序、擴增產(chǎn)物檢測及目的片段的純化回收。

1.2.4序列分析和聚類分析。利用NCBI 在線服務(wù)工具中BlastP 和DNAMAN 軟件對GhRop4 蛋白序列進行氨基酸同源序列分析和多重序列比對。同時在NCBI 上查找水稻Oryza sativaOsRac1（XP_015621645.1）、OsRac3 （XP_015625155.1）、OsRac4 （ XP_015641323 .1 ） 和 OsRac5 （ XP_015627011.1）； 擬 南 芥Arabidopsis thalianaAt-Rop1 （NP_190698．1）、AtRop2（NP_173437.1）、AtRop4 （NP_177712.1）、AtRop5（NP_195320.1）、AtRop6（NP_ 001190917.1）和 AtRop11（NP_201093.1）； 小 麥Triticum aestivumTaRop3（ADD23345）； 煙 草Nicotiana tabacumNtRac1（XP_016513031.1）、NtRac5 （XP_016512162.1）；玉米Zea maysZmRop1（XP_008644256.1）；大麥Hordeum vulgareHvRac1（CAD57743.1）、HvRac3（CAD57742.1）、HvRacB（CAC83043.2）和 HvRop4（CAD27896.1）6 個物種功能已知的 Rop 蛋白序列。 利用Clustal X 和MEGA 5 軟件采用鄰接法方法對棉花GhRop4 和上述物種的Rop 蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹， 分支的可靠性評價采用靴帶分析。

1.2.5棉花GhRop4 基因的表達分析。利用多糖多酚植物總RNA 試劑盒提取棉花不同處理、不同時間點棉花RNA 和棉花不同組織的RNA，質(zhì)量檢測合格反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA 第一條鏈，以此鏈為模板進行熒光定量PCR 擴增， 擴增體系和反應(yīng)條件參照李月等[28]的方法。 內(nèi)參Ubiquitin7 基因引物序列為 UBQ7F：5′-CCAGAAGGAATCCACTTTGC-3′；UBQ7R：5′-CCAGCTCACATCAGCATACG-3′ 和GhRop4 基 因 的 引 物 序 列qGhRop4F：5′-GGTCTTCTGCCTACATCGAGT-3′；qGhRop4R：5′-GAAATGGGCACTGCGTTAGG-3′。 采用 2－△△CT法分析數(shù)據(jù)，確定基因的相對表達量。并利用DPS 7.05 軟件對定量數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 GhRop4基因的克隆與序列分析

以 KK1543 葉片 cDNA 為模板進行 PCR 擴增結(jié)果（圖1）表明，從陸地棉中克隆1 個Rop基因 cDNA 序列， 命名為GhRop4， 基因登陸號AY965614.1。GhRop4 基因的 ORF 為 588 bp，編碼195 個氨基酸，分子量為21.229 kD，理論等電點為8.81，為堿性蛋白。 利用DNAMAN 軟件與擬南芥、水稻、大麥3 個物種中5 個ROP 蛋白序列比對發(fā)現(xiàn)，GhRop4 蛋白符合植物Rop 蛋白的特征，含有5 個（Ⅰ-Ⅴ）效應(yīng)結(jié)構(gòu)區(qū)Ⅰ、Ⅲ是GTP酶結(jié)構(gòu)域，Ⅱ是效應(yīng)因子結(jié)構(gòu)域，Ⅳ、Ⅴ是GTP或GDP 的結(jié)合區(qū)域，2 個開關(guān)區(qū)域 （開關(guān)Ⅰ和開關(guān)Ⅱ），1 個Rop 插入序列及C 末端高度變異區(qū)（HVR）（圖 2）。Rop 插入序列包含 10 個氨基酸殘基（DQQFLTDHFN）。 GhRop4 蛋白 HVR 區(qū)的氨基酸序列C 末端為CSIL。

圖1 GhRop4 基因的克隆Fig.1 Cloning of GhRop4 gene

圖2 GhRop4 功能結(jié)構(gòu)域分析Fig.2 Analysis of the functional domains in GhRop4 protein

2.2 棉花GhRop4蛋白系統(tǒng)進化樹分析

Winge 等[7]根據(jù) Rop 蛋白 C 端氨基酸序列差異，將Rop 家族蛋白分為2 種類型，即Ⅰ型和Ⅱ型。從GenBank 中下載水稻、擬南芥、小麥、煙草、玉米、大麥中共19 個功能已知Rop 蛋白序列，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。 分析表明（圖 3），19 個 Rop 蛋白分為 2 類，12 個 Rop 蛋白聚為Ⅰ型 Rop 蛋白，7個Rop 蛋白聚為Ⅱ型 Rop 蛋白，GhRop4 蛋白屬于Ⅰ型Rop 蛋白。 研究表明，Ⅰ型Rop 蛋白主要參與調(diào)控植物生長發(fā)育、植物抗逆和抗病性反應(yīng)，推測屬于Ⅰ型Rop 蛋白的棉花GhRop4 蛋白在植物功能反應(yīng)中扮演多樣角色。 利用DNAMAN 軟件對這 6 個已克隆的GhRop基因（GhRacA、GhRacB、GhRac9、GhRac13、GhRac1、GhRop6）與本研究克隆的GhRop4 基因進一步比對分析，GhRop4 基因與GhRac1 基因的序列相似性達到88%， 與其它5 個GhRop基因的相似性均大于75%。

圖3 Rop 蛋白聚類分析及生物學(xué)功能分析Fig.3 Cluster analysis and function analysis of Rop proteins

2.3 GhRop4基因表達特征分析

高鹽（200 mol·L－1NaCl）、干旱、低溫和黃萎病菌逆境脅迫處理均影響GhRop4 基因的表達，但是不同脅迫處理下基因表達模式不同。 在高鹽處理下，GhRop4 基因在處理后3 h 的表達量最大， 處理后 1 h、6 h 和 12 h 的表達量均低于 0 h，其中在6 h 和12 h 的表達量較低（圖 4A）。 干旱處理下，GhRop4 基因的表達量呈字母M 型趨勢，在1 h 表達量升高，3 h 表達量降低，在 6 h 表達量急劇升高達到最大，隨后又降低（圖4B）。 低溫處理后，隨著脅迫處理時間的延長，GhRop4 基因表達量呈現(xiàn)逐漸下降趨勢， 在3 h 時表達量最低，在6 h 表達量又急劇增加，12 h 表達量又有所下降（圖4C）。 黃萎病菌侵染棉花后4 hGhRop4基因的表達量與0 h 表達量基本一致， 無顯著差異； 在侵染后8 hGhRop4 基因的表達量顯著增加，達到最大；處理后12 h 表達急劇降到最低；在24 h、48 h 基因表達量略微增加， 但仍明顯低于0 h（圖4D）。GhRop4 基因在不同組織中的表達分析結(jié)果表明，GhRop4 基因在檢測的根、莖、葉、子葉和下胚軸中均有表達，在子葉中表達最高，其次是莖、葉、根，在下胚軸中的表達量最低（圖4E），說明該基因的表達存在一定的組織特異性。

圖4 GhRop4 基因表達譜分析Fig.4 Expression pattern analysis of GhRop4

3 討論

棉花具有重要的經(jīng)濟和社會意義，對棉花的研究報道相對較多， 特別是在逆境脅迫反應(yīng)方面。 如棉花GhWRKY91 基因介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片衰老及對干旱脅迫的響應(yīng)[29]。 脫水素基因Gh_A05G1554 （GhDHN_03） 和 Gh_D05G1729（GhDHN_04） 介導(dǎo)植物耐受滲透脅迫和鹽脅迫影 響 的 能 力[30]。 棉 花GhHB12[31]、GhLAC15[32]、GbaNA1[33]基因參與棉花抗黃萎病調(diào)控目前克隆到參與棉花抗逆的相關(guān)基因及信號傳遞途徑主要涉及類受體蛋白、蛋白激酶、激素信號途徑、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控、生化代謝酶、防衛(wèi)基因合成等。 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在植物生長發(fā)育和環(huán)境適應(yīng)過程中扮演關(guān)鍵的調(diào)控作用。 在已報道的真核生物中，GTP 結(jié)合蛋白家族的Rho 家族蛋白是1 類信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的開關(guān)[34]。 目前棉花有6 個Rop基因的功能被報道， 其中 5 個基因GhRacA、GhRacB、GhRac9、GhRac13、GhRac1 功能研究集中在棉花纖維發(fā)育上[23-25]，1 個GhRop6 基因參與了棉花對黃萎病抗性的調(diào)控[26]。 本研究利用生物信息學(xué)、PCR 技術(shù)從陸地棉中克隆到 1 個Rop基因， 命名為GhRop4。本研究克隆的GhRop4 基因與上述6 個進行序列比對發(fā)現(xiàn)， 相似性70%～88%， 表明GhRop4 基因是新的未報道的Rop基因。 DNAMAN 多重序列比對結(jié)果表明， 和已報道的Rop蛋白一樣，含有 5 個（Ⅰ-Ⅴ）效應(yīng)結(jié)構(gòu)區(qū)，2 個開關(guān)區(qū)域，1 個Rop 插入序列及C 末端高度變異區(qū)（HVR），符合植物 Rop 蛋白的特征。

聚類分析中的7 個Ⅱ型Rop 蛋白除了At-Rop11 參與生長發(fā)育調(diào)控，其余6 個Rop 蛋白正調(diào)控或負調(diào)控植物抗病反應(yīng)。Ⅰ型Rop 蛋白參與調(diào)控植物生長發(fā)育、抗逆反應(yīng)和抗病性；聚類分析結(jié)果表明，GhRop4 蛋白屬于Ⅰ型Rop 蛋白。與棉花GhRop4 蛋白聚類在同一亞組的AtRop1 和AtRop5 正調(diào)控植物的抗逆性[35]，AtRop6 在這一過程發(fā)揮負調(diào)控作用[12]。 HvRacB、OsRac1、Os-Rac5 和NtRac5 參與植物對病原菌的入侵響應(yīng)過程[19-20,22]。一般認為蛋白質(zhì)具有相似的結(jié)構(gòu)域可能具有相似的生物學(xué)功能，GhRop4 蛋白與上述蛋白聚為一類， 與它們的相似性均在80%以上，與OsRac5 和NtRac5 蛋白的相似性高達88%和90%， 推測GhRop4 蛋白可能在棉花抗逆性和抗病性反應(yīng)中具有相似的功能。 因此本研究分析了GhRop4 基因在高鹽、干旱、低溫處理和黃萎病菌侵染后基因的表達情況，結(jié)果表明GhRop4 基因在鹽和低溫處理下，基因整體上呈現(xiàn)先下調(diào)再上調(diào)后有下調(diào)的趨勢， 干旱和黃萎病菌處理后，基因呈現(xiàn)先升高后下降的表達趨勢。 在這4 種逆境脅迫處理中GhRop4 基因的表達受干旱調(diào)控的程度最強，其次是黃萎病菌。 推測GhRop4 基因更多地參與了棉花對干旱的適應(yīng)反應(yīng)過程，對黃萎病菌的響應(yīng)也顯示出該基因在棉花抗黃萎病反應(yīng)中也發(fā)揮作用。 上述結(jié)果暗示在后續(xù)的研究中應(yīng)該更多地關(guān)注GhRop4 基因在棉花抗旱和抗黃萎病中的功能。 組織特異性分析表明，GhRop4 基因在棉花幼苗根、莖、葉、子葉和下胚軸中均有表達，與GhRac13[24]、GhRac1[25]、GhRop6[26]基因在檢測的所有組織中均有表達的結(jié)果一致，但是存在一定的組織特異性，GhRop4 在子葉中的表達量較高，其余3 個已報道的Rop基因主要在棉花纖維中表達， 以上結(jié)果表明棉花GhRop基因在不同的組織中廣泛地發(fā)揮著重要的調(diào)控功能。 本研究為進一步深入研究GhRop4 基因提供了重要的功能線索， 也首次揭示GhRop基因在抗旱中的功能。

4 結(jié)論

本文以陸地棉cDNA 為模板克隆到1 個小GTP 結(jié)合蛋白， 其開放閱讀框為 588 bp， 編碼195 個氨基酸， 包含 5 個效應(yīng)結(jié)構(gòu)區(qū)、2 個開關(guān)域、1 個Rop 插入序列及C 末端高度變異區(qū)，屬于Ⅰ型Rop 蛋白，命名為GhRop4。組織表達分析表明，GhRop4 基因在棉花幼苗根、莖、葉、子葉和下胚軸中均有表達， 且在子葉中表達水平較高。同時，GhRop4 基因響應(yīng)高鹽、干旱、低溫和棉花黃萎病菌等逆境脅迫。 本試驗結(jié)果對開展棉花耐逆機制研究有重要意義。